流式细胞仪检测外周血树突状细胞Word编辑

1、传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析cd123+（抗il-3受体a链）和cd11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（dc）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向t淋巴细胞呈递。其它抗原呈递细胞也有此功能，如b淋巴细胞和单核细胞。但是，与其它细胞不同的是，dc细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女t细胞（naive t cell）。dc细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的dc细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。由于血液和组织中dc细胞含量少，且缺乏特异的dc标记物，所以dc细胞的研究非常困难。因此，关于

2、dc细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的dc细胞的研究。这些过程利用了dc细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。但是，这些方法中dc细胞的产率和纯度较低，且费时费力。而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做dc细胞含量的定量分析。最近的报告发现在活化dc细胞和血液或淋巴细胞分离培养的dc细胞表面cd83和cmrf-44高表达。cd83和cmrf-44可以作为dc细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。在对新鲜分离的dc细胞的研究中，发现il-3ra在淋巴器

3、官的dc细胞上有特异表达。从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类dc细胞。il-3ra（cd123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将cd123+ dc细胞进行200倍富集。cd123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外t细胞富集区的cd123+ dc。在外周血中也有cd123+ dc细胞，与以前所说的cd11c- dc细胞和cd33dimcd14-cd16- dc细胞是同一类细胞。由于缺乏dc特异性标记物，目前仍然不清楚dc是否是自成一系的一类细胞。dc细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的cd34+干祖细胞经gm-csf

4、和tnf-a培养得到。使用cd123抗体，发现有一群cd34+ dc样幼稚细胞。这群细胞与cd34+干祖细胞的区别是可以发育成langerhan细胞样dc。因此，根据cd123强染，可以识别出一类人类dc细胞，它是不同组织间dc细胞的连接桥梁。传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！在外周淋巴组织中还发现另一个dc亚群，与cd123+ dc不同的是，其表型为cd11c+hla-dr+lindim/-。与cd123+ dc相反，这群dc细胞位于生发中心。在血中也含有cd11c+hla-dr+lindim/- dc细胞，与cd33brightcd14dimcd16- dc细胞是同一类

5、细胞。由此可见，dc系统由多种细胞类型构成，发育途径不一。但是，目前对这些细胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理条件下如何受调控等方面仍缺乏了解。cd123+ dc和cd11c+ dc细胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它们可能有不同的功能。近年来的研究主要集中在使用dc细胞进行抗肿瘤和抗感染治疗方面。不同报道证实，这有可能抑制肿瘤生长。使用这些新的dc标记物建立起来的检测系统，可以帮助对新鲜外周血新鲜中的两类不同的dc细胞进行定量检测，同时可以加以分离。实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快，样本用量少，可以用来辅助研究在病理和生理条件下，dc在免疫调控中作用。检测原

6、理和用具检测原理：本实验目的是从外周血中检测两种类型的dc细胞：cd123+ dc（anti-il-3ra+）和cd11c+ dc。cd11c和cd123并不是dc特异的标志物。两类细胞均hla-dr高表达，单核细胞、淋巴细胞和nk细胞的系列标记物弱表达。因此使用单一荧光标记的lin cocktail（lin1）抗体将dc细胞区分出来。lin1抗体包括cd3、cd14、cd16、cd19、cd20和cd56。另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞。嗜碱粒细胞的表型是：lin1-cd123+hla-dr-。使用hla-dr可以区分嗜碱粒细胞和cd123+ dc细胞。细胞来源：样本使用edta、acd或

7、肝素钠抗凝全血，或分离的外周血单个核细胞（pbmc）。样本采集后24小时内检测。试剂：1. 检测dc细胞用的bdis荧光标记的单克隆抗体。传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！四色分析：lin1 fitc：货号340546，含有cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56cd123 pe（anti-il-3ra）：货号340545anti-hla-dr percp：货号347364cd11c apc：货号340544mouse igg1 pe：货号349043mouse igg2a apc：货号340473三色分析：lin1 fitc：货号340546，含有cd3、

8、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56cd123 pe（anti-il-3ra）：货号340545cd11c pe：货号347637anti-hla-dr percp：货号347364mouse igg1 pe：货号349043mouse igg2a pe：货号3490532. facs lysing solution（10x）：facs溶血素，货号349202，用去离子水1：10稀释3. 洗液：pbs缓冲液4. 1x pbs配制的1%多聚甲醛设备用具：1. edta、acd或肝素钠真空采血管2. 12´75mm falcon试管3. 振荡混匀器4. facs流式细胞仪5.

9、 离心机6. 微量加样器全血样本荧光抗体染色步骤：1. 按照下表在各管中加入适量抗体；传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！fitcpepercpapc4-color 四色分析tube 1tube 2lin1 20ullin1 20ulcd123 5u（全血） 10ul（pbmc）mouse igg1anti-hla-dr 10ulanti-hla-dr 10ulcd11c 5ulmouse igg2a3-color 三色分析tube 1tube 2tube 3tube 4lin1 20ullin1 20ullin1 20ullin1 20ulcd123 5ul（全血） 10u

10、l（pbmc）mouse igg1cd11c 5ulmouse igg2aanti-hla-dr 10ulanti-hla-dr 10ulanti-hla-dr 10ulanti-hla-dr 10ul2. 每管加入100ul全血，振荡混匀，室温暗处反应15分钟；3. 加入2ml facs溶血剂，振荡混匀，室温暗处放置10分钟；4. 300xg离心5分钟，弃上清；5. 振荡混匀，加入1ml洗液；6. 300xg离心5分钟，弃上清；7. 振荡混匀，加入300ul 1%多聚甲醛；8. 2-8°c暗处保存，24小时内上机分析pbmc样本荧光抗体染色步骤：1. 按照上表在各管中加入适量抗体；

11、2. 每管加入50ul全血，振荡混匀，暗处冰浴反应25分钟；3. 轻轻混匀，加入1ml洗液；4. 300xg离心5分钟，弃上清；5. 轻轻混匀，加入300ul 1%多聚甲醛；6. 2-8°c暗处保存，24小时内上机分析数据获取：1. 使用calibrite微球，做facscomp，调整pmt电压和荧光补偿，检查仪器灵敏度；传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！2. 上样：使用cellquest软件，获取50,000个细胞，用fsc设阈值，排除碎片干扰；3. 使用cellquest软件分析结果数据分析：1. 区分细胞和碎片：使用fsc/ssc点图，画r1，排除碎片和死细

12、胞；2. 找到lin1弱阳性和阴性群体：使用anti-hla-dr/lin1点图（g1=r1），画r2，圈定lin1弱阳性和阴性细胞；传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！3. 区分外周血dc和嗜碱粒细胞：传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！在四色分析中，管1区分dc细胞和嗜碱粒细胞，管2是同型对照。在三色分析中，管1和管3区分dc细胞和嗜碱粒细胞，管2和管4是同型对照。使用同型对照区分非特异染色在gate list中定义g3=r1 and r2。使用anti-hla-dr/cd123点图和anti-hla-dr/cd11c点图（g3=r1 and r2），图

13、中只显示lin1弱阳性和阴性细胞。画r3，圈定嗜碱粒细胞（anti-hla-dr-/cd123+）；画r4，圈定cd123+ dc细胞（anti-hla-dr+/cd123+）；画r5，圈定cd11c+细胞（anti-hla-dr+/cd11c+）；4. 在gate list中定义各门：g4（嗜碱粒细胞）=r1 and r2 and r3，g5（cd123+ dc）=r1 and r2 and r4，g6（cd11c+ dc）=r1 and r2 and r5，g7=r1 and r2 and（r3 or r4 or r5）；传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！5. 确认细胞群的准确性：下图显示了四色分析全血样本时的cd123+ dc、cd11c+ dc和嗜碱粒细胞各群的位置。6. 分析各群细胞的百分含量：点击anti-hla-dr/lin1（g1=r1）点图，做统计，得到各群细胞所占比例· cd123+ dc%r1 and r2 and r4传播优秀word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！· cd11c+ dc%r1 and r2 and r5· 嗜碱粒细胞%r1 and