狂犬病病毒简介及致病机理

1、课 程： 分子免疫学 题 目：狂犬病病毒简介及致病机理学 院： 生命科学学院 姓 名： 朴佳芳 学 号： 2016226012 2016年 11月25日狂犬病病毒简介及致病机理摘要 狂犬病又称恐水症，为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命为一种古老的侵害中枢神经系统、可引起严重脑脊髓炎的烈性人畜传染病，一旦发病，病死率几乎为100。我国是狂犬病高发国家，每年的狂犬病病例数仅次于印度，居世界第二位。狂犬病由狂犬病病毒属病毒引起，其中作为代表种的RV

2、是引起狂犬病的主要病因。近年来，随着分子生物学的发展和研究手段的进步，人们对于Rv的结构、基因功能等有了深入的认识，为狂犬病疫苗的研制和改造积累了丰富的资料和理论依据。本文结合狂犬病和Rv最新的研究进展，对糖蛋白、细胞凋亡、感染与免疫、复制和转录等致病机理及Rv及宿主细胞对病毒感染应答方面等方面作一综述。关键词：狂犬病 狂犬病毒 致病性 感染Abstract Rabies, also known as fear of water, for the rabies virus caused by a zoonotic acute infection of the central nervous s

3、ystem. More common in dogs, wolves, cats and other carnivores. Many people infected by the disease beast bites. Clinical manifestations of the unique manic, fear of fear, fear of the wind fear of water, salivation and pharyngeal muscle cramps, and finally paralyzed and endanger life as an ancient vi

4、olation of the central nervous system, can cause severe encephalomyelitis of violent human and animal infectious diseases, Once the disease, the mortality rate is almost 100%.China is a high incidence of rabies countries, the number of rabies cases each year after India, ranking second in the world.

5、 Rabies is caused by a rabies virus, in which RV as a representative species is the main cause of rabies. In recent years, with the development of molecular biology and the progress of research methods, people have a deep understanding of the structure and gene function of Rv, and accumulated rich d

6、ata and theoretical basis for the development and transformation of rabies vaccine. In this paper, we reviewed the recent advances in rabies and Rv, and reviewed the pathogenesis of Rv and host cells, such as glycoprotein, apoptosis, infection and immunity, replication and transcription, and the res

7、ponse to virus infection.Keywords: Rabies Rabies virus Pathogenic Infection目 录摘要1一、狂犬病病毒的介绍和分类3二、狂犬病毒的特征和传染情况4（一） 传染源5（二） 传播途径5（三） 传播对象5三、狂犬病病毒致病机理6（一）糖蛋白6（二）细胞凋亡7（三）感染与免疫病毒的复制7（四）复制和转录8参考文献89狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和

8、咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命为一种古老的侵害中枢神经系统、可引起严重脑脊髓炎的烈性人畜传染病，一旦发病，病死率几乎为100。几乎所有温血动物均可以感染狂犬病病毒(Rabiesvinls，Rv)，其中包括人等多种哺乳动物。狂犬病由狂犬病病毒属病毒引起，其中作为代表种的RV是引起狂犬病的主要病因1。近年来，随着分子生物学的发展和研究手段的进步，人们对于Rv的结构、基因功能等有了深入的认识2，为狂犬病疫苗的研制和改造积累了丰富的资料和理论依据。一、狂犬病病毒的介绍和分类狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，

9、并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体2。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。Rv属于弹状病毒科(Rhabdovridae)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)的代表种。Rv属于负链RNA病毒，其基因组为不分节段的单股负链RNA，约为12000 m。病毒粒子呈子弹状，一端呈平坦或略凹状，另一端呈半圆形。病毒粒子直径约为75nm、长为100 nm300 nm。（图1）RV基因

10、组从3到5端依次编码5种结构蛋白基因，分别为核蛋白基因(Nucleoprotein，N)、磷蛋白基因(Phosphoprotein，P)、基质蛋白基因(Matrix protein，M)、糖蛋白基因(G1ycoprotein，G)和依赖RNA的RNA聚合酶基因(Large protein，L)，分别被2、5、5和423个非编码核苷酸序列隔开。这5种结构蛋白基因在基因组中的排列方式在整个弹状病毒科家族的病毒中都是保守的。在RV基因组的两端，存在一个50 nt100 nt的3先导RNA序列(Leader）和5尾部序列(Trailer)，其中含有基因转录和基因组复制的调控信号。Rv粒子的核心是由基因

11、组RNA、N、P和L蛋白组成的核糖核酸蛋白体(Ribonucleoprotein，RNP)复合物。RNP是负责病毒基因转录和基因组复制的功能单位，呈子弹状，为右手螺旋结构，每螺旋大约为7.5 nm，大小为165 nm×60 nm，完全舒展时长4.2 nm4.6 nm。病毒粒子的外被是一层紧密而完整的脂蛋白双层囊膜，厚度约为7.5 nm10 nm，为病毒粒子出芽时从细胞质膜处获得。在病毒囊膜表而为G蛋白三聚体组成的长为8.3 nm10 nm的突出结构(spike)，参与病毒与宿主之间的相互作用以及决定Rv的免疫原性和致病力。病毒囊膜和RNP之间由M蛋白连接，M蛋白在调控病毒复制、病毒装

12、配和出芽过程中发挥关键作用2。 图1 狂犬病病毒结构最初，根据血清学的方法，可以将狂犬病病毒属分为 4个血清型和几个尚待定的病毒株。血清型是经典的Rv，为地理分布最广、流行性最大的一类；血清型为Lagos蝙蝠病毒，最早分离自尼日利亚的蝙蝠脑；血清 型为Mokola病毒，最早分离自尼日利亚的地鼠；血清型为Duvellllage病毒，首次在南非病人中分离。随着分子生物学的发展，DNA测序技术被越来越多地用于狂犬病病毒属的分类。Bourhy等根据N蛋白基因N端500 nt核苷酸序列的保守性，可以将狂犬病病毒属分为7种基因型(Genotype)：基囚型与血清型吻合3。基因型和1分别为欧洲蝙蝠狂犬病毒1

13、(EumpeaIlbat lyssavims 1)和欧洲蝙蝠狂犬病毒2(European bat lyssavims 2)；而在澳大利亚果蝠体内发现的澳大利亚蝙蝠狂犬病毒(Australia bat virus)被定为基因型。Badrane 等根据G蛋白膜外区氨基酸的同源性分析，进一步将狂犬病病毒属的7种基因型病毒株分为两个遗传谱系(Phylogroup)，分别为Phylogroup 和Phylogroup 。Phylogroup 包括基因型、和；Phylogroup 包括基因型、。序列分析表明，G蛋白膜外区氨基酸同源性在同一遗传谱系的病毒株中大于74而在不同遗传谱系间的病毒株中小于644。二

14、、狂犬病毒的特征和传染情况狂犬病病毒为嗜神经病毒，其传播是通过快速突触转送发生的。(1)向心性扩散：病毒从入侵部位，通过神经肌接头或神经感受器侵入外周神经，再沿脊髓到达中枢神经，导致脑脊髓炎；(2)离心性扩散：病毒从中枢神经向周围神经系统，特别是高度受神经所支配的器官扩散，如唾液腺，病毒在唾液腺内大量增殖并可经唾液排出体外，最终导致全身神经系统的衰竭和死亡1。 狂犬病毒易被紫外线、甲醛、5070%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经563060分钟或1002分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年5。狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，

15、发病率明显下降6。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。（表1） 表1 2014年18月全国狂犬病死亡统计表（1） 传染源 发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占8090%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源7。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性8。（2） 传播途径 主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。（3）

16、 传播对象 人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约46日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经

17、核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死9。病理变化主要为急性弥漫性脑脊髓炎，脑膜多正常。脑实质和脊髓充血、水肿及微小出血。脊髓病变以下段较明显，是因病毒沿受伤部位转入神经，经背根节、脊髓入脑，故咬伤部位相应的背根节、脊髓段病变常很严重。延髓、海马、脑桥、小脑等处受损也较显著。多数病例在肿胀或变性的神经细胞浆中，可见到1至数个圆形或卵圆形、直径约310m的嗜酸性包涵体，即内基小体（Negribody）9。常见于海马及小脑浦顷

18、野组织的神经细胞中，偶亦见于大脑皮层的锥体细胞层、脊髓神经细胞、后角神经节、交感神经节等。内基小体为病毒集落，是本病特异且具有诊断价值的病变，但约20%的患者为阴性。此外，唾液腺腺泡细胞、胃粘膜壁细胞、胰腺腺泡和上皮、肾上管上皮、肾上腺髓质细胞等可呈急性变性。三、狂犬病病毒致病机理（一）糖蛋白糖蛋白(Glycoprotein，G蛋白)与RV的感染与免疫有密切关系，是唯一能够诱导机体产生病毒中和抗体的蛋白，其免疫作用与全病毒疫苗相当。其膜外区决定RVG蛋白的抗原性、组织亲嗜性及毒力，是有效的保护性抗原，能够诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫，并且G蛋白是RV具有神经致病性的决定簇，因为G蛋白的一些结

19、构可使病毒有效地结合细胞受体10。神经细胞对RV的特异受体如p75神经调理受体(p75 Neurotrophinreceptor，p75NTR)、神经细胞支持分子(Neuronal ceIl adhesion moIecular，NCAM)或烟碱酸型乙 酰胆碱受体(Nicotinicac etylcholine recteptor，NAChR)，可以结合Rv和/或使RV更容易进入细胞。病毒与受体结合后，病毒释放RNP进入细胞质。RV在细胞内吞作用后，RV 与细胞膜的融合作用是一种pH依赖形式。在G蛋白最主要的抗原区G的333位氨基酸存在一突变体，可减慢病毒在细胞中的传播速度。该突变体几乎存在于

20、所有RV中，但并不会使病毒成为减毒株。EtesSami等(2000年)进行细胞培养发现G基因不能消除RV的传播，并证实了G蛋白在Rv感染和发病过程中起着重要作用10。Faber M等通过克隆Rv银头蝙蝠分离株18的全长cDNA，并将高致病性Rv毒株的蛋白基因编码和基因序列与弱毒株的进行交换，结果发现RV不能识别wT SHBRV-18。除了G蛋白在Rv从外周神经侵袭中枢神经系统(Central nervous system，CNS)过程中起主要作用外，尾序列、L基因及假基因，在Rv的致病机理中都有着重要作用。其中，P蛋白决定着Rv在轴突中的逆行传导。Rv侵袭引起致命性神经疾病的致病机理仍不是十分

21、清楚，但是导致RV感染致死的关键步骤是因强烈抑制维持神经功能所需蛋白的合成，从而导致神经紊乱2。（二）细胞凋亡虽然Rv具有神经致病性的必备条件是神经的特异受体可以结合Rv的G蛋白，但不能据此而否认其它因素的作用。细胞膜的其它成分，如神经节苷脂，可能也参与RV进入细胞的过程11。但尚不清楚这些分子在体内的情况。一个增强RV致病性的特殊因素是避免细胞凋亡。在病毒感染过程中，因细胞凋亡而引起的感染细胞破坏可以认为是细胞限制病毒繁殖的一种本能反应。细胞凋亡或由感染细胞自身作用，或由T细胞的细胞毒素作用而发生，通过触发病毒感染细胞分泌细胞活素如TNFa而诱导细胞凋亡。然而，病毒以发展抗细胞凋亡的方式或者

22、以逃避T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和NK细胞的侵袭的途径，使得Rv在体内的分布更加容易。细胞凋亡诱导潜力与RV病毒毒力减弱有相关性，呈负相关。主要感染细胞或细胞内传导机制(包括病毒通过神经轴突的远距离传导)的破坏，可以防止cNS的感染。实验条件下对神经细胞凋亡进行体内和体外观察，不能解释自然毒株对神经细胞凋亡的关联性。Rv中至少有两种蛋白(G蛋白和M蛋白)可以诱导细胞凋亡。仅仅只需再插人一个RV G蛋白基因拷贝，就足以诱导细胞凋亡。虽然神经致病性RV中和细胞凋亡诱导的准确机制尚不清楚，但知道神经致病性RV毒株是通过干扰促细胞凋亡因子和保持病毒基因表达水平高

23、于起始水平来避免细胞凋亡，从而确保了神经的完整性，这在病毒传播中是极其关键的。在RV侵袭成神经细胞瘤细胞早期，激活删L一依赖路径，包括半胱天冬酶一8及nwL受体与TRAIL间的相互作用12。病毒脱壳和复制是起动细胞凋亡的必要步骤，感染的质粒中M蛋白表达能诱导相似事件发生，这表明在TRAIL一调停细胞凋亡早期诱导中M蛋白起重要的作用。然而到目前为止，还没有实验证明PDLC 1相互作用对细胞凋亡调节能产生影响。（三）感染与免疫病毒的复制 与其他病毒一样，RV侵入宿主细胞也会引起宿主细胞产生一系列的免疫应答反应，在进化的过程中，病毒也相应进化出一些躲避或者抑制宿主细胞免疫应答的机制，从而可以建立有效

24、感染13。宿主细胞免疫应答包括先天性免疫反应和特异性免疫反应两个方面。先天性免疫反应是抵御病毒侵染的第一道防线，主要通过激活一些模式识别受体如Tut等，产生类型干扰素(Intemron，IFN)，包括IFN和IFN等例。Rv在细胞内和细胞外均可以诱导先天性免疫反应，包括通过视黄酸诱导基因(Retinoic acid inducible gene )介导的类型 IFN的激活。研究发现，IFN的表达可以极大降低RV的致病性和病毒复制，表明IFN参与宿主防御病毒感染。RV磷蛋白P可以阻断TANK结合蛋白激酶1磷酸化IFN调节因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)，从而抑制

25、类型IFN应答例。此外，P蛋白也可以抑制类型和类型 IFN信号转导通路，通过与IFN信号转导通路中重要下游底物sTATl转录因子的结合，使其滞留在细胞质中，从而使sTATl不能入核激活基因表达，阻断IFN信号转导通路，但P蛋白不影响sTATl的磷酸化，也不会造成其降解。此外，有研究表明，只有发生酪氨酸磷酸化的sTATl和sTAT2才能被P蛋白结合，暗示只有当吲信号通路被激活后，P蛋白才与sTATl和sTAT2结合。进一步的研究表明，在RV感染的细胞内，会产生5种类型的P蛋白，不仅有全长的P蛋白P1，还可以通过内部起始翻译的方式产生另外4种截短型的P蛋白，分别为P2P526。研究发现，不同P蛋白

26、在细胞内的定位是通过入核信号序列和核输出信号序列调节的，序列分析表明，所有的P蛋白均含有一个入核信号，位于蛋白的羧基末端，但P3P5缺少位于氨基末端的核输出信号，该信号仅存在丁P1和P2蛋白中，从而造成P1和P2主要分布在细胞质中，而P3P5主要定位在细胞核内。因此，P蛋白不但可以通过阻断sTATl入核，而且可以在细胞核内阻断IFN激活的生长因子3(IsGF3)与IFN激活应答元件结合。此外，核内的P蛋白也可以直接与sTATl同源二聚体结合，阻断其余活化序列(一activated sequence，GAs)的结合鲫。同时，有研究表明P3也可以促进sTATl与微管相互作用，从而抑制sTATl的入

27、核。最后，有研究指出，P蛋白也会引起IFN诱导的人早幼白血病(Promyelocytic leukaemia，PML)蛋白滞留在细胞质中。PML是PML核体组分，可能在细胞核蛋白分选、病毒防御和凋亡过程中发挥重要作用2。尽管目前还不清楚PML在RV感染中的作用，但考虑到P蛋白可以结合并保持PML在细胞质，推测PML可能具有抗病毒的功能。（四）复制和转录Rv基因组中存在两个抑制病毒复制的核苷酸序列，分别位于N基因和P基因。采用细胞培养的方法，应用ELISA和荧光免疫检验法分别检测细胞表面RV G蛋白的表达及细胞内RV N蛋白的表达，来检测RV复制的抑制现象。对RV复制的抑制情况进行研究有助于研制

28、抗病毒化合物从而对狂犬病进行有效的治疗。该方法还可以用于任何病毒，尤其是溶解宿主细胞的病毒。 能否更清楚地了解RV感染cNs及随后传播给其它组织取决于病毒远距离传播机制的完整性。病毒在体内向cNs传播的速度是50100 mm/d。病毒传播可能是下调Rv基因转录的一种方式；Rv M蛋白是下调转录的另一方式。当缺少M蛋白或低水平M蛋白时，Rv RNA则反常合成，表明M蛋白在RNA合成中起调整作用。也就是说，M蛋白下调转录酶的活性，同时支持RNP的复制。此外，M蛋白中的氨基酸在RNA合成调节中起着至关重要的作用；在整个病毒基因转录高度增加时，可以产生高转录(HIT)突变Rv。随着HIT突变体病毒基因

29、表达的增加，在感染的细胞培养中可以看到细胞病变，然而WT病毒感染不能破坏宿主细胞。Rv的碱性RNA合成受M蛋白调节可能是一个重要的病毒致病性因素13。参考文献1.唐丹丹; 朱骏; 曹向英; 孙文梅, 狂犬病研究进展. 畜牧兽医科技信息 2014, (11), 4-6.2.鞠美芳; 殷相平; 焦文强; 柳纪省, 狂犬病病毒分子生物学研究进展. 中国畜牧兽医 2012, 39 (2), 159-163.3.Hampson, K.; Coudeville, L.; Lembo, T.; Sambo, M.; Kieffer, A.; Attlan, M.; Barrat, J.; Blanton,

30、J. D.; Briggs, D. J.; Cleaveland, S.; Costa, P.; Freuling, C. M.; Hiby, E.; Knopf, L.; Leanes, F.; Meslin, F. X.; Metlin, A.; Miranda, M. E.; Muller, T.; Nel, L. H.; Recuenco, S.; Rupprecht, C. E.; Schumacher, C.; Taylor, L.; Vigilato, M. A.; Zinsstag, J.; Dushoff, J.; Global Alliance for Rabies Con

31、trol Partners for Rabies, P., Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS neglected tropical diseases 2015, 9 (4), e0003709.4.Hampson, K.; Coudeville, L.; Lembo, T.; Sambo, M.; Kieffer, A.; Attlan, M.; Barrat, J.; Blanton, J. D.; Briggs, D. J.; Cleaveland, S.; Costa, P.; Freuling, C.

32、 M.; Hiby, E.; Knopf, L.; Leanes, F.; Meslin, F. X.; Metlin, A.; Miranda, M. E.; Muller, T.; Nel, L. H.; Recuenco, S.; Rupprecht, C. E.; Schumacher, C.; Taylor, L.; Antonio, M.; Vigilato, N.; Zinsstag, J.; Dushoff, J.; Global Alliance for Rabies Control Partners for Rabies, P., Correction: Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS neglected tropical diseases 2015, 9 (5), e0003786.5.Yousaf, M. Z.; Qasim, M.; Zia, S.; Khan, M.; Ashfaq, U. A.; Khan, S., Rabies molecular virology, diagnosis, prevention and treatment. Virology j