微生物生产抗生素

1、资料收集：PPT制作：PPT演讲：微生物生产抗生素类药微生物生产抗生素目录目录F红霉素红霉素的发酵生产的发酵生产D抗生素的提纯抗生素的提纯B抗生素的生物来源抗生素的生物来源E青霉素的发酵工艺青霉素的发酵工艺C抗生素产生菌的选育抗生素产生菌的选育A抗生素定义抗生素定义微生物生产抗生素一. 抗生素定义传统的定义：传统的定义：抗生素（抗生素（antibioticantibiotic）是微生物细胞）是微生物细胞产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化学物质。学物质。 现代定义：现代定义：抗生素是生物细胞（包括某些微生物抗生素是生物细胞（包括某些微生物植物和动

2、物）产生的能以低浓度抑制其他生物细植物和动物）产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质。胞生长或功能的化学物质。 微生物生产抗生素概概 述述 ，它不，它不但可以抑制其他微生物的发育与代谢，有的还可以抑制癌但可以抑制其他微生物的发育与代谢，有的还可以抑制癌的发育与代谢，及具有抗血纤维蛋白溶酶作用。的发育与代谢，及具有抗血纤维蛋白溶酶作用。 ，也是制药工业中利润，也是制药工业中利润最高的产品。世界各国由发酵法生产的抗生素约最高的产品。世界各国由发酵法生产的抗生素约400400种，种，广泛应用的仅广泛应用的仅120120种，其他主要是毒性大、成本高，无商种，其他主要是毒性大、成本高，无商

3、业应用价值。业应用价值。 ，世界，世界产量超过产量超过3500035000吨，不但在经济上占有重要位置，且为人吨，不但在经济上占有重要位置，且为人类健康作了出巨大贡献。类健康作了出巨大贡献。 微生物生产抗生素概概 述述n第二次世界大战期间 ,英美科学家在早年 Fleming发现青霉素的基础上 ,共同进行了青霉素的开发 ,用紫外光照射处理低产菌种 ,提高其产青霉素的能力 ,采用玉米浆作为培养基的氮源 ,从而成功地开始了青霉素的工业生产 ,并建立了深层发酵技术 ,这是发酵工业的一次革命 ,成为抗生素生产的开端。n抗生素的工业化生产主要是利用微生物发酵法，极少数抗生素如磷霉素可用法学法生产。此外还用

4、天然产生的抗生素进行化学结构改造，制造各种衍生物。微生物生产抗生素二、抗生素的生物来源 微生物生产抗生素微生物产生抗生素1 1、放线菌产生的抗生素：、放线菌产生的抗生素：链霉菌属：放线菌素、链霉素等。链霉菌属：放线菌素、链霉素等。小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基环醇类）环醇类）诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素放线菌中以链霉菌属产生的抗生素最多，诺卡菌属较放线菌中以链霉菌属产生的抗生素最多，诺卡菌属较少。少。微生物生产抗生素2 2、细菌产生抗生素、细菌产生抗生素芽孢杆菌属：多粘芽孢

5、杆菌和枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。3 3、真菌产生抗生素、真菌产生抗生素青霉属：青霉素、灰黄霉素。青霉属：青霉素、灰黄霉素。头孢菌属：头孢菌属： 头孢霉素头孢霉素微生物生产抗生素其他生物（动植物）产生抗生素n植物产生的抗生素，如地衣和藻类植物产生的地衣酸和绿藻酸，从被子植物如蒜和番茄等植物的组织或果实中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如银杏、红杉等也能产生抗生物质。n动物的多种组织能产生溶菌酶或一些抗生素，如从动物的心、肺、脾、肾、眼

6、泪、涎水中可提取出色素，有抗菌及抗病毒等作用。微生物生产抗生素三、抗生素产生菌的选育三、抗生素产生菌的选育 1 1、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离 2 2、抗菌性试验、抗菌性试验 3 3、抗生素产生菌的改良、抗生素产生菌的改良 1) 1)人工诱变人工诱变 2) 2)原生质体融合原生质体融合 3)3)体外体外DNADNA重组重组微生物生产抗生素体外体外DNA重组重组 微生物生产抗生素四、抗生素的提纯 微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养基的固有成分，这些成分的存在影响

7、抗生素的使基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。须经过精制。微生物生产抗生素抗生素提纯的基本步骤和原则抗生素提纯的基本步骤和原则3 3个基本步骤：个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制4 4个原则：个原则：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适宜，宜，pHpH适度，温度适宜；防止杂菌污染。适度，温度适宜；防止杂菌污染。提取方法：提取方法： 吸附、萃取、离子交换、沉淀、色谱分离、分子吸附、萃取、离子交换、沉淀、色谱分离、分子筛

8、过滤、透析等。筛过滤、透析等。抗生素的提纯抗生素的提纯微生物生产抗生素五、青霉素的发酵工艺微生物生产抗生素1、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性n作用机制：作用机制：抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生溶解而死亡。溶解而死亡。n抗菌谱：抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性细菌。细菌。n稳定性：稳定性：

9、弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳定，定，pH5-7pH5-7，6 6最稳定。最稳定。微生物生产抗生素2、菌种n青霉素作为第一个具有临床应用价值的抗生素，青霉素作为第一个具有临床应用价值的抗生素，19281928年被发现，年被发现，19431943年在美国被首次实现工业生年在美国被首次实现工业生产。产。n最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，生产能力很低，生产能力很低，发酵单位发酵单位2U/mL2U/mL，不能满足工业生不能满足工业生产要求，所以被淘汰。现在主要采用的是产要求，所以被淘汰。现在主要采

10、用的是产黄青产黄青霉菌霉菌，目前国际上青霉素生产最高发酵单位目前国际上青霉素生产最高发酵单位80000-90000U/mL.80000-90000U/mL.微生物生产抗生素2、菌种n生产菌种按其在深层培养生产菌种按其在深层培养中菌丝形态分为：丝状菌中菌丝形态分为：丝状菌和球状菌；根据丝状菌产和球状菌；根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌。子丝状菌和绿孢子丝状菌。常用菌种为常用菌种为绿孢子丝状菌，绿孢子丝状菌，如产黄青霉菌如产黄青霉菌。n为了提高产黄青霉菌的青霉素产量，使用诱为了提高产黄青霉菌的青霉素产量，使用诱变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、

11、变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、亚硝酸、X射线等。射线等。微生物生产抗生素3、当前青霉素的生产工艺流程 一般而言，青霉素的生产工艺流程需要有一般而言，青霉素的生产工艺流程需要有四个环节四个环节 。 第一个环节是通过培养基配制、蒸汽灭菌等工艺手段将原第一个环节是通过培养基配制、蒸汽灭菌等工艺手段将原料加工为料加工为一级种子罐一级种子罐。与此同时，还要将青霉素菌、。与此同时，还要将青霉素菌、 斜面母瓶、米孢子等经过相应处理后加入到一级种子罐中。斜面母瓶、米孢子等经过相应处理后加入到一级种子罐中。 第二个环节是利用培养基配制和蒸汽灭菌等处理手段将原第二个环节是利用培养基配制和蒸汽灭

12、菌等处理手段将原料培养成料培养成二级种子罐二级种子罐。第三个环节是在第二个环节的基。第三个环节是在第二个环节的基础上加上发酵罐的处理，形成础上加上发酵罐的处理，形成发酵液发酵液。最后一个环节则。最后一个环节则是将上述所获得的发酵液放在带放罐中，获得是将上述所获得的发酵液放在带放罐中，获得最终的发酵最终的发酵液液，完成青霉素的发酵制备，完成青霉素的发酵制备 。微生物生产抗生素青霉素青霉素发酵工艺流程及发酵控制发酵工艺流程及发酵控制冷冻管冷冻管孢子培养孢子培养25,7天天斜面母瓶斜面母瓶孢子培养孢子培养25,7天天大米孢子大米孢子种子培养种子培养27,50h1:3vvm一级一级种子培养液种子培养液

13、种子培养种子培养25,14h1:(11.5)vvm二级二级种子培养液种子培养液变温发酵变温发酵26-24200h1:(0.71.8)vvm发酵液发酵液微生物生产抗生素（1）孢子制备 先将保存在砂土中的菌种孢子取出，在由甘油、先将保存在砂土中的菌种孢子取出，在由甘油、葡萄糖以及蛋白胨所制备而成的培养基中进行葡萄糖以及蛋白胨所制备而成的培养基中进行斜面培养斜面培养，经传代和活化。培养温度控制在经传代和活化。培养温度控制在2626左右（最利于菌种左右（最利于菌种孢子传代活化的适宜温度）。培养孢子传代活化的适宜温度）。培养7d7d左右，得到单菌落左右，得到单菌落之后，之后，再传斜面再传斜面，以同样的方

14、式培养，以同样的方式培养7d7d。然后就可以将。然后就可以将所获得的斜面孢子移植到优质小米或大米所获得的斜面孢子移植到优质小米或大米固体培养基固体培养基上，上，25 25 ，相对湿度，相对湿度45%-50%45%-50%，培养，培养7d7d，得到最终的生产孢，得到最终的生产孢子。所获得的生产孢子应该经过摇瓶试验后，确定其效子。所获得的生产孢子应该经过摇瓶试验后，确定其效价与杂菌情况均符合相关规定后方可用于下一环节生产。价与杂菌情况均符合相关规定后方可用于下一环节生产。 可在孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。可在孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。微生物生产抗生素一级种子发酵：一级种子发酵

15、：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝发芽罐，孢子萌发，形成菌丝培养基：培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、消沫剂等。消沫剂等。接种量：接种量： 200200亿孢子亿孢子/ /吨培养基吨培养基空气流量：空气流量：1 1：3 3 （m m3 3/m/m3 3minmin）搅拌转速：搅拌转速：300-350 r/min300-350 r/minpHpH：自然：自然温度：温度：272711时间：时间：40h40h（2）种子罐培养工艺微生物生产抗生素（2）种子罐培养工艺二级种子罐：二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖繁殖罐，大量繁殖培养基：培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等葡萄

16、糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等接种量：接种量：10%10%空气流量：空气流量： 1 1：1-1.51-1.5 （m m3 3/m/m3 3minmin）搅拌转速：搅拌转速： 250-280 r/min250-280 r/minpHpH：自然自然温度：温度：25251 1 时间：时间：10-14h10-14h微生物生产抗生素（3）生产罐培养工艺三级罐三级罐：发酵罐发酵罐培养基：培养基： 花生饼粉、葡萄糖、尿素、花生饼粉、葡萄糖、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺胺、碳酸钙、玉米油、硅油、碳酸钙、玉米油、硅油温度控制：温度控制：变温控制，不同阶段不同温度变温控制，不同阶段不

17、同温度 较高温度（较高温度（2626），缩短生长时间；降低温度（），缩短生长时间；降低温度（2222），），利于青霉素合成。利于青霉素合成。pHpH：6.4-6.66.4-6.6左右左右 根据根据pHpH补糖（补糖可是补糖（补糖可是pHpH上升）上升）空气流量空气流量: : 1:0.8-1.51:0.8-1.5 （m m3 3/m/m3 3minmin）搅拌速度：搅拌速度：150-200r/min150-200r/min微生物生产抗生素发酵罐示意图微生物生产抗生素菌丝生长速度与形态、浓度 发酵稳定期，湿菌浓度可达发酵稳定期，湿菌浓度可达15%-20%15%-20%，丝状，丝状菌干重约菌干重约3

18、%3%，球状菌干重在，球状菌干重在5%5%左右。在发酵中后左右。在发酵中后期一般每天放液一次，每次放掉总发酵液的期一般每天放液一次，每次放掉总发酵液的10%10%左右。左右。微生物生产抗生素消沫天然油脂：天然油脂：玉米油玉米油；化学消沫剂：；化学消沫剂：泡敌泡敌前期：前期：主间歇搅拌，少加油主间歇搅拌，少加油中期：中期：搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时，少搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时，少量多次量多次) )后期：后期：尽量少加消沫剂尽量少加消沫剂微生物生产抗生素 青霉素的发酵过程控制十分精密，一般青霉素的发酵过程控制十分精密，一般2 2小小时取样一次，测定发酵液的时取样一次，测定发酵液的

19、pHpH、菌浓、残糖、青、菌浓、残糖、青霉素效价等指标，同样取样做无菌检测，发现染霉素效价等指标，同样取样做无菌检测，发现染菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后pHpH波动大，青霉素在几小时内就会被全部破环。波动大，青霉素在几小时内就会被全部破环。微生物生产抗生素(4)青霉素的提取工艺1.1.青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活2.2.水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定3.3.易溶于有机溶剂，水中溶解度很小易溶于有机溶剂，水中溶解度很小4.4.青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性青霉素盐

20、很稳定；降解产物具有致敏性5.5.防止降解，条件温和、快速防止降解，条件温和、快速微生物生产抗生素青霉素的提取工艺发酵液发酵液预处理预处理萃取萃取脱色脱色反萃取反萃取过滤洗涤过滤洗涤干燥干燥（发酵液中，青霉素浓度较低（发酵液中，青霉素浓度较低 10-30kg/m10-30kg/m3 3） 发酵液预处理发酵液预处理：浓缩目的产物，去除大部分杂志，浓缩目的产物，去除大部分杂志，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程过程 a a. . 加加絮凝剂使蛋白质沉淀絮凝剂使蛋白质沉淀 b. b. 过滤（鼓式真空过滤机）过滤（鼓式真空过滤机）活性炭微生物生产抗

21、生素萃取萃取工艺过程：二级逆流萃取工艺过程：二级逆流萃取A A、萃取原理：萃取原理： 分配定律分配定律，青霉素在青霉素在水中溶解度小，易溶于醋水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不溶于有机溶剂。不溶于有机溶剂。 青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，6.8-7.46.8-7.4，形成盐转入水相中，实现反萃取。形成盐转入水相中，实现反萃取。微生物生产抗生素B B、影响萃取因素、影响萃取因素a)a)pHpH：

22、反复调节：反复调节pHpH，青霉素不稳定，易发生降解、异，青霉素不稳定，易发生降解、异构化、重排，构化、重排，- -内酰胺环是功能性。内酰胺环是功能性。b)b)温度：加热会加快其降解反应温度：加热会加快其降解反应c)c)工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率越低。越低。d)d)微生物污染：杂菌：微生物污染：杂菌：- -内酰胺酶和青霉素酰胺酶内酰胺酶和青霉素酰胺酶e)e)萃取时间：青霉素在水中的半衰期萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min18.5min。微生物生产抗生素(5)(5)青霉素的精制青霉素的精制 制成碱金属盐：碱金属盐稳定性大；青

23、霉素在制成碱金属盐：碱金属盐稳定性大；青霉素在水中的稳定性差，水解快。水中的稳定性差，水解快。1)1)结晶工艺：结晶工艺：A A、醋酸丁酯中直接结晶：醋酸丁酯中直接结晶：加入醋酸钾加入醋酸钾-乙醇乙醇-碳酸钾、碳酸钾、丁醇丁醇-水真空共沸蒸馏。水真空共沸蒸馏。B B、丁醇丁醇- -水共沸结晶：水共沸结晶：青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。2)2)过滤、洗涤、干燥过滤、洗涤

24、、干燥 结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用真空双锥旋转干燥器采用真空双锥旋转干燥器微生物生产抗生素(6(6) )溶媒回收溶媒回收 采用立式传质塔蒸馏回收。采用立式传质塔蒸馏回收。微生物生产抗生素微生物生产抗生素一、斜面培养一、斜面培养： 淀粉淀粉1 1，硫酸铵，硫酸铵0.30.3、玉米粉、玉米粉0.60.61.01.0、氯化钠氯化钠0.30.3、蛋白胨、蛋白胨0.20.2、琼脂、琼脂2 2、pH7.0pH7.07.27.23737培养培养7 710d10d，成熟的孢子灰色略带微红色。，成熟的孢子灰色略带微红色。一级种子培养：一级种子

25、培养： 豆饼粉豆饼粉2.52.5、葡萄糖、葡萄糖3 3、淀粉、淀粉4 4、蛋白胨、蛋白胨0.50.5、酵母粉、酵母粉0.50.5、硫酸铵、硫酸铵0.50.5、 、玉、玉米粉米粉0.20.2、氯化钠、氯化钠0.30.3、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾0.060.06、硫酸镁硫酸镁0.0250.025、豆油、豆油0.30.335 35 培养培养72h72h，菌丝密集，菌丝密集六、红霉素的发酵生产微生物生产抗生素二级种子：二级种子： 豆饼粉豆饼粉2.22.2、葡萄糖、葡萄糖3 3、淀粉、淀粉4 4、蛋白胨、蛋白胨0.50.5、酵母粉酵母粉0.50.5、硫酸铵、硫酸铵0.10.1、玉米粉、玉米粉0.80.8、

26、氯化钠、氯化钠0.30.3、碳酸钙、碳酸钙0.60.6、豆油、豆油0.30.33535，24h24h，接种量，接种量1010二、发酵罐培养二、发酵罐培养发酵培养基：发酵培养基： 豆饼粉豆饼粉2.42.4、葡萄糖、葡萄糖3 3、3.53.5、蛋白胨、蛋白胨0.50.5、酵母粉酵母粉0.50.5、硫酸铵、硫酸铵0.10.1、玉米粉、玉米粉0.80.8、氯化钠、氯化钠0.30.3、碳酸钙、碳酸钙0.60.6、豆油、豆油0.150.15，丙酸，丙酸0.60.6（分（分次加入）次加入）60h60h前前3535，60h60h后后33 33 微生物生产抗生素菌丝繁殖期：菌丝繁殖期：接种接种45h45h后，菌丝生长快，繁殖旺盛，迅速利用后，菌丝生长快，繁殖旺盛，迅速利用N N、C C，菌丝体密集成网状。菌丝体密集成网状。红霉素分泌期：红霉素分泌期：45h45h150h150h，菌丝体生长减弱，并达到平衡，菌丝体生长减弱，并达到平衡，pHpH在在7.27.2左右，左右，c c源利用较快，红霉素持续分泌。源利用较快，红霉素持续分泌。菌丝自溶期：菌丝自溶期：菌体衰老，发酵液颜色较深，菌丝短，粘稠度较大，菌体衰老，发酵液颜色较深