Chapter+11+方法开发

1、2 Ionization Technique-离子化模式 Suitable Solvents and Additives合适的流动相与缓冲盐 Modifying Existing Separations for MS compatibility-优化已存的分离方法使其与质谱兼容3 了解样品和基质的化学性质 非-挥发性的 表面活性剂或离子对试剂 pH值 需要清洗 确定质谱检测器的兼容性，否则 增加仪器维护时间 导致仪器灵敏度下降或没有信号 增加鬼峰的可能性4 Pre-formed ions 铵盐 强酸或强碱 盐酸盐, 硫酸盐 金属配合物 ESI preferred 不需其他添加物 可能形成簇离子

2、5 极性分子, 有多个官能团的分子 分子有几个离子化点o 胺类化合物或醇类化合物 ESI, 正电离模式 APCI, 正电离模式o 酸 ESI, 负电离模式 APCI, 负电离模式6 没有电离位点的分子 芳香族化合物 金属有机化合物o APCI, 正离子模式o APCI 负离子模式o ESI with additives 7 高分子 肽, 蛋白质 o ESI, 正离子模式 核苷酸, 低聚糖o ESI, 负离子模式8 分析碱性化合物 用正离子模式 加酸降低 pH 值o 甲酸或乙酸 分析酸性化合物 用负离子模式 加减增加 pH 值o 氨水 分析未知的混合物 用正、负切换模式 pH should be

3、 4 比较有效.9 溶剂 (ESI,APCI) 水 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 异丙醇 丁醇 正己烷 环己烷 甲苯 乙酸乙酯10 缓冲盐 甲酸铵 乙酸铵 七氟丁酸 t-Ethylammonium hydroxide (TEAH-四乙基氢氧化铵-离子对试剂) 调节pH 甲酸 乙酸 三氟乙酸 (0.1%)-不建议 氨水(0.1 to 1%)缓冲盐的浓度不要超过10mM,越低越好.11 非挥发性的盐 (磷酸盐, 硼酸盐, 柠檬酸盐, 等等) 会在离子源部分结晶、沉积 (需要更多的清洗和保养) ZSpray 设计可以最大程度的容忍不挥发性的盐 表面活性剂 / 洗涤剂 会抑制电喷雾电离 无机酸 腐蚀剂 (具

4、腐蚀性)12 三氟乙酸 (TFA) 浓度 0.01% 时抑制ESI正电离 大大影响ESI负电离. 三乙胺 (TEA) 自身电离成 (M + H)+ ， m/z = 102. 能抑制一部分碱性化合物的ESI正电离 能增强一部分碱性化合物的ESI负电离.13 Ketoester Example ESI+ 从MS Scan 图中提取离子 m/z = 365 流动相 = 30/70 Water/ACN 应为为ESI+, 降低pH值对电离有帮助 -6.007.008.009.00Time0100%Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3)F13652.30e67.56流动相只有水和乙腈146.00

5、7.008.009.00Time6100%Raylo_1_007 Sm (Mn, 2x3)F13652.19e67.526.007.008.009.00Time0100%Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3)F13652.30e67.56流动相只有水和乙腈流动相中加入0.03%甲酸156.007.008.009.00Time0100%Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3)F13652.30e67.568.0010.00Time0100%Raylo_1_002 Sm (Mn, 2x3)F13652.30e69.24流动相中加入了0.03%TFA6.007.008.009.00

6、Time6100%Raylo_1_007 Sm (Mn, 2x3)F13652.19e67.52流动相中加入了0.03%甲酸流动相只有水和乙腈16% TFA(0 value was 50/50 ACN/H2O)TFA 对利血平(ESI)响应值的影响010203040506070809010000.010.020.050.10.2% TFA(0 是 50/50 ACN/H2O)Response17 不锈钢管 主要用于 LC 不要直接连在 ESI probe 上 PEEK 管 主要用于 LC/MS 易于更换 在DMSO, THF, CH2Cl2 作用下会溶胀 能被高浓度的 HNO3, H2SO4腐

7、蚀 用于 TEA时要小心 18 ESI是浓度型检测器，所以柱后分流不会影响信号强度 选择分流的原因: 降低源清洗次数 优化流速 节省贵重的样品1.0 mL/min0.9 mL/min0.1 mL/min19Zero Dead Volume TPEEK TubingPEEK TubingElectrospray ProbeWaste, PDA or Fraction CollectorAnalytical Column 提高进入MS流速可以： 加大废液管的长度 减少废液管的直径20 流动相组成 样品前处理条件 流速 柱的固定相21 流动相含有挥发性的盐. 流速1 mL/min for ESI 1

8、-2 mL/min for APCI 固定相不易流失 如果用短柱子或小内径的柱子，调节流动相流速 Flow Rate 2 = Flow Rate 1 (i.d. column 1 )2/ (i.d. column 2)2 =Flow Rate 1 (i.d. column 2)2 (i.d. column 1 )2 Transferring a gradient method? 系统体积影响梯度分离 分离可能改变由于o Gradient shape changes among different manufacturerso Volume of the mobile phase path fr

9、om mixer to column head changes from system to system Know the gradient delay volumes. Perform experiment to calculate gradient delay volume. Replace column with zdv union Perform the following experiment Eluent A: HPLC grade solvent, for example, MeOH Eluent B: eluent A + UV absorbing sample, for e

10、xample, 0.2 v% acetone or 5mg/L alkylparaben Equilibrate system to stable baseline with100% A Switch to 100% B Measure the half-height of the step to find the gradient delay time0% B100% BStep gradient:0-100%BLow volume systemHigh volume systemLiftoff: actual time that gradient reaches columnminutes

11、 Gradient delay volume (mL)= Gradient delay time (min) x flow rate (mL/min) Transfer gradient to lower volume system Calculate difference Add delay time as an initial isocratic segment to gradient elution profile Transfer gradient to higher volume system Calculate difference Start gradient Inject af

12、ter delay time based on differenceGradient Time 2 = L 2 x tg1 L1L1 = Long column lengthL2 = Short column lengthtg1 = Gradient time on long columntg2 = Gradient time on short columnOriginalTime (min) %A %B 0.0 5 95 10.0 50 50 15.0 95 5 20.0 95 5 25.0 5 95 30.0 5 95Adjust gradient table from 4.6 x 150

13、 mm to 4.6 x 20 mm AdjustedTime (min) %A %B 0.0 5 95 1.3 50 50 2.0 95 5 2.7 95 5 3.3 5 95 4.0 5 95Gradient Time 2 = 20 x 15 min 150= 2 min(ln k acenaphthene)YMC-Pack ODS-AYMC Jsphere ODSH80ACQUITY UPLC BEH C18Hydrophobicity062010SunFire C18YMC-Pack PolymerC18Hypersil CPS CyanoYMC-Pack CNWaters Spher

14、isorb S5 PACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl Nova-Pak PhenylYMC-Pack PhenylHypersil PhenylInertsil Ph-3YMC-Pack Pro C4YMCbasicSymmetry C8YMC-Pack Pro C8Nova-Pak C8XTerra MS C18Symmetry C18YMC-Pack Pro C18Inertsil ODS-3Nova-Pak C18YMC Jsphere ODSL80Nucleosil C18Waters Spherisorb ODS2Waters Spherisorb ODS

15、1Resolve C18Bondapak C18YMC-Pack ODSAQYMC Jsphere ODSM80Waters Spherisorb S5CNNova-Pak CN HPSymmetryShield RP8SymmetryShield RP18XTerra RP8XTerra RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5(ln a a amitriptyline/acenaphthene)XTerra MS C8Luna C18 (2)XTerra Phenyl Luna Phenyl He

16、xylChromolithTM RP-18Atlantis dC18Zorbax XDB C18ACT Ace C18Zorbax SB C18SunFire C8Luna C8 (2)ACQUITY UPLC BEHShield RP18ACQUITY UPLC BEH C8ACQUITY UPLC BEH Phenyl Atlantis T3ACQUITY UPLC HSS T3ACQUITY UPLC HSS C18ACQUITY UPLC HSS C18 SB Different Reversed Phase UPLC Column Chemistries Wide Range of Selectivities and HydrophobicitiesSelectivityACQUITY UPLC CSHACQUITY UPLC CSH Phenyl-HexylHypersil BDS Pheny