杏鲍菇胞外多糖液体发酵条件优化论文

1、杏鲍菇胞外多糖液体发酵条件优化杏鲍菇胞外多糖液体发酵条件优化摘要 杏鲍菇是一种品质优良的名贵珍稀食用菌，有很高的营养和食用价值，其营养成分丰富，多糖含量在食用菌中位于前列。相关研究已经证明杏鲍菇多糖具有降血脂等生物功能，因此通过液体发酵获得较高的杏鲍菇胞外多糖产量具有实际意义。本研究以杏鲍菇菌丝体为实验对象，通过五个单因子实验确定杏鲍菇菌丝体发酵获得胞外多糖产量最高的培养基组分。实验结果显示最佳碳源、氮源、无机离子、ph 值和培养时间，依次分别为半乳糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、6.0 和 9 天。在单因子实验的基础上，本文通过四因素三水平的正交实验得到杏鲍菇胞外多糖产率最高的培养基配方应为半乳糖

2、30 g/l，蛋白胨 5 g/l，磷酸二氢钾 3 g/l 且初始 ph 调节至 6.0，按照上述条件可得到的杏鲍菇胞外多糖得率为 5.920.84 g/l。关键词 杏鲍菇；胞外多糖；培养基优化abstractabstract pleurotus eryngii is a kind of rare and precious fungus which has high nutritional and edible value. further more, it is rich in polysaccharide content, which has been proved recently to

3、have lipid-lowering power in blood. therefore, the study of fluid medium optimization of p. eryngii for the improvement of the production of extracellular polysaccharide is full of practical significance. in this study, we treat mycelium as experimental subject, and carry out five single factor expe

4、riments to find out the best medium components, which are galactose as the best carbon source, peptone as the best nitrogen source, potassium dihydrogen phosphate as the best inorganic ions, 6.0 as the most suitable ph value and 9 days as the incubation time. based on the single factor experiments,

5、we proceed to an orthogonal experimental design which has four factors and three levels of each factor, and through this experiment we find out the optimal medium for the largest production of p. eryngii extracellular polysaccharide, which is galactose 30g/l, peptone 5g/l, potassium dihydrogen phosp

6、hate 3g/l and the initial ph value should be adjusted to 6.0. under such conditions, the ratio of production of p. eryngii extracellular polysaccharide is 5.920.84g per liter of fermentation liquor.keywordskeywords pleurotus eryngii；extracellular polysaccharides；fluid medium optimization目录目录1 1 引言引言

7、.12 2 材料与方法材料与方法.32.1 主要材料与试剂.32.1.1 生物材料.32.1.2 试剂.32.1.3 培养基.32.2 主要设备.32.3 试验方法.32.3.1 菌种活化.32.3.2 碳源单因子实验.42.3.3 氮源单因子实验.42.3.4 无机离子单因子实验.42.3.5 ph 值单因子实验.42.3.6 培养时间单因子实验.42.3.7 液体发酵培养条件正交试验.42.3.8 杏鲍菇菌丝体生物量测定.42.3.9 杏鲍菇胞外多糖的提取及定量.53 3 结果与讨论结果与讨论.63.1 单因子实验.63.1.1 碳源单因子实验.63.1.2 氮源单因子实验.73.1.3

8、无机离子单因子实验.93.1.4 ph 值单因子实验.103.1.5 培养时间单因子实验.113.2 正交试验.134 4 结论结论.14致谢.15附录.16毕业论文相关外文文献翻译.16参考文献.191 1 引言引言食用菌是一类可供食用的具有子实体的大型真菌，过去被称为“山珍” ，被誉为最理想的保健食品。其中绝大多数属于担子菌类，少数属于子囊菌。全球可食用的真菌有 2000 多种。我国目前能进行人工栽培的食用菌有 80 多种，其中可进行商业化栽培的仅 30 余种1。本文所关注的杏鲍菇（学名：pleurotus eryngii） ，又称刺芹菇、刺芹侧耳， ，隶属于担子菌亚门(basidiomy

9、cotina） ，层菌纲(hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(homobasidiomycetidae)，伞菌目(agaricales)，侧耳科(pleurotaceae)，侧耳属(pleurotus)。杏鲍菇属于侧耳属的最大一个种。杏鲍菇的名字源于其菌肉肥厚、营养丰富，具有杏仁的香气和鲍鱼的口感，是一种品质上佳的名贵珍稀食用菌2。杏鲍菇原产于欧洲地中海区域、中东和北非，但也在亚洲部分地区生长。1974 年，cailleux 用菌褶分离法获得杏鲍菇菌株并试栽成功。三年后，ferri 首先进行了商业性栽培的尝试。目前国内栽培的杏鲍菇多是上世纪九十年代后从欧洲引进的。杏鲍菇菌丝白色，初期

10、纤细，逐渐浓密蔓延。子实体单生或簇生，菌盖直径 213厘米，初圆形，后变平，菌盖中央稍下凹，成熟时成漏斗状，表面干燥，灰褐色，菌盖边缘稍内卷，菌肉白色，具杏仁味，菌褶乳白色，延生，菌柄长 515 厘米，多偏生或侧生，也有中生，粗壮、先端细，中实，无菌环，孢子椭圆至纺锤形。杏鲍菇的营养价值极高。氨基酸种类齐全，必需氨基酸所占比例高，特别是普通膳食中缺乏的赖氨酸、精氨酸含量丰富，同时钙、镁、钾、磷等无机元素含量也相当丰富，而脂肪含量偏低，因寡糖含量丰富，与双歧杆菌共用，具有整肠美容的效果，是一种理想的保健食品，早已受到国内外消费者的青睐。杏鲍菇是联合国粮农组织向各国推荐的食用菌品种，被列为 21

11、世纪最具开发潜力的十种食用菌之一。本文对于胞外多糖的关注，顺应了多年来糖生物学的迅猛发展3。糖类是地球生物不可缺少的化学物质，其最简单的形式成为生物体赖以生存的主要能源，但其最主要的生物学功能则是以糖复合物或者多糖的形式出现的4。1988 年牛津大学德威克教授在当年的生化年评杂志中撰写了以“糖生物学”为题的综述，这标志了糖生物学这一新的分支学科的诞生。糖生物学是糖的化学和生物学研究相结合而产生的一门新兴学科，主要研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能，其研究领域包括糖化学、糖链生物合成、糖链在复杂生物系统中的功能和糖链操作技术等5。近几十年来，随着糖化学、糖生物学、糖工程学、分子生物学及

12、现代分析技术的建立和发展，针对多糖的研究方法和技术有了长足的进步。人们逐步认识到多糖物质具有重要的生物学功能，涉及到有机体生命活动的整个时空序列，如：受精、着床、分化、发育、免疫、感染、癌变和衰老等6。20 世纪 90 年代以来，多种新方法、新技术被应用于多糖物质的研究中，一些不同生理活性的多糖物质被分离、纯化和鉴定，部分研究成果所形成的产品已投放市场，并显示出良好的经济效益2。现代药理学研究表明，杏鲍菇中所含的真菌多糖能增强肌体免疫功能7，具有抗病毒，降低机体胆固醇含量，防止动脉硬化等功能8。在杏鲍菇多糖的生物活性方面，也开展了较为深入的研究9, 10。杨立红11等以杏鲍菇子实体为材料，分离

13、纯化了杏鲍菇多糖，并利用 mda(丙二醛)、gshopx(谷胱甘肽过氧化物酶)活力、血清 gbt(谷丙转氨酶)活力、got(谷草转氨酶)活力、gk(肌酸激酶)活力等指标研究杏鲍菇多糖对力竭小鼠自由基代谢及心肌、肝脏、骨骼肌损伤的影响，以观察杏鲍菇多糖抗氧化、抗损伤功效12。张俊会13等研究报道了杏鲍菇发酵多糖对亚油酸、菜油氧化以及离体肝脏组织的脂质过氧化均有一定抑制作用。本文所涉及的发酵技术为液体发酵14，液体发酵是食药用菌液体培养的一种，它是将菌种培养在发酵罐或锥形瓶内，通过不断通气搅拌或振荡，使菌体在液体深层处繁育的方法15。通过液体深层培养即发酵的方式生产食用菌菌球，作为食用菌栽培的种子

14、或作为有效成分提取分离及深加工的原料。液体发酵技术属于现代生物技术之一，它比传统的食(药)用真菌栽培生产技术具有明显的优越性：周期短、成本低、产量大，且有工厂化生产前景16。本实验立足于杏鲍菇卓越的保健功效和正在不断发现中的各种生物学活性，着眼于杏鲍菇液体发酵产生的胞外多糖产量，通过单因子实验与正交试验的组合，以期筛选出杏鲍菇液体发酵胞外多糖产量最高的碳氮源、无机离子和酸碱度的组合17。该试验的结果将对食用菌来源的抗氧化、降血脂等保健产品的生产、开发具有一定的指导意义，为杏鲍菇多糖衍生食品和药物开发提供前期的理论和实验依据，令杏鲍菇及其多糖产品为人类的健康做出更大的贡献，产生更多的经济效益。2

15、 2 材料与方法材料与方法2.12.1 主要材料与试剂主要材料与试剂2.1.1 生物材料杏鲍菇菌种：购自江苏省农科院。2.1.2 试剂2.1.2.1供试碳源d-木糖，d-果糖，d-葡萄糖，l-阿拉伯糖，d-甘露糖，半乳糖，鼠李糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，d-甘露醇，可溶性淀粉，d-山梨醇，糊精。2.1.2.2供试氮源蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，硫酸铵，尿素，胰胨，醋酸铵。2.1.2.3供试无机离子七水合硫酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钙。2.1.2.4其他盐酸，氢氧化钠，无水乙醇。2.1.3 培养基2.1.3.1菌种保藏培养基：pda 斜面培养基马铃薯 20%，葡萄糖 2%，琼脂 2%，

16、ph 自然。2.1.3.2种子培养基：商品 pda 培养基称量出商品 pda 培养基粉末 46.0g（配方：马铃薯粉 6 g/l，葡萄糖 20 g/l，琼脂20 g/l，ph 5.60.2） ，加入 1000ml 蒸馏水中，115高压灭菌 20 分钟。2.1.3.3液体发酵培养基葡萄糖 30 g/l，酵母提取物 5 g/l，蛋白胨 2 g/l，磷酸二氢钾 1 g/l，七水合硫酸镁 1 g/l，ph 自然。2.22.2 主要设备主要设备hyg-a 全温摇床柜，无菌操作台，恒温磁力搅拌器，立式蒸汽灭菌器，电子分析天平，旋转蒸发仪 re-52，循环水真空泵，酸度计，冰箱，微波炉，超声波清洗器，电子天

17、平。2.32.3 试验方法试验方法2.3.1 菌种活化将保藏于斜面 pda 培养基上的菌种转接于种子培养基上，25培养 9 天或至长满培养基。选择菌丝生长最为旺盛的平板备用。2.3.2 碳源单因子实验分别用 d-木糖，d-果糖，d-葡萄糖，l-阿拉伯糖，d-甘露糖，半乳糖，鼠李糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，d-甘露醇，可溶性淀粉，d-山梨醇，糊精替代液体发酵培养基中的等量碳源，其余成分保持不变，制成碳源单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每 150 ml 锥形瓶装入 50 ml 培养基，接种量 10%，于 25 ，150 r/min 培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。2.3.3 氮源单因

18、子实验分别用蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，硫酸铵，尿素，胰胨，醋酸铵替代液体发酵培养基中的等量氮源，其余成分保持不变，制成氮源单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每 150 ml 锥形瓶装入 50 ml 培养基，接种量 10%，于 25 ，150 r/min 培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。2.3.4 无机离子单因子实验分别用七水合硫酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钙替代液体发酵培养基中的等量无机离子，其余成分保持不变，制成无机离子单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每 150 ml 锥形瓶装入 50 ml 培养基，接种量 10%，于 25 ，150 r/min 培养

19、九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。2.3.5 ph 值单因子实验采用液体发酵培养基，将 ph 值分别调至 5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 ，误差不超过 0.1，制成 ph 值单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每 150 ml 锥形瓶装入 50 ml 培养基，接种量 10%，于 25 ，150 r/min 培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。2.3.6 培养时间单因子实验采用采用液体发酵培养基，将培养时间依次设置为 7、8、9、10、11、12 天，制成培养时间单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每 150 ml 锥形瓶装入 50 ml 培养基，接种量 10%

20、，于 25 ，150 r/min 培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。2.3.7 液体发酵培养条件正交试验利用单因子实验得到的最优碳源、氮源、无机离子和起始 ph 值四个因素，各取三个水平，进行正交实验。培养时间为九天。实验因素水平设计见表 2-1。表 2-1 正交试验设计方案a：碳源b：氮源c:无机离子d：起始 ph 值水平125g/l5g/l1g/l5.5水平230g/l7g/l2g/l6水平335g/l9g/l3g/l6.52.3.8 杏鲍菇菌丝体生物量测定培养九天的发酵液经纱布过滤，并用蒸馏水反复冲洗菌丝体，置于 60 摄氏度恒温烘箱中烘干至恒重，称重。生物量的计算依照如下公式：菌

21、丝生物量（mg/l）=菌丝体干重（mg） / 发酵液体积（ml） * 10002.3.9 杏鲍菇胞外多糖的提取及定量本实验采用醇沉法提取杏鲍菇胞外多糖，具体的技术路线为：发酵液过滤菌丝体利用旋转蒸发仪浓缩至原体积的 20%缓慢加入无水乙醇至原体积，即终体积分数为 80%四摄氏度下冰箱冷藏过夜离心弃去上清液将沉淀置于烘箱内干燥至恒重得到醇沉粗多糖。多糖提取率的计算依照如下公式：多糖提取率（mg/l） = 粗多糖干重（mg） / 发酵液体积（ml） * 10003 3 结果与讨论结果与讨论食用菌液体发酵的技术关键在于培养基的选取，不同的菌种对于培养基的需求均有差异。本文通过单因子实验结合正交试验，

22、以期得到胞外多糖产量最高的杏鲍菇液体深层发酵培养基配方。3.13.1 单因子实验单因子实验3.1.1 碳源单因子实验碳源单因子的实验结果如表 3-1，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同碳源对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图 3-1 与 3-2。在选取被试碳源时，我们考虑到了不同类别的糖类对于胞外多糖产量的影响。其中包含有单糖（d-木糖，d-果糖，d-葡萄糖，l-阿拉伯糖，d-甘露糖，半乳糖，鼠李糖） ，二糖（乳糖，麦芽糖，蔗糖） ，多糖（可溶性淀粉，糊精）以及糖醇（d-甘露醇，d-山梨醇） 。在单糖中，最适碳源是半乳糖。二糖中，多糖产量最高的碳源是乳糖。多糖明显更利于真菌菌丝体的生长

23、而不是产生胞外多糖。糖醇类则在菌丝体生长和产多糖两方面都不具有明显的优势。因为本实验着眼于培养基各元素对于胞外多糖产量的影响，所以首要关注的是能提高胞外多糖产量的碳源。从碳源单因子实验的结果看来，杏鲍菇胞外多糖得率最高的是半乳糖，其次是葡萄糖，再次是乳糖。以半乳糖作为碳源，多糖得率较葡萄糖高出 12%，较乳糖高出 17%。因此在后续试验中，半乳糖将作为最佳碳源加入培养基。表 3-1. 不同碳源对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响碳源菌丝生物量 mg/l多糖得率 mg/l半乳糖705412.58 2466.6715.28 d-葡萄糖710235.78 220017.32 乳糖70492.29

24、210010.00 鼠李糖63166.79 190035.36 d-山梨醇783254.31 190021.21 麦芽糖702521.99 1666.6728.87 l-阿拉伯糖589911.50 160010.00 d-甘露糖688414.11 1533.335.77 d-木糖53393.41 14509.57 蔗糖806729.30 1333.335.77 d-果糖777721.91 120010.00 d-甘露醇790010.59100012.50可溶性淀粉9867123.39 20023.40 图 3-1. 不同碳源对于杏鲍菇菌丝体质量的影响图 3-2. 不同碳源对于杏鲍菇胞外多糖产量

25、的影响3.1.2 氮源单因子实验氮源单因子的实验结果如表 3-2，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同氮源对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图 3-3 与 3-4。供试氮源有无机氮源（硫酸铵，醋酸铵）和复杂有机氮源（蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，尿素，胰胨） 。结果显示无机氮源无法促进菌丝体良好地生长，有机氮源在菌丝体生长方面普遍效果显著，尤其是酵母提取物和牛肉膏。但在胞外多糖的获得率方面，有机氮源蛋白胨的效果显然要更加理想，其多糖的得率显然要远远高于后面几种备选的氮源。因此，在后续实验中，蛋白胨将作为最佳氮源加入培养基。表 3-2. 不同氮源对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响氮源菌丝

26、生物量 mg/l多糖得率 mg/l蛋白胨63779.09 2243.58.11 牛肉膏1133150.72 210021.68 酵母提取物1157320.86 171016.55 胰胨418811.88 1412.6734.55 尿素52693.90 7716.05 醋酸铵28176.89 734.57.55 硫酸铵53557.92 76046.16 图 3-3. 不同氮源对于杏鲍菇菌丝体质量的影响图 3-4. 不同氮源对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响3.1.3 无机离子单因子实验无机离子单因子的实验结果如表 3-3，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同无机离子对于菌丝体质量和多糖产量的影响如

27、条形图 3-5 与 3-6。在无机离子的单因子实验中我们主要考虑了大量元素，而痕量元素因为在液体药瓶中一般不添加而不在考虑范围之内。大量元素中，我们挑选了镁离子、钾离子和钙离子所谓主要的被试离子，其中钾离子考虑了其三种主要出现在培养基中的形式。实验结果显示，钙离子显然最有利于菌丝体的生长，这与在大多数的真菌生长过程中钙离子都与菌丝体延长的生理过程有关。但在多糖产率方面，钾离子的效果明显好于其他两个被试离子。其中又以 kh2po3的效果最为卓著，其多糖得率较次佳无机离子 k2hpo3高 16.3%，比镁离子和钙离子分别高 172.5%和 203.3%。因此，在后续实验中，kh2po3将作为最佳无

28、机离子加入培养基。表 3-3. 不同无机离子对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响无机离子菌丝生物量 g/l多糖得率 mg/lmgso47h2o379439.88 2099.00 29.20 k2hpo340775.77 4918.67 17.83 kh2po3326413.69 5720.67 8.89 cacl2467817.68 1886.00 14.99 kcl35517.30 940.67 15.81 control381310.55 558.67 5.09 图 3-5. 不同无机离子对于杏鲍菇菌丝体质量的影响图 3-1. 不同无机离子对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响3.1.4 ph 值

29、单因子实验ph 值单因子的实验结果如表 3-4，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同ph 值对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图 3-7 与 3-8。可以看出杏鲍菇的菌丝体基本上对于 ph 值并不十分敏感，生物量和多糖得率在不同 ph 条件下相差并不显著，但是仍可以清晰地看出 ph 为 6.0 时，菌丝体生长地更好，且多糖得率也是最高的。因此，在正交试验中，我们将以 ph6.0 为基准，看这一条件与其他条件是否能契合。表 3-4. 不同 ph 值对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响ph 值菌丝生物量 g/l多糖得率 mg/l5.0 779112.06 380010.00 5.5 731

30、513.29 4066.6711.55 6.0 907954.09 44000.00 6.5 813829.83 400025.82 7.0 892048.32 3333.33102.14 图 3-6. 不同 ph 值对于杏鲍菇菌丝体质量的影响图 3-7. 不同 ph 值对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响3.1.5 培养时间单因子实验培养时间单因子的实验结果如表 3-5，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同培养时间对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图 3-9 与 3-10。有条形图可以明显的看出，对于菌丝体生长而言，11 天是最合适的长度，过长的时间可能导致菌丝体快速老化，果断的时间菌丝体还有

31、继续生长的潜力和空间。但对于多糖得率而言则并不尽然，第七天就已经出现的高峰可以解释为原来培养基中的糖尚未得到完全的消耗，因此糖含量非常高。而在第八点的拐点之后，我们看到 9、10两天的多糖产量相近且均高于之前与之后的时间。因此，从节约发酵时间的角度出发，在第九天与第十天多糖产量相差不大的情况下，我们认为最优的培养时间是九天。表 3-5. 不同培养时间对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响培养时间菌丝生物量 g/l多糖得率 mg/l7380911.37 240024.86 8435112.33 2196.674.21 9403921.68 2317.338.69 10570922.59 2322

32、.6720.45 11639843.98 1925.3329.26 12289331.90 180020.00 图 3-8. 不同培养时间对于杏鲍菇菌丝体质量的影响图 3-9. 不同培养时间对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响3.23.2 正交试验正交试验正交试验(orthogonal experiment)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。正交试验是分析因式设计的主要方，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法18。正交试验的设计主要依据正交表。所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的

33、实验方案，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。比如 3 水平 4 因素表就只有 9 行，即需要九次实验，远小于遍历试验的 81 次；同理可推算出因素水平越多，试验的精简程度会越高。本实验采取了四因素三水平的正交试验方案，四因素分别设置为碳源、氮源、无机离子和 ph 值。其中，前三者分别采用之前的单因子实验所得到的最优碳源、氮源和无机离子，依次为半乳糖、蛋白胨和磷酸二氢钾，而 ph 值则依据单因子实验得到的结果，分别加减 0.5 设置水平。正交试验结果及相关分析如下表所示：表 3-6. 正交试验结果及分析表序号半乳糖 g/l蛋白胨 g/l磷酸二氢钾 g/lph胞外多糖质量

34、g/la25515.5 0.81 0.17b25726.0 1.15 0.30c25936.5 1.14 0.03d30526.5 1.69 0.22e30735.5 1.67 0.45f30916.0 0.96 0.29g35536.0 5.92 0.84h35716.5 2.45 0.46i35925.5 4.04 0.33k13.10 0.50 8.42 1.234.22 0.926.52 0.95 k24.32 0.96 5.27 1.216.88 0.858.03 1.43 k312.41 1.63 6.14 0.658.73 1.325.28 0.71 k11.03 0.172.8

35、1 0.411.41 0.312.17 0.32 k21.44 0.32 1.76 0.402.29 0.282.68 0.48 k34.14 0.54 2.05 0.222.91 0.441.76 0.24 r3.11 0.371.05 0.011.50 0.130.92 0.24最佳水平35536.0 上表中，k1，k2，k3分别为所在元素在三个水平上得到的多糖得率之和，k1，k2，k3则为所在列元素的多糖得率的平均值，r 值为平均值的极差。依据该正交试验结果表，由 r 值的变化可知四个因素的影响从大到小依次为a（碳源，半乳糖）c（无机离子，磷酸二氢钾）b（氮源，蛋白胨）ph。依据三个平均

36、值的变化，可以得到最佳的条件组合为 a3b1c3d2，也即在半乳糖浓度为 30g/l，蛋白胨浓度为 5g/l，磷酸二氢钾浓度为 3g/l 且初始 ph 调节至 6.0 时，杏鲍菇胞外多糖的产量最大，得率最高。4 4 结论结论本文以杏鲍菇菌丝体为实验对象，通过单因子实验确定杏鲍菇菌丝体发酵获得胞外多糖产量最高的碳源、氮源、无机离子、ph 值和培养时间，分别为半乳糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、6.0 和 9 天。在单因子实验的基础上，本文通过正交实验得到杏鲍菇胞外多糖产率最高的培养基配方应为半乳糖 30 g/l，蛋白胨 5 g/l，磷酸二氢钾 3 g/l 且初始 ph 调节至 6.0，按照上述条件可得到

37、的杏鲍菇胞外多糖得率为 5.920.84 g/l。附录附录毕业论文相关外文文献翻译毕业论文相关外文文献翻译碳源、氮源和无机离子对于 psathyerella atroumbonata(pegler)，一种尼日利亚食用真菌，生长的影响17摘要：摘要：我们研究了简单有机物、无机物和复杂组分对于 psathyerella atroumbonata(pegler)，一种尼日利亚食用真菌，生长的影响。我们使用了多种碳源，其中葡萄糖对于菌体的生长有最佳的刺激作用，其余依次是甘露糖、纤维素和甘露糖醇。山梨糖和肌醇对于生长的效力最小。在所检测的氮源中，酵母提取物是最有效的，紧接着是麦芽提取物和 l-色氨酸，硝

38、酸钠和硫酸铵则是效果最差的。最佳的碳氮比是 2:3，最差的碳氮比是5:1。最佳的大量元素是钙离子和镁离子，最佳的微量元素则是铜和锌。1.简介简介psathyerella atroumbonata(pegler)是一种可食用真菌，属于担子菌门伞菌目鬼伞科(alexopolous, mims & blackwell, 1996; makinen, 1977; zoberi, 1972)。这种真菌在自然界中广泛分布。在热带和亚热带地区的森林落叶、土壤和倒木上都有发现 (pegler, 1977; nicholson, 1996)。对于 yoruba 人和尼日利亚很多其他部落来说，psathy

39、erella atroumbonata 都是一种极好的食物来源(makinen, 1977; oso, 1977a; alofe, odu & illoh, 1998 )。然而，由于它的担子果不那么引人注目(zoberi, 1972)，人们常常会忽略它。而在它广泛生长的地方，那些知道它的价值的人则常常为了它起争执。尼日利亚人通常是靠它季节性的出现而食用之，而这并不是很规律的。尽管一些尼日利亚蘑菇的食用和潜在药用价值得到了一定的关注(oso, 1977b)，但是它们的培养和商业化生产则没有得到足够的重视。所以，本研究旨在提供能够有助于 psathyerella atroumbonata

40、培养技术的实用性强的初步信息。2.材料与方法材料与方法psathyerella atroumbonata 的子实体采集自伊巴丹大学植物园的科特迪瓦榄仁的朽木之上。菌丝体纯培养则是用加入了 0.5%酵母提取物的土豆葡聚糖琼脂培养基（pda）分离纯化的得到的。这种真菌的营养需求是通过菌丝体干重法(fasidi & jonathan, 1994)得到的。基础培养基是锥形瓶中 1l 去离子水中加入各种营养物的产物。培养基中额外添加了 50 mg 硫酸链霉素以抑制细菌生长，ph 值调节到 6.5。将基础培养基分装入 250 立方厘米的容器中，并用铝箔封口，121 摄氏度下灭菌 15 分钟，并确保

41、每种处理都有三个生物重复。每个瓶内接种 0.7 厘米直径的 psathyerella atroumbonata。在 302 摄氏度下连续培养 7 天之后，菌丝体成熟，55 摄氏度下烘干 18 小时并最终称重。2.1. 碳源单因子实验所使用的液体培养基含有酵母提取物 2.5g，磷酸二氢钾 0.05g，七水合硫酸镁0.05g，硫酸亚铁 0.01g，硝酸钾 1.55g 及一升去离子水。液体培养基中含有 1%不同种类的碳源，复杂碳源每一升加入十克。对照组选用没有加入任何碳源的培养基(kadiri & fasidi, 1994; chandra & pur -kayastha, 1977

42、)。2.2. 氮源单因子实验基础培养基含有磷酸二氢钾 0.05g，七水合硫酸镁 0.05g，葡萄糖 10g，盐酸硫胺0.5mg 及一升去离子水。各种复杂氮源（蛋白胨，尿素，酵母提取物，麦芽提取物和酪蛋白水解物）分别以每升两克的比例加入到基础培养基中。对照组选用没有加入任何氮源的培养基。2.3. 碳氮比单因子实验基础培养基与氮源单因子实验中的相同，但不含葡萄糖。取用之前两个实验中最佳的碳源和氮源，即葡萄糖和酵母提取物，各 0.1 克进入基础培养基中，打造 1:1 的碳氮比(fasidi & olorunmaiye, 1994)。2.4. 大量元素单因子实验基础培养基含有葡萄糖 10g，硝

43、酸钠 2g，七水合硫酸镁 0.2g，氯化钙 0.3g，盐酸硫胺 0.5mg 及一升去离子水。每种被测试的大量元素都用其共轭铵替代（例如硝酸钠用硝酸铵替代，硫酸镁用硫酸铵替代） 。本实验使用了两种对照，一组含有所有大量元素，一组不含有任何大量元素。2.5. 痕量元素单因子实验五种痕量元素（铜，铁，锰，钴和锌）的硫酸盐被分别加入到基础培养基中，浓度均为 10 毫克每升。本实验使用了两种对照，一组含有所有痕量元素，一组不含有任何痕量元素。2.6. 数据分析所有数据都依据 duncan 的多范围检测 进行了差异分析和重要性分析。3.结果与讨论结果与讨论碳源的单因子实验结果显示葡萄糖是最佳的碳源（表 1

44、） 。紧随其后的是甘露糖和纤维素。大型食用真菌对于葡萄糖的利用已经为前人所报道(fasidi & olorunmaiye,1994; fasidi & jonathan, 1994; hong, 1978; chandra &purkayastha, 1977; oso, 1977a)。这种对葡萄糖的喜爱可能是因为这种糖更容易通过代谢产生细胞能量(garraway & evans, 1984; jandaik & kapoor, 1976)。甘露糖，次佳碳源，是一种葡萄糖的异构体，可以在代谢过程中转变为葡萄糖(morrison and boyd, 199

45、2)。griffin(1994)曾在文章中指出甘露糖和果糖往往是仅次于葡萄糖的最优碳源。肌醇是实验中效果最差的碳源，对于菌种生长没有已知的重要作用；而效果如此之差可能是由于这种菌体没有可以代谢该种糖醇的酶。在测试的所有氮源中，最佳的氮源是酵母提取物（表 2） 。紧随其后的是麦芽提取物和 l-色氨酸。这一结果与 fasidi and olorunmaiye (1994)在 pleurotus tuber-regium 的实验上和 alberghina (1973)在 neurospora crassa 的实验上结果是相近的。这两种组分对于psathyerella atroumbonata 生长的

46、相似促进作用可能源于他们的碳水化合物和蛋白质组分 (alberghina, 1973; bolton & blair, 1982)。氨基酸基本都会促进这种大型真菌的生长，其中 l-色氨酸的效果尤其突出，其次是 l-天冬氨酸和 dl-苯丙氨酸。madunagu (1988)在 pleurotus squarrosulus 的研究中曾得到类似的结果。除了硝酸钙和硝酸铵分别促进菌丝生长，分别至 70mg/cm3 和63mg/cm3；其余的无机氮源都没有明显的促进菌丝的生长。硫酸铵和硝酸钠的培养基内菌丝体生长到 36.7mg/cm3，这一结果甚至低于对照组。硝酸根离子对于某些担子菌的生长具有抑

47、制作用 (griffin, 1994)。硫酸根离子是一个大基团，在过膜过程中可能有一定的困难，所以难以支持其生长(garraway & evans, 1984)。本研究中所用的各种碳氮比都有效促进了菌丝的生长（表 3） （p=0.01） 。最佳碳氮比为 2:3，其次为 3:4，最差的则是 5:1。此结果与 chandra and purkayastha (1977; for agaricus campe stris)和 fasidi and olorunmaiye (1994; for pleurotus tuber-regium)得到的并不相同，这表明了 psathyerella a

48、troumbonata 有独特的营养需求。这种真菌在可忍受的范围内均可以使用碳氮源(jandaik & kapoor,1976)。含有所有大量元素的完全培养基可以极大地促进 psathyerella atroumbonata 的生长（p=0.01） 。这说明所有的大量元素在菌体生长中都是需要的，尽管依赖程度并不相同（表 4） 。不含钠的完全培养基可以促进菌丝的最佳生长，紧随其后的是不含钾、钙、镁的培养基。fasidi and jonathan (1994)在对 volvariella esculenta 的研究中也得到了类似的结论。griffin (1994)曾研究钙对于菌丝生长的重要

49、性以及镁对于 atp 代谢的重要性。钠离子所致的生长最差支持了 sykes an d porter (1973)所提出的只有在海洋中生长的真菌才在生长与代谢中需要钠离子的结论。在所有的痕量元素实验中，双失培养基得到的菌丝生长最好，其次是缺少锰、铁、锌和铜的培养基（表 5） 。这说明 psathyerella atroumbonata 的生长并不显著需要钴和锰。此种真菌不能利用这两种痕量元素可能是因为它们对于真菌细胞的普遍毒性。类似的毒性报告见于 humfeld and sugihara (1952; foragaricus campestris)和 chandraand purkayastha

50、 (1977; for volvariella volvacea)。缺乏铜和锌离子的培养基效果最差，说明他们在真菌生长过程中是必须的。尽管这两种元素的含量不同，但是它们在统计学上的差异并不大（p=0.01） 。真菌酶活性同时需要铜和锌，但是锌是中间代谢所需要的(griffin, 1994)。在基础培养基上的生长非常差（负对照） ，意味着 psathyerella atroumbonata 在生长过程中需要一些痕量元素(griffin, 1994; garraway & evans, 1984)。上述研究表明葡萄糖和酵母提取物以 2:3 的比例并入培养基中时可以极大地促进psathyer

51、ella atroumbonata 的生长。钙、镁、钾也可以很好的促进其生长，铜和锌（在很低的浓度上）对于菌丝体的繁殖也是必须的。所有这些都可以促进菌丝的生长，并生产出极好的可食用真菌。参考文献参考文献1 孟思; 刘晓宇; 李信辉; 吴谋成. 杏鲍菇水溶性多糖提取工艺研究 j. 食品科学, 2007, 28, 141-144.2 潘晓恒. 杏鲍菇液体发酵多糖的提取及抗氧化研究. 吉林农业大学, 2008.3 gabius, h. j.; siebert, h. c.; andr, s.; jimnezbarbero, j.; rdiger, h. chemical biology of the

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56、submerged culture conditions for mycelial polysaccharide production in cordyceps pruinosa. process biochemistry, 2004, 39, 2241-2247.17 jonathan, s.; fasidi, i. effect of carbon, nitrogen and mineral sources on growth of psathyerella atroumbonata(pegler), a nigerian edible mushroom. food chemistry,

57、2001, 72, 479-483.18 peng, m.; lemke, p. a.; shaw, j. j. improved conditions for protoplast formation and transformation of pleurotus ostreatus. applied microbiology and biotechnology, 1993, 40, 101-106.年产年产1001000 0吨珍稀杏鲍菇生产项目吨珍稀杏鲍菇生产项目 可行性研究报告可行性研究报告目目 录录第一章 总 论 .11.1 项目概要.11.2 项目提出的背景.21.3 项目实施的有利

58、条件.5第二章 .8第三章 .9第四章 技术与装备 .124.1 产品简介.124.2 工艺流程与工艺区划.124.3 技术方案.154.4 设备选择.18第五章 生产模式与产业化 .205.1 产品生产特性.205.2 产业化开发.205.3 农户收益分析.225.4 项目带动作用.23第六章 物料供应和公用设施 .246.1 物料供应.246.2 动力要求.246.3 动力用量及公用设施.246.4 仓库及运输.25第七章 建厂条件与园区布置 .257.1 厂址条件.257.2 市政配套.26第八章 项目建设方案 .278.1 项目的构成和范围.278.2 生产环境要求.278.3 总图.

59、278.4 土建.288.5 通风、空调.298.6 气体动力.298.7 给水排水.308.8 电气.328.9 通信、信息.33第九章 组织机构、劳动定员和人员培训 .339.1 组织机构.339.2 劳动定员.349.3 人员培训.34第十一章 投资估算与资金筹措 .3611.1 固定资产投资估算.3611.2 流动资金估算.3711.3 项目总投资 .3811.4 资金筹措.38第十二章 经济分析 .3812.1 基本数据.3812.2 财务评价.4012.3 经济分析主要结果.4212.4 综合评价.42i i 附表：附表：表b1-1 总投资估算表表b2-1 项目总投资使用计划与资金

60、筹措表 表b3-1 总成本费用估算表表b4-1 利润与利润分配表表b5-1 项目投资现金流量表表b6-1 借款还本付息计划表表b7-1 财务计划现金流量表iiii 附附 图：图： 1公司区域位置图2公司总平面布置图3生产车间工艺区划图iiiiii 附件：公司营业执照附件：公司营业执照第一章第一章 总总 论论1.1 项目概要项目概要1.1.1 项目名称年产1000吨珍稀杏鲍菇生产项目1.1.2 内容提要杏鲍菇，中文名为刺芹侧耳，商品名为杏鲍菇，其菌肉肥厚，菌盖和菌柄质地脆嫩，具有淡淡的杏仁味，是味道极好的一种菇类，被称为“平菇王” 、 “草原上的牛肝菌” 。美国食用菌界认为，杏鲍菇是侧耳属中风味最好的食用菌。每100克杏鲍菇干物质中，粗蛋白的含量为25%、脂肪1.4%、粗纤维6.9%、氨基酸总量16.