中国海洋大学微生工重点

1、第一章 微生物工程概述【发酵】：在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。工业上所称的发酵是泛指利用微生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。【发酵工程】应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。发酵的类型：1 按发酵原料来分 糖类 石油 废水2 按发酵形式来分 固态 深层液体3 按发酵产物区分 AA 有机酸 抗生素 酶制剂 维生素 酒精4 按发酵工艺流程区分 分批 连续 流加5 按发酵过程中对氧的不同需求区分 厌氧 通风发酵基本过程（4步）：1）菌种制备 2）种子培养 3）

2、发酵 4）提取精制发酵工业的发展史：1 天然发酵阶段2 纯培养技术的建立3 通气搅拌发酵技术的建立4 代谢控制发酵时期5 基因工程阶段第二章 菌种的分离、选育、保藏【代谢控制发酵】是指用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或微杆菌属的棒型细菌。其它氨基酸生产菌：常规菌种主要是对上述产L谷氨酸的优良菌株进行人工诱变后选育出的各种突变株；工程菌大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。菌种分离思路：菌种的分离是要从混杂的各

3、类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。菌种分离与筛选的步骤1、定方案： 2、采样：有针对性地采集样品。3、增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。4、分离：利用分离技术得到纯种。5、发酵性能测定：目的微生物的富集富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，增加筛选几率。富集的方案：定向培养：采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。不能提供任何有助于筛选产生菌的信息时，只能通过随机分离的办法。定向培养的富集方法：一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势

4、（比生长速率）。常用的手段包括：底物 、pH条件 、培养时间、培养温度。菌种的筛选：从产物角度出发；从形态角度出发菌株选育的方法：l 基因突变：自然选育、诱变育种l 基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程技术l 基因的直接进化：点突变、易错PCR、DNA Shuffling【自然选育】：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变(Spontaneous Mutation)而进行的菌种筛选过程，又叫自然分离。自然突变的机率为10-810-9。【诱变育种】通过各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变的频率，扩大变异范围，从中选出具有优良特性的变异菌株的育种方法。诱变剂的种类1、 物理诱变剂：紫

5、外线2、 化学诱变剂：亚硝基胍3、 生物诱变剂：诱变育种方案与步骤诱变的三个环节包括突变的诱发，突变株的筛选，突变高产基因的表型筛选。步骤：1）出发菌株的选择 2）菌悬液的制备 3）诱变处理 4）中间培养 5）突变株的分离和筛选【营养缺陷型】 通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。筛选营养缺陷型的步骤：（基本MM；补充SM；完全CM）1. 进行诱变 (物理诱变化学诱变)；2. 淘汰野生型 有两种方法：抗生素法：野生型能在基本培养基中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化

6、阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，野生型孢子在基本培养基中生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未萌发而滤过。3. 检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。 方法：影印法、点种法、夹层法 4 营养缺陷型生长谱的确定验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。生长谱测定有两种方法：【定点突变】 定点

7、突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA段（基因组，或质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。【DNA改组技术】指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因 (或基因家族) 原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物新的功能。被称为分子水平上的定向进化。【基因重组】将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之在受体内稳定遗传，表达出新产物或新性状。也称为分子克隆技术。常用的基因表达系统：（1） 原

8、核生物表达系统（2） 真核生物表达系统（3） 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统【细胞杂交育种】两个不同基因型的菌株通过杂交结合，将遗传物质重新组合，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，从中分离和筛选具有新性状菌株的育种方法。工业微生物菌种保藏技术保藏原理：根据菌株生理生化特性，人工创造条件（低温、干燥、真空）使菌体的代谢活动处于休眠期状态，以减少菌种的变异。目的要求：经长期保藏后菌种存活良好，保证菌种不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物生产能力。一、 冷藏保藏：a，普通冷冻保藏技术 ； b，超低温冷冻保藏技术 ； c，液氮冷冻保藏技术二、 冷冻干燥保藏三、 其他保藏方法：a，传代

9、保藏 ； b，矿物油中浸没保藏第三章 培养基【培养基】是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。作用：1、满足菌体的生长；2、促进产物的形成一、 培养基的分类 ：1 按纯度分类：合成培养基；天然培养基2 按状态分类：固体培养基；半固体培养基；液体培养基3 按用途：孢子培养基；种子培养基；发酵培养基第二节 发酵培养基的成分及来源 一、碳源：1、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分。 2、来源糖类、油脂、有机酸、低碳醇和其它碳氢化合物等 葡萄糖葡萄糖是最容易利用的碳源，几乎所有的微生物都能利用。过多的葡

10、萄糖会抑制微生物的生长和产物的合成。(葡萄糖效应) 糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，是制糖工业的副产物。 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。 淀粉、糊精 油和脂肪 有机酸 烃和醇类二、氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：无机氮源、有机氮源。1、无机氮源种类：铵盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称迅速利用氮源。无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化l 选择合适的无机氮源有两层意义：1、满足菌体生长；2、稳定和调节发酵过程中的pH2、有机氮源（1）种类：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料如花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼

11、粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。（2）特点：有机氮源成分复杂，除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。三、无机盐和微量元素1、作用 无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质，作用包括：构成菌体成分；作为酶活性基团的组成部分或辅酶(基)；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；作为自养菌的能源。 2、来源：主要来自于C、N源，以盐的形式补充。四、生长因子、前体和产物促进剂【生长因子】凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。【前体】前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接使微生物在生物合成过程中合

12、成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。【产物促进剂】指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。有些促进剂本身是酶的诱导物有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。培养基成分选择的原则1 菌种的同化能力和速度2 代谢的阻遏和诱导3 合适的碳、氮比例4 pH的要求培养基成分含量的确定（一）单因子实验（二）多因子实验：均匀设计、正交试验设计、响应面分析四、培养基设计时注意的一些相关问题 1原料及设备的预处理2原材料的质量3发酵特性

13、的影响 4灭菌技术第四章 生产菌种的扩大培养（一般掌握）【种子扩大培养】将保存在砂土管、冷冻(干燥)管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面，活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。【种子】经过上述种子扩大培养过程得到的纯种培养物称为种子。种子的制备过程：实验室阶段：所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂中这些培养过程一般都在菌种室完成。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，在工程上一般归为发酵车间管理。实验室种子制备：固体培养法适用于产孢子能力强、孢子发芽、生长繁殖快的菌种、液体培养法适用于产孢子能力不强【种子罐级数】制备种子需逐级扩大培养的次数。确定

14、种子罐级数需注意的问题种子级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。种子级数越大，工艺就越难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率。第二节种子质量的控制：1培养基 2培养条件 3培养时间1培养基：原材料质量：原材料质量的波动，起次要作用的是其中无机离子含量不同，2培养条件：温度&湿度影响种子质量的因素以及控制：孢子质量；培养基；培养条件；种龄；接种量【种龄】种子罐中培养的菌体在移入下一级种子罐或发酵罐之前的培养时间。接种量的大小决定于菌种在种子罐(发酵罐)中生长繁殖的

15、速度。较大的接种量可缩短罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前，并可减少杂菌的生长机会。但是过大接种量会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物。过小接种量会引起前期生长缓慢，延长培养时间，降低发酵罐的生产率。种子质量标准与控制：1菌种形态 2。生化指标 3。酶活力种子异常分析：1菌种生长发育过快或过慢 2菌丝结团 3菌丝贴壁第五章 微生物的代谢调节微生物代谢调节方式细胞透性调节；代谢途径区域化；代谢流向的调控；代谢速度的调控二.酶合成和酶活性的调节【重点背】(一)酶合成调节酶合成的调节是通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动

16、的调节是间接的、也是缓慢的。酶合成的调节主要有两种类型：酶的诱导和酶的阻遏。1. 酶合成的诱导：组成酶、诱导酶2. 酶合成的阻遏：【背！】在代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。阻遏的生理学功能是节约生物体内有限的养分和能量。（1）末端产物阻遏 （2）分解代谢物阻遏【激活】 在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。【反馈抑制】反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑 制。代谢系统的分子控制机制：1 基因调

17、控2 二组分调节系统【能荷】细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应提供能量的高能磷酸键的量度【能荷调节】细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者的比例来调节细胞的代谢活动，也称腺苷酸调节。第二节【！重点！】微生物代谢产物的过量产生 【作为大题准备】二.解除反馈调节1.降低末端产物浓度/选育营养缺陷型突变株营养缺陷型菌株中，由于合成途径中某一步骤发生缺陷，终产物不能积累，因此可以解除终产物的反馈调节。直线式的合成途径中，选育末端产物营养缺陷型的突变株，只能累积中间代谢物。分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使另一分支途径的末端产物得到累积。【渗漏缺陷型】是一种特殊的营养缺陷型，是遗

18、传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。渗漏缺陷型由于酶活力下降，不产生过量的末端产物 可以避开反馈 调节。但能合成微量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物。2、选育抗反馈调节的突变株在以积累末端产物为目的的发酵生产中， 如果代谢途径无分支，营养缺陷型突变株的应用并不普遍。因此提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。【抗反馈调节突变株】指反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除的组成型菌株，能分泌大量的末端代谢产物。l 抗反馈调节突变株的选育方法有两种：终产物结构类似物抗性突变

19、株、营养缺陷型回复突变株。l 【结构类似物】也称代谢拮抗物，指那些在结构上和代谢终产物(氨基酸、嘌呤、维生素等)相似的物质。l 【营养缺陷型】是通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。3、细胞膜透性突变株的选育细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。如果细胞膜通透性很强，则细胞内代谢物质容易往外分泌，降低胞内产物的浓度，直到环境中该物质的浓度达到抑制程度，胞内合成才会停止，这样大大提高产物的生成量。反之，细胞膜通透性较差，则胞内代谢产物难以分泌到胞外，使胞内终产物

20、浓度大量增加而引起反馈调节，影响终产物的积累。细胞膜透性突变株的选育原理是采取生理学或遗传学方法，提高细胞膜的通透性，使胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外，达到解除末端产物反馈调节作用的目的。通常有三种方法：1) 生物素缺陷型突变株生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸。因此，诱变筛选生物素缺陷型菌株，保证细胞的生长，控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。四生物化学方法1提供诱导2提供前体物质绕过反馈控制点3控制培养基成分4发酵与产物分离的过程耦合提高次级代谢产物产

21、量的方法：1. 防止碳分解代谢阻遏的发生2. 防止氮（碳）代谢阻遏的发生3. 选育抗生素抗性突变株4. 补加前体类似物5. 加入诱导类似物6. 筛选耐前体或前体类似物的突变株7. 筛选营养缺陷型的回复株第六章 发酵过程控制发酵过程控制的目的：有一个好的菌种以后，要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来，得到最大的生产率。发酵过程控制的研究层次：A. 初级层次B. 代谢及工程参数层次C. 生产规模层次发酵过程的主要控制参数：物理参数、化学参数、生物参数一、发酵过程pH变化的原因 重点：作分析题准备！1、基质代谢 发酵培养基中的糖代谢：快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺

22、乏，pH上升，是补料的标志之一。发酵培养基中的氮代谢：培养基中氮源过多时，导致pH上升。中间补料时，碱性物质添加量多，导致pH上升。培养基中添加的生理酸酸性物质被利用后pH会下降；生理酸碱性物质利用后pH会上升2、产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降；红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3、菌体自溶随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升。二、pH对发酵的影响 1. pH影响酶的活性。2. pH值改变细胞膜的透性3. pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离4. pH影响代谢方向 三、pH的控制1、调节好培

23、养基的pH2、在培养基中加入维持pH的物质3、通过补料调节pH 4、当补料与调节pH发生矛盾时，需加酸碱调pH 5、发酵的不同阶段采取不同的pH值第三节 温度变化及其控制【作大题准备！】嗜冷菌适应于020生长，嗜温菌适应于1543 生长，嗜热菌适应于3765 生长，嗜高温菌适应于65 以上生长二、温度对发酵的影响与控制（一）温度对发酵的影响1、温度影响微生物各种酶催化反应速率2、温度影响发酵方向3、温度影响发酵液的物理性质（二）发酵过程最适温度的确定最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。(一) 根据菌种

24、(二) 生长阶段的选择：高低高(三) 根据培养条件选择：通风差降温度；浓度稀降温度(四) 菌种的生长情况：长速快降温度；长速慢高温度发酵过程引起温度变化的因素：Q发酵=Q生物 +Q搅拌 - Q蒸发 - Q辐射第四节！ 发酵过程泡沫的形成与控制【泡沫】气体在少量液体中的粗分散体，属于气液非均相体系，泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。一、泡沫形成的原因1、通气搅拌 2、培养基配比与原料组成 3、培养基的粘度 4、菌种、种子质量 5、灭菌质量二、起泡的危害【重点】1、降低生产能力 2、引起原料浪费 3、引起染菌 4、影响细胞的呼吸消泡剂的种类：破泡剂：加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂。抑泡剂

25、：发泡前预先添加而阻止起泡的添加剂。如聚醚及有机硅等属于抑泡剂。常用消泡剂的种类：（1）天然油脂（2）聚醚类消泡剂（3）高碳醇（4）硅酮类对消泡剂的要求： 1在发酵液中不溶或难溶 2表面张力低于起泡物质 3与发酵液有亲和性 4与发酵液不发生化学反应 5挥发性小第五节 氧对发酵的影响氧的传递：传氧过程OTR 摄氧过程OUR氧的传递总推动力：气体主流与细胞内的氧分压之差气体主流与细胞内的氧浓度之差传氧过程的推动力：气体主流与液相主流内的氧分压之差气体主流与液相主流内的氧浓度之差双膜中的传氧推动力气体主流与气液界面上的氧分压的差 P-Pi (C*-Ci)气体界面上与液相主流中氧浓度的差 Ci-C传质

26、方程：Nv=kLa(C*-C)kLa越大，溶氧效果越好！影响供养的因素及调节搅拌速率、通气量Q、搅拌器的个数Ni、搅拌器的形状增加搅拌转速n、加大通气量Q、补充新鲜无菌的培养基、加入氧载体第六节 染菌和防治染菌对发酵的影响污染噬菌体：停产污染杂菌：大量泡沫、发臭、发酸种子期染菌；前期染菌（危害最大）；中期染菌；后期染菌（提前放罐）染菌情况分析：1单罐染菌：该罐本身问题，种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分滤器失效2多罐染菌：系统问题，空气过滤系统；补料分配站有渗漏或者灭菌不彻底3前期染菌：种子带菌、培养基灭菌不彻底4中后期染菌：补料料液灭菌不彻底菌种的防治！a) 防治种子带菌b) 防治设备渗漏c) 防治培养基灭菌不彻底d) 防治空气引起的染菌染菌后的发酵基必须经灭菌后才能放入下水道第七章 微生物反应动力学分类依据和类型判断因素特点第一型I产物形成直接与基质（糖类）