分子实验操作误区

1、常规分子生物学实验操作误区及经验浅析报告内容实验过程中存在的主要问题1 1Paul Steven实验操作的经验漫谈3 3实验室常用材料的成本4 4Paul Steven实验室存在的实验误区2 2实验记录的电子化管理5 5一 实验过程中存在的主要问题 实验效率低1、实验前材料准备不足，导致实验过程中、实验前材料准备不足，导致实验过程中临时配置或购买某些必须材料，导致延误；临时配置或购买某些必须材料，导致延误；2、实验理论、原理上把握不够，遇到问题、实验理论、原理上把握不够，遇到问题不懂得分析原因，单纯地重复相同的操作，不懂得分析原因，单纯地重复相同的操作，重复相同的错误。重复相同的错误。3、时间

2、安排不够紧凑，实验过程中出现大、时间安排不够紧凑，实验过程中出现大量的量的“等待等待”时间，不懂得合理安排利用，时间，不懂得合理安排利用，仅仅是在手机屏幕与手指之间白白流逝掉。仅仅是在手机屏幕与手指之间白白流逝掉。4、对实验不重视，操作过程中粗心随意，、对实验不重视，操作过程中粗心随意，不按照标准操作进行，导致实验失败又重新不按照标准操作进行，导致实验失败又重新进行。进行。5、实验操作不熟练，动作较慢，错误较多。、实验操作不熟练，动作较慢，错误较多。6、其他的一些原因。、其他的一些原因。一 实验过程中存在的主要问题 实验效率低 缺乏整体观念 文献把握不够1、对自己的研究需要做哪些实验、做到什、

3、对自己的研究需要做哪些实验、做到什么程度可以讲出一个故事或者可以发表什么么程度可以讲出一个故事或者可以发表什么样的论文，没有概念。样的论文，没有概念。2、实验没有针对性，特别是表型检测及拿、实验没有针对性，特别是表型检测及拿到突变体之后的实验，见别人在做什么就做到突变体之后的实验，见别人在做什么就做什么，没有根据自己的材料的特点设计有针什么，没有根据自己的材料的特点设计有针对性的检测实验。对性的检测实验。3、实验进展与原理把握不够，不能站在已、实验进展与原理把握不够，不能站在已发表的文献资料的原有平台上进一步提升自发表的文献资料的原有平台上进一步提升自己研究的高度和深度。己研究的高度和深度。4

4、、对自己的研究缺乏兴趣，缺乏信心，缺、对自己的研究缺乏兴趣，缺乏信心，缺乏成就感，不明白自己课题的意义，缺乏主乏成就感，不明白自己课题的意义，缺乏主动探索的精神。动探索的精神。一 实验过程中存在的主要问题 实验效率低 缺乏整体观念 文献把握不够 材料浪费严重1、酶制剂使用过多、实验操作中样品使用过、酶制剂使用过多、实验操作中样品使用过多；多；2、一次性塑料制品过多使用，导致白色污染；、一次性塑料制品过多使用，导致白色污染；3、实验操作不规范，导致大量的重复实验；、实验操作不规范，导致大量的重复实验；4、不懂得充分利用实验材料，如、不懂得充分利用实验材料，如KIX板显色板显色效果差了，可以用来转

5、板而无需直接丢弃。效果差了，可以用来转板而无需直接丢弃。二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：操作粗犷、过于随意、思想观念上的误区：操作粗犷、过于随意实验操作过于随意，对一切实验操作抱着无所谓的心理，不按照标准实验操作进行。 称量样品时随意，不擦拭样品匙，不考虑精确度，不称量样品时随意，不擦拭样品匙，不考虑精确度，不在意样品的洒落；取琼脂粉时不称量，在意样品的洒落；取琼脂粉时不称量，“大概大概”式添加。式添加。 做凝胶不按时收胶，凝胶在外面放置太久；电泳时不做凝胶不按时收胶，凝胶在外面放置太久；电泳时不根据自己的样品大小选择某种浓度的琼脂糖凝胶；电泳时电根据自己的样品大小选择某种浓度的

6、琼脂糖凝胶；电泳时电压过高；电泳液长期不更换。压过高；电泳液长期不更换。 制备感受态的菌直接从制备感受态的菌直接从-80-80冰箱或长期放置的平板冰箱或长期放置的平板上取出液体培养；制备过程中过多步骤没有在冰上操作；制上取出液体培养；制备过程中过多步骤没有在冰上操作；制备的感受态不进行验证就直接做转化实验。备的感受态不进行验证就直接做转化实验。 挥发性材料没有在室外通风处或者室内的通风厨中取挥发性材料没有在室外通风处或者室内的通风厨中取用。用。二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：操作粗犷、过于随意、思想观念上的误区：操作粗犷、过于随意实验操作过于随意，对一切实验操作抱着无所谓的心理，

7、不按照标准实验操作进行。 因粗心大意、不认真而导致的样品取错、溶液配方看因粗心大意、不认真而导致的样品取错、溶液配方看错、实验样品混淆（不认真做笔记）、加错试剂、看错实验错、实验样品混淆（不认真做笔记）、加错试剂、看错实验条件等等情况常有发生，不一而足。条件等等情况常有发生，不一而足。 不认真做笔记，无论是各种反应的体系、溶剂配方还不认真做笔记，无论是各种反应的体系、溶剂配方还是某些关键实验操作，不做笔记或者仅仅是写在临时的纸片是某些关键实验操作，不做笔记或者仅仅是写在临时的纸片上，之后就遗失或遗忘了。上，之后就遗失或遗忘了。 实验操作的台面实验操作的台面“脏乱差脏乱差”，只能在，只能在“夹缝

8、中夹缝中”进行进行实验操作，可能会使得很多未知的东西从桌面混入反应体系，实验操作，可能会使得很多未知的东西从桌面混入反应体系，影响实验。影响实验。 超净台灭菌开着风机、不关死玻璃窗、里面的材料过超净台灭菌开着风机、不关死玻璃窗、里面的材料过多，存在较多的死角。多，存在较多的死角。 不注意某些缓冲液的不注意某些缓冲液的pHpH值，感觉差不多就随意用。值，感觉差不多就随意用。二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：贪婪心理、思想观念上的误区：贪婪心理在实验中总觉得取用的材料不够，总认为多多益善，没有微量的概念，不能克服贪婪心理，不仅造成不必要的材料浪费，还会导致实验失败，浪费大量宝贵时间。

9、酶制剂取用过多。酶制剂取用过多。 菌体菌体PCRPCR时菌体取用过多。时菌体取用过多。 电泳时上样量过多。电泳时上样量过多。 做做PCRPCR时，模板量如总时，模板量如总DNADNA、总、总RNARNA添加过多。添加过多。 提取总提取总DNADNA或质粒时，总认为菌体越多越好。或质粒时，总认为菌体越多越好。分子生物学实验中的哲学：做人勿贪！分子生物学实验中的哲学：做人勿贪！二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：总怕染菌、思想观念上的误区：总怕染菌有些同学在做实验时总觉得超净台不够干净，总怕染菌，表现在以下几个方面。 超净台灭菌时间过长。超净台灭菌时间过长。 每次倒平板重新灭菌。每次倒平

10、板重新灭菌。 做感受态过程中样品离心过程中超净台反复灭菌。做感受态过程中样品离心过程中超净台反复灭菌。1 1、灭菌过程中产生的臭氧对人体有害、对马上进、灭菌过程中产生的臭氧对人体有害、对马上进行操作的样品细胞有害；行操作的样品细胞有害；2 2、紫外灯寿命缩短，作用变弱，原本、紫外灯寿命缩短，作用变弱，原本1818分钟可以分钟可以完成的灭菌，可能需要完成的灭菌，可能需要2525分钟甚至更长。分钟甚至更长。二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：侥幸心理、思想观念上的误区：侥幸心理侥幸心理是分子生物实验中大家最容易犯的一种错误，无论是有经验的还是没经验的同学，都不例外。大家总是想省时间、省步

11、骤以及对前一步实验的盲大家总是想省时间、省步骤以及对前一步实验的盲目自信是产生这种心理的主要原因。目自信是产生这种心理的主要原因。我们现用的绝多数分子生物学实验方法都是在分子生物学基础理论的基础上，辅以前人大量的实验经验而建立的，实验条件的细小改变，不一定会导致实验失败，但如果连续几个步骤都有细小的改变，积累起来常会出大错，而一旦出错了，往往不能够找到原因在哪里。所以，我们常常遇到一些莫名其妙的实验结果，无法用我们常识的知识去解释的结果。二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：侥幸心理、思想观念上的误区：侥幸心理按照标准规范认真做好每一步操作，该进行检测和验证的，尽量不要省略。不要盲目、

12、过分地相信经验！侥幸心理常有的表现：侥幸心理常有的表现： 质粒酶切后不电泳检测是否酶切完全；质粒酶切后不电泳检测是否酶切完全； 测序时样品质量不过关，侥幸认为应该可以测的出来；测序时样品质量不过关，侥幸认为应该可以测的出来； 感受态细胞制备完以后不检测转化效率、不检测是否感受态细胞制备完以后不检测转化效率、不检测是否染菌就直接进行实验材料的转化；染菌就直接进行实验材料的转化； 互补时将基因片段不连接到小载体上测序，而是直接互补时将基因片段不连接到小载体上测序，而是直接连接到互补的大质粒上测序；连接到互补的大质粒上测序； 提总提总DNADNA或质粒时不进活化的步骤，直接从或质粒时不进活化的步骤，

13、直接从-80-80冰箱冰箱取菌液体培养。取菌液体培养。 设计引物时忽略特异性比对的步骤，忽略二聚体等信设计引物时忽略特异性比对的步骤，忽略二聚体等信息的分析步骤。息的分析步骤。二 实验室存在的实验误区1、思想观念上的误区：不愿思考为什么、思想观念上的误区：不愿思考为什么很多同学在做实验时，容易出现两种情况：一是按照自己的意愿随意更改经典的实验操作，二是盲目相信往届毕业生的毕业论文中的实验方法。这两种情况的出现都是缺少必要的思考：该实验成败的关键点是什么？该实验成败的关键点是什么？别人为什么这么操作？别人为什么这么操作？如果不这么操作会出现什么后果？如果不这么操作会出现什么后果？哪些步骤是可以改

14、良的？哪些步骤是可以改良的？针对自己的具体实验，哪些步骤是不同的？针对自己的具体实验，哪些步骤是不同的？二 实验室存在的实验误区2、常见的不规范实验操作、常见的不规范实验操作A 不知道哪些药品需要灭菌，哪些不需要灭菌，如SDS溶液、NaOH溶液；不知道哪些可以高压灭菌，哪些需要低压灭菌。 PCR时不做正对照和负对照。 验证性PCR循环数过多。推荐推荐2525个循环。个循环。 PCR产物电泳上样量过多。推荐推荐1ul-2ul1ul-2ul。 电泳时很多泳道都加DNA marker。 胶回收用的凝胶过厚。推荐使用推荐使用80ml80ml的打胶。的打胶。 胶回收时用酒精灯烧切胶刀。推荐使用多个切胶刀

15、。推荐使用多个切胶刀。 胶回收用的凝胶中加入过多的GelRed。推荐推荐0.8ul 0.8ul GelRedGelRed/100ml/100ml凝胶。凝胶。 提质粒均用氯仿抽提。 PCRPCR验证、酶切验证用无需抽验证、酶切验证用无需抽提。提。二 实验室存在的实验误区2、常见的不规范实验操作、常见的不规范实验操作B 使用PCR仪时，随便更改他人的程序； 使用水浴锅后不关闭，特别是高温水浴； 使用各类仪器时，不看贴在旁边的使用操作说明。 倒平板时，不论各类平板，均倒13块。对于普通的转对于普通的转板、蓝白筛选等操作用的平板，推荐倒板、蓝白筛选等操作用的平板，推荐倒15-1715-17块板块板/3

16、00ml/300ml培培养基。养基。三 实验操作的经验 质粒的提取常见问题与对策u提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？ 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。经常会出现。超螺旋、缺口闭环、开环。经常会出现。2）两条带，超螺旋）两条带，超螺旋/闭环闭环/开环开环 任意两种。任意两种。3）一条带，超螺旋。）一条带，超螺旋。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。至

17、于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了，进行分子克隆的操作，构建载体。这随便那种情况都可以，不会影响后续实验。进行细胞转染和测序，必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）三 实验操作的经验 质粒的提取常见问题与对策u质粒大小如何在电泳中的鉴定？质粒大小如何在电泳中的鉴定？ 酶切将质粒线性化以后，才可以用酶切将质粒线性化以后，才可以用marker判断大小。判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与marker比较判断大小。 商品化的质粒估计应该大部分是超螺旋构像。 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小。三 实验操作的经验 质粒的提取常见问题与对策u在保存或抽提在

18、保存或抽提DNA过程中，一般采用什么缓冲过程中，一般采用什么缓冲液？为什么？液？为什么？ 一般采用一般采用TE缓冲液。在基因操作实验中，选择缓冲液缓冲液。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。采用干扰作用。采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于）的缓冲系统，由于缓冲液是缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存在提取或保存DNA时，大都采用时，大都采用Tris-HCl系统，而系统，而TE缓缓冲液中的冲液中的EDTA更能稳定更能稳定

19、DNA的活性。的活性。 如下游有特殊需要也可用水保存如下游有特殊需要也可用水保存DNA。我们一般直接。我们一般直接进行下一步实验操作，无需考虑样品的存储问题，为进行下一步实验操作，无需考虑样品的存储问题，为避免可能带来的各类离子的干扰，常选用灭菌的去离避免可能带来的各类离子的干扰，常选用灭菌的去离子水溶解子水溶解DNA。三 实验操作的经验 质粒的提取常见问题与对策u抽提质粒抽提质粒DNA时，用酚、氯仿、异戊醇有什么作用？时，用酚、氯仿、异戊醇有什么作用？ 酚与氯仿是非极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白酚与氯仿是非极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯

20、仿挤去而变性。经过离心，变性质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，沉淀在水相下面与水相中的蛋白质的密度比水的密度为大，沉淀在水相下面与水相中的DNA分开。分开。 酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。酚的变性作用大，酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带

21、走DNA。所以在抽提过程。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。为了混合均匀，必须剧烈振荡中，混合使用酚与氯仿效果最好。为了混合均匀，必须剧烈振荡容器，易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇容器，易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用能降低分子表面张力，能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变

22、性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。三 实验操作的经验 质粒的提取常见问题与对策u在提取质粒时，是否可以不抽提蛋白质？在提取质粒时，是否可以不抽提蛋白质？ 我们常用的质粒或者重组质粒，基本都是在DH5这类蛋白质较少的大肠杆菌中的，如果是需要送样测序，或者酶切后进行连接操作，建议用酚：氯仿进行抽提，如果仅仅是为了酶切验证重组质粒，则无需进行抽提。 在加完溶液I

23、II后，离心取上清，再次离心，重新取上清加无水乙醇沉淀。两次离心可以去除绝大部分的不溶性蛋白质，在最后所得的质粒DNA中基本没有不溶性的物质出现。这种没有抽提的质粒完全可以满足胶回收、酶切验证等实验的要求。三 实验操作的经验 质粒的提取常见问题与对策u在使用碱裂解法提取质粒时，加溶液在使用碱裂解法提取质粒时，加溶液III离心后离心后出现一层白色的蛋白质漂浮物怎么办？出现一层白色的蛋白质漂浮物怎么办？ 两种解决方法：一是在加完溶液两种解决方法：一是在加完溶液III后放在后放在-20冰冰箱冰上箱冰上10分钟，可以有效减少和杜绝蛋白质漂浮分钟，可以有效减少和杜绝蛋白质漂浮物；二是将这些上清液取出后再

24、次离心，再次取物；二是将这些上清液取出后再次离心，再次取上清，基本可以完全去除这些蛋白质漂浮物。上清，基本可以完全去除这些蛋白质漂浮物。三 实验操作的经验 其他方面的实验经验其他方面的实验经验 制备感受态的菌每次从制备感受态的菌每次从-80冰箱取出活化，活化冰箱取出活化，活化后再转接一次，然后再进行液体培养。后再转接一次，然后再进行液体培养。 菌体菌体PCR，对于大肠杆菌只需用尖头的牙签碰一点，对于大肠杆菌只需用尖头的牙签碰一点点菌体便可。点菌体便可。 菌体菌体PCR的体系，推荐的体系，推荐10ul的体系，比的体系，比20ul的体系的体系减半。减半。 酶切的样品如重组质粒，不要一次性全部切完，

25、酶切的样品如重组质粒，不要一次性全部切完，要留一部分防止此次酶切失败而又要重新制备材要留一部分防止此次酶切失败而又要重新制备材料。料。三 实验操作的经验 其他方面的实验经验其他方面的实验经验 连接时，可以使用连接时，可以使用10ul的连接体系，使用不超过的连接体系，使用不超过0.5ul的连接酶，不仅可以比使用的连接酶，不仅可以比使用5ul连接体系省酶，连接体系省酶，还可以在转化步骤有多余的连接体系备用。还可以在转化步骤有多余的连接体系备用。 做转化时可以使用做转化时可以使用5ul的连接液转化，剩余的连接的连接液转化，剩余的连接液放到液放到-20冰箱暂存；如果因某些不确定性因素冰箱暂存；如果因某

26、些不确定性因素导致转化失败，可以用剩余的连接液再次转化。导致转化失败，可以用剩余的连接液再次转化。 转化时如果转化液不完全涂布的话，最好剩余的转化时如果转化液不完全涂布的话，最好剩余的转化液放到转化液放到4冰箱保存，直至确定本次转化可以冰箱保存，直至确定本次转化可以挑选到自己所需的转化子；如果没有获得或者因挑选到自己所需的转化子；如果没有获得或者因某些因素导致本次涂布失败，可以用剩余的转化某些因素导致本次涂布失败，可以用剩余的转化液重新涂布。液重新涂布。三 实验操作的经验 其他方面的实验经验其他方面的实验经验 做做PCR时时8连管的标记连管的标记 做蓝白筛选时，做蓝白筛选时，37下培养下培养17小时以上便可显色。小时以上便可显色。显色后将平板置于显色后将平板置于4两小时，蓝色会加深。两小时，蓝色会加深。 用试剂盒提取质粒或者纯化用试剂盒提取质粒或者纯化DNA、胶回收时，最后、胶回收时，最后一步加水或一步加水或TE Buffer溶解和收集溶解和收集