食品安全检测 第二章样品前处理技术

1、第二章 样品前处理技术样品前处理：样品的制备和对样品中待测组分进行提取、净化和浓缩的过程。在整个食品安全性的检测分析中，70%80%甚至更多的时间用在样品的前处理上，而给实验带来的误差有60%以上来自样品的前处理。样品前处理的目的就是浓缩被测物质、消除基质干扰、保护仪器、提高方法的准确性、精密度、选择性和灵敏度。主要的样品前处理方法：1、超声萃取；2、微波萃取；3、液固萃取；4、加速溶剂萃取；5、超临界萃取；6、固相萃取；7、固相微萃取；8、基质分散固相萃取；9、液液萃取；10、微量化学法技术；11、液液萃取；12、柱层析样品制备的基本要求1、食品危害残留物质分析,特点：基体复杂；目标化合物检

2、测限量越来越严格；某些危害残留物质在食品样品中存在的浓度极低；各目标化合物的性质差异较大；可能同时存在多种组分。2、评价前处理方法是否合理,应考虑的因素：操作是否简便、省时；被测组分的回收率是否高；成本是否低廉；对人体及环境是否产生影响。萃取技术萃取：用有机溶剂等方法把被测物从试样中提取出来，净化后供测定使用。萃取技术要求溶剂尽可能选择性溶解残留危害物质，而不是不溶解和少量溶解食品基体，萃取效果的关键是溶剂的选择，残留危害物质提取回收率的大小直接决定整个分析步骤的精确度。分类：1、液固萃取；2、超声萃取；3、微波萃取；4、液液萃取；5、加速溶剂萃取；6、超临界萃取1、萃取技术超声萃取超声萃取（

3、SAE）就是在溶剂萃取过程中引入超声波，提高溶剂萃取的过程。基本原理：空化效应、热效应、机械作用。高频声波空化作用产生的极大压力造成生物细胞及整个生物体破碎，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解。影响SAE的因素：超声波的强度、频率、提取时间、提取溶剂等。􀁺SAE的操作方法：将样品和溶剂放于密闭的容器中，置于一定能量的超声波水浴中，数秒后拿出，再放入、拿出2、萃取技术微波萃取微波萃取（MAE）就是在溶剂萃取过程中引入微波，加速溶剂萃取的过程。基本原理：（1）微波辐射能穿透萃取介质到达物料内部，物料吸收微波能，内部温度迅速上升，细胞内部压力增大而破裂；（2）

4、微波所产生的电磁场，加速被萃取成分向萃取溶剂界面的扩散速率。微薄萃取工艺流程：微波萃取的设备：微波萃取罐、连续微波萃取线。微波提取成套生产线工艺组成流程：粉碎、预处理、微波提取、料液分离、浓缩系统等五个环节。MAE的影响因素：萃取溶剂、萃取温度、时间、溶剂体积、试样中的水分或湿度、基体物质等。微波提取优点：微波辅助提取是里外同时加热。没有高温热源，消除了热梯度，有效地保护功能成分；由于微波可以穿透式加热，提取的时间大大节省；微波能有超常的提取能力，大大简化工艺流程。微波提取没有热惯性易控制，所有参数均可数据化；微波提取物纯度高，可水提、醇提、油提；溶剂用量少（可较常规方法少5090）；微波设备

5、是用电设备，不需配备锅炉，无污染、安全、属于绿色工程；生产线组成简单，节省投资。3、萃取技术加速溶剂萃取加速溶剂萃取（ASE）就是采用常规溶剂在高温高压条件下进行自动萃取的技术。􀁺 基本原理：（1）提高温度（50200 ）能加速溶质分子的解析动力学过程，减小解析过程的活化能；降低溶剂的粘度，减小溶剂进入样品基体的阻力；增加溶剂进入样品基体的扩散；降低溶剂和基体样品的表面张力，有利于萃取物与溶剂的接触。（2）升高压力（10.320.6 MPa）使溶剂的沸点升高；可保证易挥发性物质不挥发；在压力下可快速充满萃取池。4、萃取技术超临界流体萃取超临界流体萃取（SPE）是以超临界流体作

6、为萃取剂，把所需要的组分从复杂的样品中提取出来的一种分离技术。超临界流体性质：超临界流体的物理性质介于气体与液体之间。超临界CO2的特点：1、在超临界状态下，流体具有气液两相的双重特点；2、密度对温度和压力的变化十分敏感；3、来源广，价格低廉；4、不燃烧、不助燃、操作安全；无毒、易挥发、操作后残留物少；5、对设备无腐蚀；临界温度低。基本原理：超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行。 在萃取的过程中，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质充分接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来；然后通过改

7、变温度或压力使超临界流体变成普通气体，被萃取物质析出，从而达到分离提纯的目的。超临界萃取条件的选择：原料前处理（粒度、水分含量等）；萃取压力；萃取温度；流体的流量；改性剂；萃取时间；分离条件（温度和压力）等。超临界萃取的特点：萃取和分离合二为一，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂，操作方便，萃取效率高，而且能耗较少，节约成本；压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数，因此工艺流程短、耗时少；超临界流体的极性可以改变，一定温度条件下，只要改变压力或加入适宜的夹带剂即可提取不同极性的物质，可选择范围广；SFE全过程不用有机溶剂，萃取物绝无残留溶剂，无污染；CO2容易取得，且在生产过程中循环使用，真正

8、实现生产过程绿色化，降低生产成本；萃取温度低，可以有效保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发性、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。净化技术􀁺1、液液萃取；2、固相萃取；3、固相微萃取；4、基质分散固相萃取；5、柱层析(凝胶、离子交换、亲和、分配、吸附柱层析等）1、净化技术固相萃取固相萃取（SPE）是在液液萃取和液相色谱的基础上发展起来的一种的萃取技术。􀁺 基本原理：利用高效高选择性的固体吸附剂（固定相）将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体和干扰化合物分离，然后用合适的洗脱液（另一种体积较小的溶剂）进行洗脱或加热解吸，达到分离和富集目标化合物的目的

9、。􀁺固相萃取的实质就是一种液相色谱分离，是一个包括液相和固相的物理萃取过程。分离模式也与液相色谱相同，分为正相、反相、离子交换等。固相萃取的类型：石墨碳(反相)-SPE、离子交换树脂-SPE、金属配合物吸附剂-SPE、键合硅胶-SPE、聚合物吸附剂-SPE、免疫亲和吸附剂-SPE、分子嵌入聚合物-SPE等。操作步骤：吸附剂的活化；加样；萃取；淋洗；洗脱吸附剂的活化：在样品萃取之前要用适当的溶剂淋洗萃取柱，使吸附剂保持湿润；加样：加入一定体积的被处理样品溶液，使其完全通过吸附剂；淋洗：用溶剂强度较弱的溶剂选择性洗去部分杂质；洗脱：用溶剂强度较强的溶剂洗脱被测物。SPE的特点：可

10、以获得高的回收率和高的富集倍数；减少了高纯有机溶剂的用量，减少了对环境的污染，同时减少了有机溶剂中的杂质对被测分析物的影响；无相分离操作，避免了乳化影响，易于收集分析物组分；操作简单、快速、易于实现自动化；但目标化合物的回收率和精密度低于液液萃取。2、净化技术固相微萃取􀁺固相微萃取（SPEM）是在固相萃取基础上发展起来的新型萃取分离技术，是一种基于液固吸附平衡的样品富集方法，属于非溶剂型选择性萃取。􀁺基本原理：利用待测物在样品基质与萃取相之间的非均相平衡。将聚合物涂层纤维浸润在水相萃取物中，或保留在样品顶空使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层（顶空固

11、相微萃取），待吸附平衡后，涂层纤维/进样头立即转移到GC或HPLC的进样口。SPME的萃取模式主要有三种：1、直接法，即将涂层纤维保留在样品中，主要用于半挥发性的气体液体样品萃取；2、顶空法，即将涂层纤维放置在样品顶空中，主要用于挥发性固体或废水水样萃取；3、膜方法，将涂层纤维放在经过微波萃取及膜处理过的样品中，主要用于难挥发性复杂样品的萃取。样品萃取：将SPME针管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中；推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头可以浸入水溶液中（浸入方式）或置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间大约2-30min；缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。􀁺GC分析：将SPME针管插入G

12、C仪进样口；推手柄杆，伸出纤维头，热脱附样品进色谱柱；缩回纤维头，移去针管。HPLC分析：􀁺将SPME针管插入SPME/HPLC接口解吸池，进样阀置于“Load”位置；􀁺推手柄杆伸出纤维头，关闭阀密封夹；􀁺将阀置于“Inject”位置，流动相通过解吸池洗脱样品进样；􀁺阀重新置于“Load”位置，缩回纤维头，移走SPME针管。影响SPEM的因素：涂膜纤维性能、萃取时间、离子强度、解吸附时间和温度等。􀁺SPEM的特点：集采集、浓缩于一体，简单方便，不造成二次污染。与液液萃取或固相萃取相比，具有操作时间短、样品

13、量少、无需萃取溶剂、适于分析挥发性和非挥发性物质、重现性好等优点。免疫检测技术免疫检测技术是以抗原抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析检测技术。在此基础上结合一些生化或物理方法作为信号显示或放大系统即可建立免疫测定法。即抗原可以特异性地与抗体结合，通过抗原抗体的特异性识别反应来进行检测。抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质，抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是能与抗体结合的物质，能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白。􀁺抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（Ig），与免疫测定有关的主要为IgG和IgM。抗原与抗体间的

14、反应是依靠局部的分子间作用力结合的。主要有四种：氢键、范德华力、静电和疏水相互作用。抗原抗体结合反应具有高度特异性、交叉反应和可逆性。抗原抗体结合的理化特性主要表现为由亲水胶体转化为疏水胶体。一个成功的免疫学测定法必须具备的3个要素：性能优良的抗体、灵敏而专一的标记物和高效的分离手段。 现有的免疫测定方法很多，按照不同的方法分类。经典的免疫测定法不需要标记物；标记免疫测定法分为放射性标记测定法和非放射性标记测定法，按反应介质分为均相和非均相免疫测定法。经典免疫测定法在食品安全卫生分析上较少采用，而灵敏度高的非均相、非放射性标记免疫测定法种类繁多，发展较快、检测灵敏度高，使用范围广。2、免疫学检

15、测技术酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）的基础是抗原与抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性;结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。材料和试剂：完整的ELISA试剂盒包括：已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）、酶标记的抗原或抗体（结合物）、酶催化的底物、阴性对照样品和阳性对照样品（定性检测）、参考标准品和控制血清（定量测定）、结合物及标本的稀释液、洗涤

16、液和酶反应终止液。类型：双抗体夹心法测定抗原；双抗原夹心法测抗体；间接法测抗体；竞争法测抗体；竞争法测抗原。3、免疫学检测技术放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法（RIA）是将放射性同位素检测的高度敏感性与免疫反应的高度选择性相结合的一种免疫标记检测技术。RIA的基础是待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合。基本原理：待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物和寄生虫抗原、激素、酶或药物等），标记抗原是将已知的上述物质标记上同位素（食品安全快速检测中最常用的是3H和14C），具有示踪作用。这两种抗原具有共同的决定簇，都能与相应的抗体发生特异的结合。将标记抗原（Ag*）和未标记抗原（A

17、g）与特异性抗体（Ab）相混合，两者竞争与抗体结合结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物。采用分离技术（如用活性炭）将Ag*-Ab、Ag-Ab复合物（B）和游的Ag、Ag*（F）分离，测定B和F的放射活性，绘制B/F对Ag量的关系曲线。测定时需先用一系列已知浓度的未标记抗原和一定量标记抗原及抗体相混合，然后测出标准浓度抗原参加下的标记抗原抗体复合物的放射结合率（B/F），绘出标准竞争抑制曲线。试验时，在相同条件下，根据待测抗原的放射性结合率，在标准曲线上即可查得相应的抗原含量.4、免疫学检测技术PCRPCR又称聚合酶链式反应（PCR），即通常说的PCR体外扩增技术，又称无细胞克隆技术，是一种对

18、特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法，该方法操作简便，可使微量的特定DNA片段在几小时内迅速扩增至几百万倍，目前已在分子生物学、生物医学等领域得到了广泛的应用。依据DNA摸板的特性，模仿体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工合成的寡核苷酸为引物，以四种脱氧核苷酸（dNTP）为底物，利用热稳定的聚合酶延的方向掺入核苷酸来特异地扩增DNA片段。􀁺PCR反应过程通常由2040个循环组成，每个循环由高温变性低温复性适温延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：加热9395，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA变性，解离成单链，作为扩增的模板；模板

19、DNA与引物的复性：温度降至55左右，引物与单链DNA模板的互补序列特异性地结合引物的延伸：在适宜的温度条件下，DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-复性-延伸三过程，DNA扩增量呈指数上升最终的扩增量可用NN（E）n计算。理论上，单一拷贝基因经过40个循环，产物的拷贝数为1012。􀁺注：扩增遵循酶促反应动力学原理。第三章农药残留量的检验食品中农药残留的分类概1、农药􀁺农药：是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草

20、和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。􀁺分类：按用途分：杀（昆）虫剂、杀菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、落叶剂和植物生长调节剂等; 按化学组成分：有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机氯、有机砷、有机汞等.2、农药残留农药残留：是指农药使用后残存于生物体、食品（农副产品）和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。当农药过量或长期施用，导致食物中农药残存数量超过最大残留限量（MRL）时，将对人和动物产生不良影响，或通过食物链对生态系统中其他生物造成毒害。我国近年生产的高毒杀虫

21、剂主要有甲胺磷、甲基对硫磷氧乐果、久效磷、对硫磷、甲拌磷等，因而，这些农药目前在农作物中残留最严重。3、食品中农药残留的来源：1、施用农药对农作物的直接污染；􀁺2、农作物从污染的环境中吸收农药；􀁺3、通过食物链污染食品；􀁺4、其他来源：粮库内使用熏蒸剂等对粮食造成的污染；禽畜饲养场所及禽畜身上施用农药对动物性食品的污染；粮食贮存加工、运输销售过程中容器、车船的混装；事故性污染，用错农药品种和剂量，误食等。传统的农药残留量分析技术的一般过程常用的农药残留分析样品前处理技术􀂋1、样品采集:(以蔬菜农药残留量检测的样品采集为例)

22、采集对象：蔬菜基地：上市前的蔬菜市场：正在售卖的蔬菜检测部位:大白菜、小白菜(去根、去外测菜叶)；萝卜、胡萝卜(取叶、根);番茄、茄子等(去蒂)。􀂋2、提取方法：萃取分离法、索氏抽提法、微波加热提取法、超声辅助提取法等(传统技术)。􀂋3、净化方法：液液分配法、吸附柱色谱法、磺化法、凝结沉淀法、冷冻法、薄层色谱法等。􀂋4、浓缩方法：自然挥发法、吹气法、真空旋转蒸发法。农药残留分析样品前处理新技术：固相萃取技术；固相微萃取技术；超临界流体萃取技术；基质固相分散萃取技术；凝胶渗透色谱技术；免疫亲和色谱技术；衍生化技术等农药残留检验技术概述：目前我

23、国农药残留检测方法主要有两大类: 农药残留色谱检测法和快速检测法。色谱检测法是为农药残留执法提供依据。农药残毒快速检测法主要是防止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留要重超标的蔬菜和水果流入市场。常用的色谱检验技术：薄层色谱法、纸色谱、气相色谱、液相色谱法、GC-MS联用技术。1 、薄层色谱（TCL）：半定量和定性检测技术。􀂋TCL不需要特殊设备和试剂，方法简单、快速、直观、灵活，TCL除用特殊的显色剂观察斑点颜色和用Rf定性外，与其它技术联用，不仅可以定性，而且可以对样品中待分离的一种或多种成分进行定量分析。但是灵敏度不高，多把它作为分离手段。可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的

24、分离和筛选。2、气相色谱技术（GC）􀁺基本原理：残留的农药经有机溶剂提取并经净化、浓缩后，注入气相色谱仪、气化后在载气携带下于色谱柱中分离，并由检测器检测。􀁺GC是应用最多的方法，占有关色谱法报道的70%以上。气相色谱法具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点。易气化，气化后又不发生分解等的农药均可采用GC检测。􀁺用于GC的检测器主要有FID、ECD、NPD、TCD、FPD、MSD等。3、高效液相色谱技术（HPLC）􀁺HPLC可以分离检测极性强、分子量大及离子型农药，尤其对不易气化或受热易分解的化合物更能显示出它的突

25、出优点。􀁺常用的液相色谱柱有8柱、18柱、氨基柱、硅胶柱等，检测器有紫外检测器、荧光检测器等。􀁺 近年来，HPLC的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度现已成为农药残留检测不可缺少的重要技术，其缺点是溶剂消耗量大，检测器种类较GC少，灵敏度不如GC高。4、气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）􀁺GC-MS是将气相色谱仪和质谱仪串联成为一个整机使用的检测技术。它既具有气相色谱高分离效能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点，可达到同时定性定量的检测目的。用于农药和药物残留量检测工作，特别是应用于农药和药物代谢物、降解物的检测和多残留检测等具有突

26、出的特点。5、液相色谱质谱联用技术（LC-MS）􀁺 LC-MS将气相色谱仪和质谱仪串联成为一个整机使用的检测技术。LC-MS可以首先将混合物分离为单一组分，之后再用质谱检测器进行检测。如此过程不仅可以得到更有意义的质谱数据，而且可以在一定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，优化质谱检测信号。液质联用系统是残留分析理想的检测手段。对于需要高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的多残留快速筛选工作而言，液质联用无疑是首选的最佳检测手段农药残留量检验新技术：超临界流体色谱；毛细管电泳技术；直接光谱技术（近红外光谱分析、荧光光谱分析）；酶联免疫吸附试验技术；酶抑制技术；生物传感器技术；实验

27、室机器人1、超临界流体色谱超临界流体色谱（SCF）是以超临界流体为流动相的色谱分离检测技术。􀁺特点：超临界流体黏度小、传质阻力小、扩散速度快，其分离能力和速度可与GC相比；其密度、溶解力和速度可与HPLC相比；且超临界流体的物理、化学性质都是密度的函数。􀁺超临界流体色谱仪的工作流程：SFC的部件组成与HPLC很相似，包括流动相输送系统（泵、流量缓冲器和混合柱等）、色谱分离系统（进样器、色谱柱和柱温箱等）、检测系统（检测器等）和计算机软件。SCF以超临界流体作为流动相，它的密度随压力增加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的提高，同时可缩短淋洗时间。在SFC

28、中采用程序升密度相对于GC中的程序升温和HPLC中的梯度洗脱，并且SFC可以与大部分GC和HPLC的检测器相连，许多在GC上需经过衍生化才能分析的农药，都可以用SFC直接测定。2、毛细管电泳（CE）毛细管电泳（CE）是以高压（可达30 kV）下产生的强电场为驱动力，以小内径的石英毛细管（常用25100m）为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异实现分离。􀁺特点：CE是电泳技术与色谱技术的完美结合，分离速度快，分离效果好，仪器结构比较简单。􀁺CE根据分离模式的不同，可分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳、胶束电动毛细管色谱和毛细管电

29、色谱。农药残留快速检测技术传统的农药残留量分析技术的优缺点：农药残留快速检测方法1、生化检测法（胆碱酯酶抑制法）：速测卡、酶片、速测仪、生物传感器等2、免疫分析法（抗体抗原反应）：ELISA试剂盒、免疫传感器等3、活体生物测定法（发光细菌或敏感性家蝇）速测卡法：速测卡法（纸片法）是国家标准快速检验方法蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测。1、测定范围：由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法，适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。 2、原理：3、试剂：速测卡: 固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯的纸片；pH7.5缓冲溶液：分别取15.0g Na2HP

30、O4·12H2O与1.59g KH2PO4，用500mL蒸馏水溶解。4、仪器：常量天平；有条件时配备37±2恒温装置；有条件时配备专为速测卡而设计的“农药残留速测仪”和超声波提取器。5、分析步骤(1)表面测定法（粗筛法）：1)擦去蔬菜表面泥土，滴23滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。2)取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。放置10min进行预反应，有条件时在37恒温装置中进行。注：预反应后的药片表面必须保持湿润。3)将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min。4)每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。（同时进行）思考：空白对照卡不变蓝的原因

31、？（2）整体测定法：1)选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。2）取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min进行预反应。注：预反应后的药片表面必须保持湿润。3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min。4）每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。思考：蔬菜剪得太碎对试验结果有怎样的影响？6、结果判定和表述：检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）和未抑制（阴性）来表示。8、速测卡法检测注意事项􀁺 葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇等含有对酶有影响的

32、植物次生物质的样品，应采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法；对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。􀁺当温度低于37时，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长。延长时间的确定，以空白对照卡用手指捏3min时可以变蓝，且样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。􀁺红色药片与白色药片叠合反应时间以3min为准。速测卡对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会造成对照和测定药片不变蓝。酶抑制率法：酶抑制率（分光光度法）是国家标准快速检验方法蔬菜中有机磷和

33、氨基甲酸酯类农药残留量快速检测。1、测定范围：由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法，适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。􀁺 2、原理：3、试剂􀁺 pH8.0缓冲溶液：取11.9mg无水磷酸氢二钾与3.2mg磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。 显色剂：取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，在4冰箱中保存。􀁺底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱加8.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4冰箱中保存，保存期不超过一周。􀁺乙酰胆碱酯酶：根

34、据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，但吸光度值应控制在0.3以上。可选用以上试剂制备的试剂盒。4、仪器：常量天平；37±2恒温水浴或恒温箱；分光光度计或农残快速测定仪5、分析步骤样品处理：选取有代表性的蔬菜，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取1g放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡12min，倒出提取液，静置35min，待测。对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37放置15min以上（每批样品的控制时间应一致，30min）。加入0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸

35、光度变化值或仪器记录值A0；样品测试：于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值At。思考：样品处理对试验结果可能有哪些影响？6、结果处理（1）结果计算􀁺Ac对照溶液反应3min吸光度的变化值；􀁺At样品溶液反应3min吸光度的变化值。（2）结果判定：当蔬菜样品提取液对酶的抑制率50%时，表明蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品检测为阳性结果，则检验需要重复两次以上，并可用其他方法进一步具体确定农药品种和含量。7、酶抑制率法的使用注意事项􀁺葱、蒜、胡萝卜、生姜、韭菜及番茄汁液等，

36、含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，不要剪得太碎，浸提时间不要太长，必要时可采取整株（体）蔬菜浸提法。对一些含叶绿素较高的蔬菜也是如此。􀁺 当温度条件低于37时，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化A0值在0.3以上，即可往下操作。且样品放置时间应与空白对照溶液放置的时间一致。􀁺当吸光度过大无法读取时，说明测定溶液浑浊有干扰。􀁺 乙酰胆碱系统是2003年卫生部批准了国家标准GB/T 5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检

37、测方法时开始使用的，标准规定蔬菜农残检测用乙酰胆碱系统取代丁酰胆碱（NY/T 448-2001）。8、速测卡法与酶抑制率法的比较􀁺共同点：两种方法的原理、缓冲（提取）溶液pH值、测定中的干扰物质和排除方法基本相同。􀁺速测卡法检出限：在使用速测卡法检出蔬菜样品为农药阳性时，即可视为有机磷或氨基甲酸酯类的农药已超标。在有条件的单位，可用气相色谱仪或质谱仪对阳性试样进行进一步的实验。􀁺酶抑制率法的选择：在气相色谱分析仪还未问世时，对有机磷类农药的检测即采取了酶抑制率法，只是由于当时酶的纯度不够高、灵敏度较低、酶试剂保存期短、及方法不能区分出具体的

38、农药而被气相色谱法所取代。而今用其作为快速分析则恰到好处。只是现在酶试剂的质量还应进一步提高，有效保存期应设法延长。因此，在实验前，必需测试酶的活性，达到要求后才能往下进行。􀁺相比之下，速测卡法操作简单、使用方便，常温下试药的有效期可达一年；酶抑制率法操作要烦琐些，夏天时，试药需要冷藏运输，但以数字形式读取数据，较为直观。酶抑制法1、方法特点：检测对象广泛（有机磷农药和氨基甲酸酯类农药），且适用于一些基质复杂的样品，如：蔬菜、水果、茶叶和肉等。灵敏度高。适用的温度范围广，在1535下可直接测定，无需其它温控设施。比色波长为600nm。样品测定时，无需设置对照。测定结果表示简单

39、，无需计算抑制率，由吸光度直接判定。2、原理：3、仪器和试剂常量天平；分光光度计。􀁺缓冲液：pH 7.71的磷酸盐缓冲液（适用于蔬菜等的检测）；pH 8.0的Tris盐酸缓冲液（适用于茶叶、肉等的检测）。􀁺底物溶液：2%碘化硫代乙酰胆碱水溶液。􀁺显色剂：0.04%的2,6-二氯靛酚水溶液。􀁺氧化剂：0.5%次氯酸钙水溶液。􀁺还原剂：10%亚硝酸钠水溶液。􀁺胆碱酯酶液：0.2g胆碱酯酶酶粉溶于10mL缓冲液中。􀁺脱色剂：活性炭。􀁺丙酮：分析纯。h

40、8698;碳酸钙：分析纯。4、分析步骤5、结果判定：6、注意事项􀁺 若室温低于15，建议使用30水浴，即提取液要在水浴中预热，并且加入酶液后的试管也需要放置于水浴中，同时室温也应控制在20以上。􀁺速测试剂对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用卫生杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会对检测结果带来影响。􀁺分光光度计长期处于开机等待状态时，应将比色室盖打开，避免仪器感光元件因过度疲劳而损坏。方法的比较􀁺 思考题：根据蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学测定的课程实验，设计速测卡法和酶抑制率法快速检测蔬菜中农药残

41、留量的实验。分析所有可能的影响因素。第四章 兽药残留量的检验兽药与兽药残留兽药：预防和治疗畜禽疾病的药物；促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质；也包括一些化学的、生物的动物保健品或饲料添加剂。􀂋 兽药残留：是“兽药在动物源食品中的残留”的简称，是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。兽药残留产生的原因：非法使用违禁或淘汰药物；不遵守休药期规定；滥用药物；违背有关标签的规定；屠宰前用药。兽药残留的类型：1、抗生素类：氯霉素、四环素、土霉素、青霉素等。􀂋2、磺胺类：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等。􀂋

42、;3、呋喃类：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。􀂋4、激素和-兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等。􀂋5、抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。兽药残留的危害：毒性损害；引发过敏反应；导致病原菌产生耐药性；破坏微生态平衡，导致二重感染；致畸、致癌、致突变作用；影响生态环境；影响畜牧业的发展。兽药残留的分析方法：兽药残留的检验分析方法包括筛选、检测和确认。筛选方法：微生物检验（微生物抑制试验）免疫法（免疫检测试剂盒）检测和确认方法：理化检验技术（GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等）。水产品中氯霉素的检验􀂋

43、;氯霉素（CAP）是由委内瑞拉链丝菌产生的一种光谱抗生素。CAP对造血系统有毒性反应，是一种禁用药。􀂋氯霉素的检测方法主要有：微生物筛选法、GC（ECD）、HPLC（UV）、GC-MS、GS-MS/MS、ELISA以及RIA等。对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测*竞争性ELISA的基本原理（以竞争性ELISA法测定氯霉素抗原为例）：酶标抗原与样品或标准体中的非标记抗原（氯霉素）具有相同的与抗体结合的能力，两者竞争与固相载体包被的抗体结合。洗涤多余的酶标抗原，加酶反应的底物显色后根据颜色的深浅进行定量。􀂋在整个反应当中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越

44、淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则显色越深。竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量的实验设计：实验方案设计：为了达到某种特定的目的，使用多种实验试剂、仪器和设备，按照可行的实验原理，列出实验的操作顺序、确定各步骤的操作方法，列出实验必须的注意事项。1）实验目的：进一步学习酶联免疫试验法的基本原理和实验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉中氯霉素含量的基本原理、实验方法和结果的分析。2）实验原理3）主要试剂：氯霉素酶联免疫检测试剂盒。氯霉素检测试剂盒的组成：微量测试孔；氯霉素标准溶液；10倍浓缩萃取稀释液；10倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标记物；底物溶液；反应终止液。4）主要仪器：简易的萃取设备、氮

45、吹仪、离心机、酶标分析仪。4、实验步骤（1）实验准备：从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底物溶液及微量测试孔条置于室温下回温30 min。配制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别按1:9的比例稀释。（2）样品制备：将3g虾肉剪碎后放入50mL带塞离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用均质机均质约1min，再震荡约30s。离心（3000rpm，10 min），取2mL上清液至玻璃管中，于50下氮气吹干。于上述玻璃管中加入正己烷2mL，先将残余物完全溶解后，再加入1mL原倍萃取稀释液，震荡约30s。离心（3000rpm，10min

46、），用吸管吸去上层液及中间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。若乳化现象较严重，则先将大部分上层液取出后，再将玻璃管置入80水中，隔水加热约510min。（3）操作步骤：取一定的微量测试孔条，于适当微孔中分别加入100L标准溶液。在另外的微孔中加入100L已完成前处理的样品溶液。在每一微孔中加入50L酶标记物。轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下避光静置温育1h。甩掉反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。最后一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。每一微孔中加入底物溶液100L，轻敲盘子四周。于室温下避光静置温育20min。于每一微孔中加入100L反应终止液，用酶标仪于波长450nm下判读。5、结果

47、处理：所测得的标准吸光值和样品吸光值（B）除以第一个标准（零标准）的吸光值（B0）再乘以100。以B/B0的百分数值为纵坐标，以标样浓度（ppb）为横坐标，绘制标准半对数曲线。根据每个样品的B/B0的百分数值就可从曲线上读出相对应样品的浓度（ppb）。根据标准曲线所得出的样品浓度乘以样品稀释倍数计算出样品中氯霉素的实际浓度，最后的结果用“g/kg”单位表示。6、注意事项：使用前先将取出置于室温下，回温30min。回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4保存。浓缩萃取稀释液和浓缩洗涤液使用前必须稀释。每次吸取不同的液体时一定要换移液枪的吸头。加样时必须小心勿溅出

48、微孔外，以免造成其他微孔的污染，加样品或试剂时枪头请勿接触微孔，不可产生气泡。洗涤必须充分，重复3次。温育时，要盖上塑料片或标签纸，置于暗处，温育时间不够不要随意取出；显色后尽快比色。试剂盒较贵且量很少，准确量取，不要造成浪费。7、分析与讨论为什么氯霉素含量与显色成反比？加底物进行温育反应后不显色的原因？洗涤不彻底会对结果产生怎样的影响？为什么？标准曲线偏离（线性不好）的原因有哪些？样品吸光值高于标准吸光值的原因？避光温育时间不够会对实验结果有怎样的影响？影响氯霉素酶联免疫吸附检测准确的因素有哪些？猪组织中盐酸克伦特罗的检验盐酸克伦特罗（CLB）是2-受体兴奋剂。是一种肾上腺素神经兴奋剂，属于

49、激素类兴奋剂，是国家按兴奋剂管理的药品，为人、畜呼吸系统药物（氨哮素、克喘素）。盐酸克伦特罗可促进动物生长，加速脂肪转化，提高瘦肉率，被俗称为“瘦肉精”。非法使用盐酸克伦特罗作为饲料添加剂，使用量大（是治疗剂量的5-10倍），使用时间长（持续添加时间一般3周以上），代谢慢，因而容易在动物体内（尤其是眼、肺、肝、肾）残留。􀂋盐酸克伦特罗通过食物链进入人体，产生蓄积中毒，如头晕、乏力、心律失常等。因此，国内外已经禁止-肾上腺素激动剂在动物生产中的应用。感官识别：健康肉淡红色，肉质弹性好，无“出汗”现象；“问题肉”特别鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有“出汗”现象。克伦特罗的检验方

50、法：HPLC、GC-MS、毛细管区带电泳法和免疫分析法猪组织中盐酸克伦特罗的检验GS/MS法*动物性食品中克伦特罗残留量的测定第一法GC/MS法。􀂋 基本原理：固体样品剪碎，用高氯酸溶液匀浆。若为液体试样，则加入高氯酸溶液，进行超声加热提取，用异丙醇+乙酸乙酯（40+60）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水（98+2）溶液洗脱，洗脱液浓缩，经N,O-双三甲级硅烷三氟乙酰胺衍生后于气质联用仪上进行测定，以美托洛尔为内标，进行定量。猪组织中盐酸克伦特罗的检验ELISA法*动物性食品中克伦特罗残留量的测定第三法ELISA法。􀂋基本原理：微孔

51、板包被有针对克伦特罗IgG的抗抗体；加入克伦特罗抗体，经过温育和洗涤后；加入酶标记物、标准或样品溶液，克伦特罗与酶标记物竞争与抗体结合；没有连接的克伦特罗酶标记物在被洗涤除去；加入酶底物和发色剂并且温育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在450nm处比色测定。酶联免疫实验设计：实验的关键操作：1）试剂盒的选择和准备：固相载体：吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差异；包被物：纯度；储存条件：2-8；室温平衡：试验用试剂应提前1-2h从冰箱中取出，待温度与室温平衡后使用；及时保存：试剂完毕后不需用的部分应及时放回冰箱保存。2）试剂的处理：尽可能使用新鲜样

52、本；进行必要的前处理。3）加样：加样前样本必须混合均匀；加在板孔底部，避免加在孔壁上部；不可溅出，不可产生气泡；每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；加酶结合物和底物时可用定量多道加液器。4）温育：温育前必须震动混匀，但不可溅出；温育的温度和时间应按规定力求准确；温育必须避光。5）洗涤：清洗必须彻底；避免出现板孔干燥；反转倾空微孔板要迅速，避免清洗液混合。6）显色和比色：显色的温度和时间应按规定力求准确；显色必须避光；使用多道加液器加终止液；显色完毕后尽快比色测定。 第五章毒素的检验毒素是活的生物有机体中存在的或向外界释放、分泌的一类具有明显生物活性的物质。毒素分类（按来源）：1、植物毒素：

53、含甙类植物：氰苷、皂苷等含生物碱类植物：乌头碱、雷公藤碱等含毒蛋白类植物：相思豆、巴豆树等含酚类化合物植物：儿茶酚等2、动物毒素：蛇毒：海蛇、蝰蛇、眼睛蛇、响尾蛇爬虫类：毒蜥蜴两栖类：青蛙、蟾蜍和蝾螈昆虫：蜈蚣、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、蚂蚁等鱼类：鲀毒鱼类、胆毒鱼类、卵毒鱼类肉毒鱼类海洋生物（大约有4万种）：贝类、藻类等3、微生物毒素：细菌毒素，真菌毒素，霉菌毒素河豚毒素的检验河豚毒素（TTX），又名河豚毒素酐-4-河豚毒素鞘，或河豚酸，是一种生物碱类的天然毒素。河豚鱼的肝、脾、胃、卵巢、卵子、睾丸、皮肤以及血液均含有毒素，其中以卵和卵巢的毒性最大，肝脏次之河豚毒素的毒力单位，一般用MU表示，即在3

54、0 min内杀死一只20g左右的雄性DDY小鼠的毒素量。毒力在20000 MU以上为“剧毒”；200020000 MU之间为“强毒”；2002000MU之间为“弱毒”；100 MU以下为“无毒”。􀁺河豚毒素的LD50为8.7g/kg（小鼠，腹腔注射），对人的经口最小致死量为40g/kg体重，大约12mg河豚鱼毒素结晶可使一个成人致死。河豚毒素的检测方法：TTX的检测方法：小鼠单位法、荧光分光光度法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法和毛细管电泳法等。􀁺荧光分光光度法：TTX加碱水解后生成2-氨基-6-羟甲基-8-羟基喹唑啉，该物质法荧光。在最大激发波长370nm

55、，最大发射波长为495nm条件下检测荧光强度。1、TTX的检测小鼠单位法基本原理：一定体重的小鼠经腹腔注射TTX之后，其死亡时间的倒数与注射的TTX剂量之间存在着线性关系。据此，可根据小鼠死亡的时间推断TTX的量。所得的毒力用MU表示（1MU0.22gTTX）。实验步骤：（1）样品处理：（2）动物试验：选择体重15-20g健康小白鼠，每组3只以上。将样品处理液以水稀释成各种浓度，每只小白鼠腹腔注射0.5mL。测定小白鼠呈现TTX特有症状的时间。河豚毒素毒力单位V检液体积，mL；S白鼠体重，g；M最小致死量的检液稀释倍数；m样品质量，g；V1动试物给予剂量，mL。贝类毒素的检验大多数贝类均含有一

56、定数量的有毒物质，贝类中毒现象越来越普遍。贝类中毒主要与主要与贝类吸食浮游藻类有关。毒物在贝体内蓄积和代谢，人类食用后可造成中毒。􀂋目前研究报道较多的毒素包括腹泻性贝毒（DSP）、麻痹性贝毒（PSP）、神经性贝毒（NSP）、记忆缺损性贝毒（ASP）和西加鱼毒素（CTX）5种。麻痹性贝类毒素的检验麻痹性贝类毒素（PSP）是山膝沟澡属的涡鞭藻所产生的一组毒素，在美国的大石房蛤中发现的浓度最高。最常见含有PSP的生物是蛤和贻贝，偶尔也涉及扇贝和牡蛎等。目前已分离出20种毒素。PSP的毒性与河豚毒素相当，摄入这种贝毒仅1mg就可导致人的死亡。国际许可的安全剂量为100g贝肉中含有相当

57、于80g的STX。PSP极易溶于水，部分溶于甲醇和酒精，不溶于大多数非极性溶剂。它是一种生物碱，容易从酸性溶液中萃取。PSP的检测方法1、生物测定法：小鼠单位法，家蝇生物分析法，蝗虫生物分析法2、理化分析法：HPLC，电泳法，TLC3、免疫化学法腹泻性贝类毒素的检验腹泻性贝类素（DSP）是一类脂溶性物质，化学结构是聚醚或大环内酯化合物。DSP的直接生产者也是海藻。能产生DSP的藻类也主要是甲藻和原甲藻属的藻类。能引起腹泻的DSP主要是OA和DTX1-3。DSP在日本栉孔扇贝、牡蛎、蛤仔、紫贻贝等中都有存在。DSP的检测方法：小鼠单位法、细胞毒性试验法、HPLC法、HPLC-MS等。И

58、698;小鼠单位法是AOAC标准方法，也是我国出口贝类中DSP的标准检测方法。体重为1620g的小白鼠腹腔注射0.51mL贝类提取液后，在15min时杀死小鼠所需的最低毒素量为1个MU。􀁺HPLC法用于DSP不同结构组分的分析及鉴定。分离贝类原料中不同结构的DSP，转化成荧光酯类衍生物，通过测定分离组分的荧光强度，与标准样品进行比较定量。记忆缺失性贝类毒素的检验􀁺记忆性贝类毒素（ASP）是一类存在于赤潮藻中的硅藻属中的毒素。ASP的主要成分是软骨藻酸（DA），是一种具有生理活性的氨基酸类物质。ASP的中毒症状主要包括恶心、呕吐、腹泻等，同时有昏迷等类似神经性

59、中毒症状，中毒后的典型特征是永久性丧失部分记忆。􀁺ASP的检测方法主要有：小鼠单位法、HPLC法、和CE法等。1、小鼠单位法􀁺最低检出限为50g/g ，远高于美国FDA规定的贝类食品中ASP的限量标准。2、HPLC法􀁺用一定溶液提取贝类中的ASP，用C18反相HPLC分离其中的DA。根据DA的紫外吸收特性，用紫外检测器进行检测，通过标准DA的色谱行为进行比较定性和定量。HPLC法的最低检出限为0.5g/g。若将贝类的ASP提取液预先用离子交换柱除部分杂质后，再进行HPLC分析，检出限可以进一步提高；去除杂质后，再用荧光衍生化进行衍生，检测限可提高到0.006g/g。3、CE法􀁺贝类中的ASP（主要为DA）用甲醇溶液提取，经离子交换树脂纯化，用CE法分离其中的DA，并与标准DA的电泳行为进行比较定量。组胺的检验组胺是又名组织胺，分子式为C5H9N3，化学名为2-咪唑基乙胺。是一种生物碱，溶于水和乙醇。组胺是鱼体中的游离组氨酸，在组氨酸脱羧酶