雷迪帕韦的合成及其主要中间体的研究进展

1、雷迪帕韦的合成及其主要中间体的研究进展摘要： 雷迪帕韦（Ledipasvir），前身为GS-5885，是由吉利德科学公司开发的一种NS5A蛋白酶抑制剂1。雷迪替韦完成III期临床试验后，用于治疗基因型1丙型肝炎的雷迪帕韦/索非布韦的固定剂量组合的片剂，于2014年2月10日被美国药典收录。2014年10月10日组合产品雷迪替韦/索非布韦获得美国FDA批准，商品名Harvoni2。雷迪帕韦通过对NS5A蛋白的抑制作用，从而阻断了病毒RNA的复制3。雷迪替韦拥有六个手性中心，其中处于桥杂环化合物1，3,4位与螺杂环6位上，这将是其合成工作中的重点本文通过参考大量文献综述了雷迪替韦的合成研究进展及其

2、最新的合成路线，并对其关键步骤主要的中间体做出了深入的研究关键词：雷迪帕韦（Ledipasvir），NS5A抑制剂，丙肝 ,手性，中间体，制备 。1.简介:丙型病毒性肝炎，简称为丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播。丙肝的的潜伏期往往是1.5-2个月，经过一段的潜伏期之后，便出现肝炎的常见症状有疲乏、身体无力、食欲减退、部分出现黄疸等症状。丙肝患者右下腹部感觉不舒服，恶心呕吐，食欲减退。丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，当HCV在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明HCV直接损害肝脏，导致发病起一定作

3、用。但多数学者认为细胞免疫病理反应可能起重要作用，发现丙型肝炎与乙型肝炎一样，其组织浸润细胞以CD3+为主，细胞毒T细胞（TC）特异攻击HCV感染的靶细胞，可引起肝细胞损伤。4雷迪帕韦(Ledipasvir),化学名称：GS-5885,英文化学名: Methyl N-(2S)-1-(6S)-6-5-9,9-Difluoro-7-2-(1S,2S,4R)-3-(2S)-2-(methoxycarbonylamino)-3-methylbutanoyl-3-azabicyclo2.2.1heptan-2-yl-3H-benzimidazol-5-ylfluoren-2-yl-1H-imi

4、dazol-2-yl-5-azaspiro2.4heptan-5-yl-3-methyl-1-oxobutan-2-ylcarbamate,CAS NO.：1256388-51-8,分子式 C49H54F2N8O6,分子量为：889.00，其商品名为：Harvoni (与索非布韦组合)。化学结构为图1.1所示:图1.1 Ledipasvir化学结构雷迪帕韦是获批可用于丙型肝炎全口服治疗方案的药物，可消除对传统注射药物干扰素（IFN）的需求。雷迪帕韦具有皮摩尔级活性的 NS5A 抑制剂，它对 HCV 基因型 1a 和 1b 复制的EC50 值 分 别 为 50 pmol / L 和 9

5、 pmol /L ，并且具有非 常 高 的 治 疗 指 数 ( CC 50 /EC 50 100000) ，此外它对 HCV 具有很好的选择性， 它对其他 RNA 或 DNA 病毒的EC50值均大于 10 mol/ L 。在临床试验中，慢性 HCV 患者单剂量口服 100 mg 是安全和耐受的， 其血浆消除半衰期为 10 14 h 。对于 HCV 1a型， 主要的耐药突变点为 Tyr93His ，但即使是发生耐药突变， 药物的血浆浓度仍高于最低有效浓度5。2.丙肝的发病机理和雷迪替韦的药理作用丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，但多数学者认为：HCV感染宿主细胞，首先需要包膜蛋白E1，E2与细胞膜表

6、面特定受体相结合，随之导致受体介导的胞吞作用的发生。病毒进入宿主细胞后，需要将基因组RNA释放到胞质内，随后IRES将介导多聚蛋白在粗面内置网上的翻译。在多聚蛋白的切割过程中或切割之后，膜结合的复制复合体得以形成，该复合体经过负链RNA中间体来催化HCV基因组RNA的扩增。新合成的正链RNA既可用于翻译，也可作为RNA进一步扩增的模板，还可与核心蛋白相互作用形成病毒核衣壳。包膜蛋白滞留在粗面内置网膜上，表明病毒包膜是在HCV病毒颗粒向粗面内质网腔内出芽的过程中形成的。子代病毒颗粒被认为是由分泌通路通过转运囊泡与细胞膜融合释放到胞外。非结构5A 蛋白(NS5A) 是一种高度磷酸化的非结构蛋白，

7、由 447 个氨基酸组成， 有 3 个不同的结构域。 结构域 ( 氨基酸序列: 1 213 ) 由一个高度保守的两性-螺旋和一个疏水的侧链及带电的侧链组成， 是 NS5A 与 RNA 结合的重要区域。 其晶体结构( PDB code: 1 ZH1 ) 显示它是一个二聚体， 有一个包含四个半胱氨酸残基( Cys39、Cys57、 Cys59、 Cys80) 的锌结合区域， 此区域对蛋白的稳定性起着重要作用。结构域 ( 氨基酸序列: 250 342 ) 和结构域 ( 氨基酸序列: 356 447 ) 也对病毒的复制 和组装有着重要作用。雷迪替韦属于作用于 NS5A 结构域的抑制剂， 使得病毒的RN

8、A复制受到影响6。NS5A 可以诱导白细胞介素-8( IL-8) 的表达， 从而使 HCV 对 -干扰素的抗病毒作用产生抑制。 同时， NS5A 蛋白上的干扰素敏感性决定位点 (ISDR) 可以通过与依赖 RNA 的蛋白激酶( PKR) 结合抑制细胞对 -干扰素的应答。雷迪替韦很好地解决了传统-干扰素疗法成功率低的问题7。 3.雷迪替韦的合成途径雷迪替韦的合成方法相对比较单一，根据切分经验分析，切断碳原子与杂原子的键，雷迪替韦的合成路线可以分为两大部分，一部分为6-5-(9H-芴-2基)-1H-咪唑基-5-氮杂螺2.4庚烷的衍生物；另一部分为2-2-双环2.2.1庚基-3-基-1H-苯并吡啶的

9、衍生物。分析全合成路线8。如图3.1,3.2所示:图3.1图3.23.1 合成路线3.1.1 6-5-(9H-芴-2基)-1H-咪唑基-5-氮杂螺2.4庚烷的衍生物的合成910图3.1.13.1.2 2-2-双环2.2.1庚基-3-基-1H-苯并吡啶的衍生物1213图3.1.23.1.3 雷迪帕韦的合成1415图3.1.3这即为雷迪替韦合成的主要思路,其中涉及到桥杂环化合物1，2,4位与螺杂环6位手性构建,以及其他若干部分的一些细节问题,将在下文逐一阐述3.2 桥杂环化合物1，3,4位与螺杂环6位手性中心及其他相关分析由上述雷迪替韦的合成路线可得到，主要的药物中间体为：2-溴-7-碘芴；（S）

10、-5-氮杂螺环2.4庚烷-6-羧酸；（1R，3S，4S）-2-氮杂双环2.2.1庚烷-3-羧酸，通过对专利US 20130324740的研究， 下面对两个手性中间体的合成及手性中心的构建做主要介绍。3.2.1 （S）-5-氮杂螺环2.4庚烷-6-羧酸的合成及其手性中心的构建合成路线一：首先，以2-环丙基-1,3-丙二醇原料，发生取代反应，羟基被碘取代得到二取代的碘化物，将产物溶于5摄氏度条件下的DMAC中，然后加入2-氨基乙酸乙酯， Boc2O，得到氮杂螺环化合物。经过手性拆分16，通过LiOH水解，得到（S）-5-氮杂螺环2.4庚烷-6-羧酸16的衍生物。图3.2.1上述合成路线中涉及到手性

11、拆分，下面对手性拆分做一下消息阐述。方法一:通过手性柱色谱拆分17获得雷迪替韦,是由具有光学活性的单体,固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相(Chiral Stationary Phases)通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而达到光学异构体拆分的目的要实现手性识别,手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用这种相互作用包括氢键偶级-偶级作用-作用静电作用疏水作用或空间作用手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果这些相互作用通过影响包埋复合物的形成,特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果由于这种作用力较微弱,因此需要仔细调节优化流动相和温度以达到最佳分离效果此方

12、法应用相对比较繁多，处理量小，成本相对较高，不适合工业化生产，在此不做过多过多阐述。方法二：物质1经过水解反应的到外消旋化合物2，将2溶于2-甲基四氢呋喃溶液中培成稀溶液，加入R-2-氨基-1-丁醇。在20摄氏度条件下反应20小时，酸化浓缩得到浆状物，过滤分离，用正庚烷进行冲洗，在40摄氏度条件下真空干燥，得到产物（收率32%）18。此方法为计较经典手性拆分的方法，使用到的均为常见试剂,容易获取,价格较低廉,反应条件较温和,且操作简单,很适合用于大量工业化生产方法三：在PH=7的条件下，将一定量的诺维信脂肪酶加入到磷酸缓冲溶液中，将外消旋混合物溶于一定量的乙腈中配成溶液，将两种溶液混合后。在4

13、0摄氏度条件下，用1mol/l的NaOH调节PH在6.9-7.1之间反应。反应结束后，进行过滤，并用5%NaHCO3 进行洗涤。将得到的产物用MTBE冲洗，MTBE层再用5%的NaHCO3再次冲洗。抛弃有机层，将水层混合，加入少量MTBE，用盐酸调节PH小于2，向产物中加入MgSO4，过滤蒸馏得到产物（收率75.9%,ee大于99%）19。此拆分路线产率，ee值高，应用酶进行手性拆分，副产物少，酶可以循环利用，有利于环境保护，是未来研究课题的重点方向。合成路线二：分析上述合成路线可得，最终得到是4，5两种物质的混合物，应用下面方式可以分离得到目标产物4。首先，将反应的到的固体用一定量的异丙基酸

14、甲酯进行两次重结晶提纯，然后加入少量异丙基酸甲酯溶解，并加热至50摄氏度。一段时间后，再加入一定量的正庚烷，温度降至20摄氏度。反应四个小时后，得到浆状物降温至5摄氏度冷却两小时。将产物经行过滤，用正庚烷经行冲洗，干燥后的到黄色目标产物4（收率为74%，与反应物2相比）20。3.2.2 （1R，3S，4S）-2-氮杂双环2.2.1庚烷-3-羧酸的合成分析相较于（S）-5-氮杂螺环2.4庚烷-6-羧酸衍生物的合成,针对（1R，3S，4S）-2-氮杂双环2.2.1庚烷-3-羧酸的合成19对单一,在常规的制备中,主要经历以下步骤如图3.3.1所示: 图3.2.2在上述合成路线的第二部反应中，涉及到了

15、Diels-Alder反应，这类反应具有很强的区位和立体选择性。当双烯和亲双烯体两者都有适当的取代基，使反应可能发生不同区位而得到两种产物时，事实上只有一种是主要的产物。在立体化学方面，这类反应都是顺式加成的，而且当反应物有可能生成内型和外型两种产物时，一般只得内型化合物。因此在第二部反应中，氮杂双环上的1,3,4位上主要形成顺式，反式，反式的手性中心，使得产物的纯度，收率大大提高,生产成本随之下降。4.结论雷迪替韦作为刚刚上市的新药，药物结构比较复杂，合成路线相对比较单一，用于工业化生产，总收率相对较低，使得合成成本大大提高。通过近年来一系列关于雷迪替韦的合成及相关研究看来,从催化剂等入手,

16、以使得反应条件能够更加温和,同时提升原子经济性,需要原料更加廉价,反应更加快捷迅速,易操作,同时提高纯度,e.e.%,使产率更高,生产成本降到最低这是未来研究方向的重点作为新一代的丙肝治疗的药物，雷迪替韦可用于直接口服，减少了原有治疗方式上的干扰素的使用，并且具有药效稳定，副作用小的一系列优点。设计出一个完整的,高效绿色的雷迪替韦合成路线必将带来巨大的经济效益，具有广泛的前景参考文献：1 丙型肝炎病毒非结构 5A 蛋白 ( NS5A) 抑制剂研究进展.中国药物杂志,2012,22(6):533.2 Introduction to Hepatitis C Virus (HCV) Therapie

17、s Special Thematic IssueNicholas A. Meanwell and William J. Watkins.J. Med. Chem., 2014, 57 (5), 16251626 3. LEE C Discovery of hepatitis C virus NS5A inhibitors as a new class of anti-HCV therapyJ ArchPharm Res， 2011 ， 34(9) : 1403 1407 .4. Smith, B. D.; Morgan, R. L.; Beckett, G. A.

18、; FalckYtter, Y.; Holtzman, D.; Teo, C.; Jewett, A.; Baack, B.; Rein, D. B.; Patel,N.; Alter, M.; Yartel, A.; Ward, J. A. Recommendations for the identification of chronic hepatitis C virus infection among persons bornduring 1945 1965. MMWR 2012, 61, 1 18. 5 FRIDELL R A， QIU D， VALERA L， et al Disti

19、nct functions of NS5A in hepatitis C virus RNA replication uncovered by studies with the NS5A inhibitor BMS-790052J J Virol， 2011 ， 85(14) :7312 73206 POLYAK S J， KHABAR K S， PASCHAL D M ， etal Hepatitis C virus nonstructural 5A protein induces interleukin-8， leading to partial inhibition of the int

20、erferon-induced antiviral responseJ J Virol， 2001 ， 75(13) : 6095 61067 SHIM AKAM I T， HIJIKATA M ， LUO H， et al Effect of interaction between hepatitis C virus NS5A and NS5B on hepatitis C virus RNA replication with the hepatitis C virus repliconJ J Virol， 2004， 78 (6) :2738 27488 Discovery of Ledi

21、pasvir (GS-5885): A Potent, Once-Daily Oral NS5A Inhibitor for the Treatment of Hepatitis C Virus Infection John O. Link, James G. Taylor, Lianhong Xu, Michael Mitchell, Hongyan Guo, Hongtao Liu, Darryl Kato, Thorsten Kirschberg, Jianyu Sun, Neil Squires, Jay Parrish, Terry Keller, Zheng-Yu Yang, Ch

22、ris Yang, Mike Matles, Yujin Wang, Kelly Wang, Guofeng Cheng, Yang Tian, Erik Mogalian, Elsa Mondou, Melanie Cornpropst, Jason Perry, and Manoj C. Desai J. Med. Chem., 2014, 57 (5), pp 20332046.9 N-Fluorobenzenesulfonimide in the base-promoted difluorination of methylene groups activa

23、ted by carbonyl groups has been demonstrated, see: Differding, D.; Poss, A. J.; Cahard, D.; Shibata, N. NFluoro-N-(phenylsulfonyl)benzenesulfonamide. e-ROS Encycl. ReagentsOrg. Synth. 2013, 1 12. 10 Stella, L.; Abraham, H.; Feneau-Dupont, J.; Tinant, B.; Declercq, J. P. Asymmetric aza-Diels Alder re

24、action using the chiral 1-phenylethyl imine of methyl glyoxylate. Tetrahedron Lett. 1990, 31,2603 2606.11 Muller, S.; Liepold, B.; Roth, G. J.; Jurgen Bestmann, H. An improved one-pot procedure for the synthesis of alkynes from aldehydes. Synlett 1996, 521 522.12 Faucher, A. M.; White, P. W.; Brochu

25、, C.; Grand-Maitre, C.;Rancourt, J.; Fazal, G. Discovery of small-molecule inhibitors of the ATPase activity of human papillomavirus E1 helicase. J. Med. Chem. 2004, 47, 18 21.13 LHeureux, A.; Beaulieu, F.; Bennett, C.; Bill, D. R.; Clayton, S.;Laflamme, F.; Mirmehrabi, M.; Tadayon, S.; Tovell, D.; Couturier, M.Aminodifluorosulfinium salts: Selective fluorination reagent