微生物学实验指导书

1、实验一 土壤中微生物的分离一、实验目的：1、使学生熟悉土壤中微生物种类。2、学会用稀释平板技术确定土壤样本中的细菌和真菌的数目。二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，包括 、真菌、原生动物、藻类和病毒。尽管有如此多样性，细菌，包括霉菌样防线菌和真菌乃是最占优势的。必须记住，土壤环境随地点不同而不相同；同一地点，不同时期的土壤环境也不一样。这样，像湿度、PH值、温度、氧气含量、土壤中有机和无机组成在确定特定样本的特定微生物中将是决定性的。就像土壤不同一样，用于分析土壤的微生物学方法也不同。一个单一的技术是不能用来对所给的土壤样本中不同类型的微生物进行分离计数的。本实验中确定的仅仅是细菌、防线菌、

2、和真菌的相对数目。所用的方法是系列稀释平板法。为培养这三类微生物的生长，采用了不同的培养基：甘油醇母琼脂培养基用于防线菌分离；Saboruaud琼脂培养基用于真菌的分离；为了抑制细菌的生长，两种培养基都补以每毫升培养基10微克的金霉素。营养琼脂培养基用于细菌的分离。三、实验材料：土壤：1克充分碾碎的肥沃的花园土样本，放入装有99毫升无菌水的烧瓶中，标记为瓶1:1:100稀释度（10¯²）。培养基：每个实验组：1瓶75毫升保持在45熔化的营养琼脂培养基；1瓶75毫升45甘油醇母琼脂培养基；1瓶75毫升45Sabouraud琼脂培养基。2瓶99毫升无菌水。器材：酒精灯，计数器，

3、无菌1毫升吸管，无菌培养皿，记号笔。四、实验步骤：1按下法标记每组的四个培养基营养琼脂培养基：10，10，10，10（用于细菌计数）。甘油醇母琼脂培养基：10，10，10，10（用于放线菌计数）。Sabouraud琼脂培养基：10，10，10，10（用于真菌计数）。2.用笔标记二瓶99毫升无菌水为瓶2和瓶3。3.用力摇动1：100（10）稀释度的土壤样本大约30分钟。4.用一支无菌1毫升吸管，从瓶1中吸取1毫升所给土壤样本稀释液到瓶2，并如前用力摇动。其稀释度为1：10000（10）。5.用另一支无菌1毫升吸管，从瓶2中吸取1毫升稀释液到瓶3，并如前用力摇动。其稀释度为1：1000000（10

4、）。6.按下法，用无菌1毫升吸管及无菌技术，吸取适当量的每种稀释液到相应标记的平皿中以得到最终所需稀释度。a.真菌放入标记的Sabouraud琼脂平皿中1毫升瓶1稀释液加入到标记10平皿中0.1毫升瓶1稀释液加入到标记10平皿中1毫升瓶2释液加入到标记10平皿中0.1毫升瓶2释液加入到标记10平皿中b.放线菌放入标记的甘油醇母琼脂平皿中0.1毫升瓶1稀释液加入到标记10平皿中1毫升瓶2释液加入到标记10平皿中0.1毫升瓶2释液加入到标记10平皿中1毫升瓶3液加入到标记10平皿中c.细菌放入标记的营养琼脂平皿中1毫升瓶2释液加入到标记10平皿中0.1毫升瓶2释液加入到标记10平皿中1毫升瓶3液加

5、入到标记10平皿中0.1毫升瓶3液加入到标记10平皿中。7.从水浴中取出熔化的营养琼脂培养基并擦干烧瓶。用无菌技术，在每个用于细菌计数的平板中倒入大约15毫升培养基，轻轻旋转每个平板以保证培养基中细胞均一分布。8.重复步骤7，用熔化的Sabouraud琼脂培养基进行真菌计数；用熔化的甘油醇母琼脂培养基进行放线菌的计数。9.使所有的琼脂平板固化。10.把平板置于25下，倒置3-7天。实验二 抗生素产生菌的分离一、实验目的：1.用致密平板技术分离抗生素产生微生物 2.确定分离的抗生素抗菌活性范围二、实验原理：土壤是能产生抑制其他微生物生长的抗生素的微生物的主要栖息地。医学上用的抗生素是从四个土壤微

6、生物种群中分离出来的：链霉菌，芽孢杆菌，青霉菌和头孢霉菌，它们分别代表着放线菌，细菌和霉菌 三个微生物类型。虽然在工业实验室中不断进行来自全球土壤的筛选以分离得到新的产生抗生素的微生物，但是工业微生物学已把其力量对准已有抗生物质的化学修饰上。这是通过增加或取代化学侧链、重组分子内键，或产生能分泌更多潜在形式抗生素的突变体微生物菌株来完成的。化学同类物的产生是为了防止抗生素抗性的产生，把对宿主不利的副作用降到最小和增加抗生素的有效范围。实验的A部分中，学生将使用致密平板技术从土壤样品中分离抗生素产生微生物，其中之一接种灰色链霉菌作为阳性对照。在B部分中，显示抗生素活性的分离物将被筛选出来对几种不

7、同的微生物进行抗性反应以确定它们的效果。三、实验材料：培养物：B部分，用trypticase soy肉汤培养基培养24小时的大肠杆菌，金黄色葡萄球蓖，耻垢分枝杆菌和铜绿色假单胞菌。土壤悬液：A部分，1：500稀释度的土壤悬液（每50毫升自来水0.1克土样）作为未知；1：500稀释度土壤接种链霉菌作为阳性对照。器材：A部分，500毫升烧杯，试管，无菌平皿，接种针，加热板，温度计，1毫升和5毫升吸管，放大镜。B部分，酒精灯和接种环。四、实验步骤：A部分 抗生素产生微生物的分离1.在每套的三个平皿上标记所要的土壤样本和稀释度（1：1000，1：2000，1：4000），并用你的收字母加以识别。共标记

8、二套。2.把6支trypticase soy琼脂试管放入水浴中加热至100，然后冷却至45保持。3.按下法准备未知和阳性对照的1：500土壤样品系列稀释度。a.在三支试管上标记1，2和3，用吸管加5毫升自来水到每支试管中。b.充分摇动所给1：500土壤样品以得到均匀的土水悬液。c.用5毫升吸管，吸取5毫升1：500稀释液到试管1中并混匀，稀释度为1：1000。d.用另一支吸管，从试管1中吸5毫升稀释液到试管2中并混匀，稀释度为1：2000。e.再用另一支吸管，从试管2中吸5毫升稀释液至试管3中，混匀，稀释度为1：4000。f.分别用1毫升吸管，吸取1毫升的1：1000，1：2000和1：400

9、0的稀释液到相应标记的平皿中。g.每皿倒一管45的trypticase soy琼脂培养基，轻轻转动混匀之。h.使其固化4.所有平板于25倒置保温2至4天。5.保温后，用接种针从每个培养物中无菌分离有生长抑制圈的菌落于trypticase soy琼脂斜面上。6.将斜面于25保温2至4天，将其作为B部分的抗生素产生分离的原种培养物。B部分 分离物抗菌范围的确定1.在trypticase soy琼脂平板上标记上分离物的土壤样品来源。2.用无菌技术，在琼脂平析用单线划线接种每种分离物。接种线将平板分成两半。3.将平板于25倒置保温35天。4.保温后，在每个平板底部划四条垂直于抗生素产生分离物生长线的直

10、线。5.按每个平板上的底部描线，无菌划线接种四种供试培养物，从靠近（但不接触）抗生素产生分离物的生长处开始，划向平板的边缘。6.平板于37倒置保温24小时。实验三 豆科植物根瘤中根瘤菌的分离一、实验目的：1.观察根瘤和类菌体 2.从根瘤中分离根瘤菌二、实验原理：不同的根瘤菌感染相应的豆科植物根部形成根瘤。根瘤是根瘤菌和豆科植物的共生组织，它能大量地同化大气分子态氮，供豆科植物用，同时豆科植物为根瘤提供所需营养成分。根瘤菌在根瘤中是以类菌体的形式存在。虽然土壤中存在很多根瘤菌，但如果从土壤中进行分离，则很难鉴别。最简单的方法就是从根瘤中进行分离。本实验选用大豆植株根系上的根瘤进行大豆根瘤菌的分离

11、。三、实验材料：植株：接种了根瘤菌的生长30天左右的大豆植株。培养基：每实验组1瓶150毫升结晶甘露醇酵母琼脂培养基，4支甘露醇酵母琼脂斜面，5支10毫升无菌水。试剂：95酒精，0.1升汞。器材：无菌培养皿，无菌眼科剪、眼科镊，接种环。四、实验步骤：1.挖取植株根系，带土放入水中浸泡，稍后抖掉泥土，用水冲洗，获得带瘤根系。2.选择根系主根上部发育健壮，饱满呈红色的根瘤，用眼科剪将根瘤剪下，剪下时稍带一些根，以保持根瘤的完整性。3.为去除根瘤表面的杂菌，将剪下的根瘤浸入95酒精中5分钟，然后再转入0.1升汞中5分钟。4.无菌操作，将根瘤放入无菌水中浸洗，振摇5分钟，重复4次。5.将灭菌清洗干净的

12、根瘤放置于无菌培养皿中。6.用无菌镊子将根瘤压碎，流出浆液。用1毫升无菌吸管吸1毫升无菌水与浆液混匀，制成悬液。7.按下法进行四路划线分离a.取一环菌悬液在甘露醇酵母琼脂平板图示区域1表面划3次。b.灼烧接种环并使其冷却，把平板转90°，把接种环放置区域1的角上，交叉在区域1的划线上，在图示区域2上划3次。c.再次灼烧接种环，并冷却之，再将平板转90°，从区域2的角上，按上法在区域3上划线。d.不再灼烧接种环，再将平板转90°，从区域3的角上划线至区域4。8.将平板倒置，于28保温47天。9.另将菌悬液涂片，供观察。 实验四 感病死亡昆虫中杀虫细菌的分离一、 实验

13、目的：掌握病原细菌的分离方法二、 实验原理：大多数病原细菌使昆虫致死的方式是一旦进入血腔，就会引起败血症。一般死虫体内充满乳糜状液样物，因此将昆虫体内的体液接种到合适的培养基上，就能达到分离病原细菌的目的。三、实验材料：死亡昆虫：感染苏云金杆菌致死的虫尸培养基：营养琼脂培养基平板，5支10毫升无菌水试管，营养琼脂斜面。试剂:75%酒精，0.1%升汞，石炭酸复红染液，MBB染液。器材：无菌平皿，镊子，玻棒，无菌吸管，接种环。四、实验步骤：1.将虫尸放入75酒精中浸泡5分钟，然后移入0.1升汞溶液中浸泡5分钟，除去虫尸表面杂菌。2.无菌操作下，将虫尸在无菌水中清洗，重复4次。最后就虫体置于无菌平皿

14、中。3.用灭菌的镊子或玻棒将表面经过清洁的虫体捣烂。加入少量无菌水（12毫升）用接种环混匀，制成含菌悬液。4.取菌悬液在营养琼脂平板上进行划线分离。5.于30下将平板倒置保温24至48小时。6.无菌操作下，调取划线平板上的单个菌落接种于营养琼脂斜面上。7.培养物于30保温24小时。实验五 果浆中酵母菌的分离一、实验目的：学习利用加富培养基进行酵母菌的分离二、实验原理：加富培养是在培养基中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长繁殖的条件，使所需微生物大量繁殖，增加分离到这种微生物的机率。利用加富培养基（乳酸豆芽汁培养基）创造酵母菌适宜的生长条件，使其迅速繁殖。从烂水果果浆中很容易分离出酵

15、母菌，利用在液体培养基中酵母菌蓖霉菌生长快，而酸性条件又能抑制细菌的生长的特性，用乳酸豆芽汁培养基可获得酵母菌的增殖培养，达到分离酵母菌的目的。三、实验材料：烂水果：烂苹果或烂梨子培养基：2管5毫升乳酸豆芽汁蔗糖培养液，Sabouraud琼脂培养基平板和斜面。器材：酒精灯、接种环、无菌1毫升吸管。四、实验步骤：1.标记二管乳酸豆芽汁培养液试管为管1和管2。2.取烂水果，用接种环跳取烂水果果浆少许接种于管1乳酸豆芽汁蔗糖培养液中。3.接种试管于28下保温24小时。4.无菌操作，用1毫升无菌吸管吸取管1培养后的底层培养物0.1毫升转入到管2乳酸豆芽汁培养液中。5.管2于28保温24小时。6.用接种

16、环在管2中取一环培养物在Sabouraud琼脂平板上进行划线分离。7.划线平板于28倒置保温2天。8.在Sabouraud琼脂划线平板上挑取单菌落接种至Sabouraud琼脂斜面上。9.斜面于28保温2天。实验六 污水中噬菌体的分离一、实验目的:从污水中分离烈性大肠杆菌噬菌体二、实验原理:细菌病毒(细菌噬菌体)的分离能够从不同的自然来源中获得,包括土壤,肠道内含物,污水,和某些昆虫。这样的环境中分离它们不是一个很容易的工作,因为噬菌体颗粒通常是以很低的浓度存在。这样分离就需要一系列步骤： 1收集含噬菌体的样本。 2为下一步分离，把丰富的易感宿主细胞培养物加入样本中以增加噬菌体颗粒的数目。 3温

17、育后，离心加富的样本以去除粗的颗粒。 4用细菌膜滤器过滤离心的上清液。 5把无菌滤液接种在生长在软琼脂平板培养基上的易感宿主细胞层上。 6温育后观察培养物上噬菌体颗粒的存在，它由细胞层上的空斑的形成来指示。 在接下来的实验中，将使用先前概述的步骤从污水中分离大肠杆菌体颗粒噬菌体颗粒，感染大肠杆菌的噬菌体（Coliphage）用字母T标示表示类型。 已确定了从T2到T7七种类型。 T-偶数噬菌体（T2、 T4 和T6）在大小、形态和化学组成上都不同于T-奇数噬菌体，所有的T噬菌体都能感染不运动的易感E。coli B 宿主细胞。三、实验材料： 培养物： 第一部分，5毫升24小时E。coli B 肉

18、汤培养物和45毫升装在有螺口盖瓶中新采集的污水样本。 第二部分， 10毫升24小时E。coli B 肉汤培养物。 培养基： 第一部分，一支5毫升细菌噬菌体肉汤培养物（10×）的试管。 第二部分，5个胰蛋白胨琼脂平板和5支3毫升胰蛋白胨软琼脂试管。 器材： 第一部分，250毫升带盖无菌三角瓶。 第二部分，无菌膜过滤装置，无菌带盖125毫升三角瓶，1000毫升烧杯，离心机,酒精灯，镊子，无菌吸管四、实验步骤： 第一部分， 污水样品的扩增1 无菌加入5毫升噬菌体肉汤培养基，5毫升E。coli B肉汤培养物，45毫升污水样品至已适当标记的无菌250毫升三角瓶中。 小心处理污水。2 培养物于3

19、7温育24小时.第二部分 过滤和接种1温育后，把噬菌体感染的培养物倒入离心管内，2500rmp离心25分钟。2取出离心管，小心不要搅动沉淀，轻轻倒出上清至125毫升烧瓶中。3把上清倒入无菌膜过滤装置中，抽滤后，收集下部抽滤批瓶中的无菌的含噬体的滤液。4将5支胰蛋白胨软琼脂培养基试管放入100 沸水中溶化后冷却至45 。5分别标记5个胰蛋白胨琼脂平板和5支胰蛋白胨软试管为1，2，3，4和5。6用无菌1毫升吸管，加入0.1 毫升E. coli B培养物至溶化的软琼脂试管中.7用无菌巴氏吸管,无菌加入1,2,3,4和5滴过滤液至分别标记了的软琼脂管内,混合并倒入相应的琼脂板上。8使琼脂固化。9所有平

20、板于37 倒置温育24小时。实验七 链霉素抗性突变体的分离一、实验目的： 在原养型细菌种群中用梯度平板技术分离链霉素抗性突变体。二、实验原理：突变，单个基因的碱基顺序的改变，虽然很少发生，也是细胞遗传变异的来源之一。 在抗药性微生物中，突变基因能使细胞通过不同的机制防止药体抗生作用的发生，包括：1像青霉素抗性中的抗生素化学结构酶促改变。2像链霉素抗性中的细胞膜选择透性的改变。3像抗链霉素中的酶对抑制机制的敏感性降低，这涉及到核糖的转移过程。4像抗磺胺类大量产生对药物（抗代谢物）有竞争效应的自然物质（代谢物），通过竞争抑制产生抗生作用。如下步骤通过梯度平板技术从原养型E。 coli 中分离出链霉

21、素抗性突变体，这就需要准备双层琼脂平板，底层的斜面琼脂层缺乏链霉素，溶化的含有抗生素的琼脂培养基在倒在底层斜面上时就形成了表层上的链霉素浓度梯度。随后用涂抹平板接种原养型供试菌并保温。 在高浓度链霉区域出现的菌落就是链霉素抗性突变体。三、实验材料：培养物： 培养24小时E。coli 肉汤培养物培养基： 2支10毫升trypticase soy琼脂试管试剂： 链霉素贮液（10g/ 100ml）器材： 无菌平皿、 无菌吸管、 弯玻棒、 水浴、装有75%酒精的烧杯。四、实验步骤：1在热水浴中，溶化2支trypticase soy 琼脂试管，冷却并保持在45 。2在平皿一端放一支铅笔，倒入足量的溶化的

22、琼脂培养基覆盖整个底部表面使其在倾斜状态下固化。3用1毫升无菌吸管，加0.1毫升链霉素液到第2支tryptocase soy 琼脂试管中，转动混匀。4把平皿水平放置， 倒入足够量的含链霉素的琼脂培养基覆盖梯度琼脂层，并使其固化，形成链霉素梯度层。5用1毫升无菌吸管加0。2 毫升大肠杆菌培养物，用灭菌玻棒把培养物涂抹在整个琼脂平面上。6做好标记，平板于37 倒置保温48小时。7保温后，选1到2个存在于链霉素浓度梯度中部的分离菌落，用接种环将其划向平板的高浓度端。8平板于38倒置保温48小时。实验八 微生物的培养特征一、实验目的： 确定微生物的培养特征，以助于微生物的鉴定和分类二、实验原理： 当生

23、长在不同培养基上，不同微生物将会表现出不同的肉眼可见的生长外形，这些不同就叫培养特征，被用来作为把微生物分类到种群中去的基础。细菌、 放线菌、霉菌和酵母菌都有其各自的培养特征，大多细菌菌落光滑湿润，而大多霉菌落则干燥蓬松，放线菌则形成致密的菌落，酵母菌则形成类似细菌的菌落形态。 细菌的培养特征由培养在固体斜面和平板，营养肉汤和明胶培养基上外形特征来确定的。营养琼脂斜面： 在表面接种一条直线，并按下法评价1生长的量： 生长的最为无， 少量，中等量和大量。2色素： 产色微生物可产生细胞内色素就象在菌落上看到的微生物的颜色；另外一些微生物产生细胞外可溶性色素，它们分泌到培养基中产生颜色。然而大多数细

24、菌呈白色或灰色。3光学特性： 这些特征描述为不透明，半透明或透明。4形式： 在琼脂表面单线划线形成丝状，刺状、珠状、弥散状、树状和根状外观。营养琼脂平板： 很好分离的菌落按下法进行评价： 1大小： 点，小、中等或大。2色素： 菌落的颜色。3形式： 菌落的形状描述在圆形，不规则形或根状。4隆起：可描述为扁平、隆起，凸起和中央凸起。营养肉汤培养物：如下按分布和生长的外观进行评价，包括均一细致混匀状，絮状，薄膜状和沉淀状。营养明胶： 通过明胶酶反应使固化培养基液化，并表现出不同形式；火山口状，芫菁状，漏斗状，囊状和层状。放线菌尤其是链霉菌属的放线菌，可产生色素而使其具有分类特色。营养菌丝和气生菌丝通

25、常产生不同颜色，呈典型致密小巧的菌落外观。霉菌也具有颜色特征。 形成蓬松较大的特征菌落外观。三、实验材料： 培养物： 分离得到的细菌和真菌培养物。 培养基： 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、明胶培养基、Sabouraud 琼脂培养基和甘油酵母琼脂培养基。 器材： 酒精灯、接种环、接种针。四、实验步骤：1在琼脂平板和试管上作好标记。2用无菌技术将培养物接种到准备好的琼脂平板和试管中。3将接种的琼脂平板和试管于28保温24至48小时。实验九 微生物的形态特征一、实验目的： 掌握微生物形态观察手段和描述方法二、实验原理： 微生物的形态特征是微生物鉴定和分类的重要的和最基本的依据，相差显微镜能够观察活

26、的微生物，不产生由于染色过程、干燥和包埋所引起的变形，在形态观察中起着特殊作用。在普通光学显微镜上对微生物进行观察，则更多的是借助于各种染色技术对微生物进行染色观察。其中革兰氏染色，鞭毛染色及抗酸染色则在细菌的鉴定中常常用到。 细菌的基本形态有球菌、 杆菌和螺旋菌。放线菌是细菌中一类形成分枝菌丝至形成菌丝体的种类。革兰氏染色是用于细菌学中的最重要的特异染色，它把细菌分成二个主要类群，即革兰氏正细菌和革兰氏负细菌。通过染色可观察到芽孢、鞭毛、荚膜、伴孢晶体等。真菌形态上有形成菌丝体的霉菌和以芽殖为主结构简单的酵母菌。霉菌的菌丝类型，孢子类型和形状，孢子囊类型都是霉菌鉴定的依据，另外某些种类的霉菌

27、还具有特征性的假根和足细胞等结构。酵母形态上可分为椭圆形、圆形、有时形成圆柱体并形成假菌丝。酵母以芽殖或形成子囊孢子进行繁殖。三、实验材料：（略）四、实验步骤：（略） 实验十 微生物氧环境对生长的影响一、实验目的：熟悉各种微生物对大气氧的需求二、实验原理：微生物在利用氧进行细胞呼吸的能力方面显示出巨大的多样性。这些在氧需求上的不同反映了存在于不同种间的生物氧化酶系统的差异。这样就可根据它们对氧的需求，将其分类到四个主要种群中的一个中去。1.好氧菌：需要有空气中氧的存在进行生长，它们的酶系统需要氧分子作为最终氢受体。2.厌氧菌:它们需要缺氧环境来生长,它们的氧化酶系统需要氧分子外的分子作为最终氢

28、受体.3.兼性厌氧菌:这些微生物可在有氧和缺氧情况下生长，它们的酶系统在氧存在时完全氧化高能底物，在缺氧时，不完全氧化底物。4.微需氧菌：它们需要有限量的大气氧进行生长，超过所需的氧会阻碍微需氧菌的氧化酶活性并导致死亡。微生物对氧的需求可记录其摇动试管接种后的生长分布来确定。这个过程需要把接种物转入到溶化的琼脂培养基中，摇动试管使微生物完全在琼脂中分散，并迅速固化以使细胞保持分散。保温后，生长布标志着其氧需求。好氧菌生长在表面，厌氧菌的生长限制在试管底部，兼性厌氧菌由于对氧需求的不同生长在整个培养基中，微需氧菌生长在稍低于表面的区域中。三、实验材料：培养物：分离得到的各种微生物。培养基：脑心浸

29、出汁琼脂试管培养基。器材：酒精灯、水浴、冰水浴、温度计、无菌巴氏细菌。四、实验步骤：1.在浸出液琼脂管上标记上所要接种的微生物和识别记号.2.把浸出液琼脂放入100水浴中溶化.3. 冷却至45并放入水浴中.4. 用无菌技术,用无菌巴氏吸管滴一滴实验培养物到相应标记的溶化琼脂管中.5. 把接种的溶化琼脂管放在手掌中用力转动,把菌混匀.6. 把接种试管竖直放入冰水浴中的迅速固化培养基.7. 把培养物琼脂试管放在相应温度保温相应时间.实验十一 微生物的生物化学活性一、实验目的: 掌握微生物的生物化学活性在鉴定中的作用二、实验原理: 所有的微生物都有其自身可识别的生物化学特征.这些特征收细胞活性的控制

30、,负责生物能量,生物合成和生物降解.所有这些化学反应就是细胞代谢.发生在细胞内外的生化转化都是由生物催化剂酶所操纵的.胞外酶作用于细胞外的物质,大多数高分子物质不能通过细胞膜,因此象多糖、脂类和蛋白质这样的食物原材料在能转入到细胞里之前必须降解成低分子物质养分. 胞外酶主要是水解酶类.胞内酶在细胞内发挥作用,主要负责新的原生质所需成分的合成并从吸收的物质中产生细胞能量,细胞使营养物质穿透细胞膜的活性就表明许多胞内酶的存在.作为这些代谢过程的结果,代谢产物形成并分泌到细胞外环境中. 检测这些终产物不仅有助于识别特殊的酶系统,而且也能利用来识别、分离和分类微生物.所有微生物生化活性的实验的原理和方

31、法见英文教导教材. 实验十二 结瘤实验一、实验目的: 1. 进行分离根瘤菌的鉴定2.掌握结瘤实验方法二、实验原理: 根瘤菌对豆科植物的生长关系来说,有两个基本特性.一为侵染力,即形成根瘤的能力; 另一个是有效性,既共生固氮的能力. 一个分离的根瘤菌株为了最后确定其分类地位,必须在严格控制的条件下,回接到原宿主植物上,看其是否形成根瘤,同时观察根瘤的作用,该方法就是根瘤菌的结瘤实验,是根瘤菌鉴定中的最基本的方法. 结瘤实验的关键在于: 1.保证供试植物只与特定的根瘤菌接触; 2. 保证供试植物的健康生长.三、实验材料:供试植物种子: 大豆种子培养物: 于甘露醇酵母液体培养基中培养2天的新鲜大豆根

32、瘤菌培养物试剂: 95%酒精 0.1%升汞器材: 无菌培养皿, 无菌培养栽植花钵四、实验步骤: 1. 将大豆种子放在无菌培养皿中,用95%酒精浸泡5分钟,再转入0.1升汞溶液中浸泡5分钟.2. 无菌操作,将灭菌的大豆种子用无菌水清洗4-5次.3.实验用大豆种子在无菌条件下沾上新鲜大豆根瘤菌培养物.4. 实验种子的和对照种子接种在无菌培养花钵上.5. 把培养钵放在光照好通气好的地方培养.6. 培养30-40天.实验十三 空斑实验一、实验目的: 掌握 噬菌体的培养和计数技术二、实验原理: 这个实验证实了病毒在易感宿主细胞中复制的能力,为了这个目的将提供烈性噬菌体和易感宿主细胞培养物,对在固体琼脂培

33、养基上形成空斑进行计数,在预先接种了稀释的噬菌体样品和宿主细胞培养物的琼脂培养基上可观察到范围清晰的噬菌斑,每个清晰的环代表着噬菌体感染细胞的裂解. 实验中用到双层培养技数,硬琼脂作为基底层,软琼脂中噬菌体和宿主细胞的混合物形态上部覆盖层,易感大肠杆菌细胞迅速繁殖,并在培养基上形成一个生长层,当噬菌体颗粒吸附到易感细胞上,注入细胞,复制并继而裂解宿主细胞,被破坏的细胞就在细菌层上形成一个清晰的圆形区域,这个清晰的圆环就是噬菌体形成单位(PFU). 噬菌体培养原液中所含噬菌体颗粒数,由在接种的琼脂板上形成的空斑数乘以其稀释因子而定.为测定有效的噬菌体总数,每板的空斑数不应多于300个或少于30个

34、. 例如: 在10-6平板上数有200PFU. 则每毫升噬菌体培养原液含颗粒数为 颗粒数/毫升= 200 × 106= 2×108 PFU三、实验材料:培养物:24小时E.coli B 营养肉汤培养物, 分离得到的大肠杆菌噬菌体营养肉汤培养物.培养基: 5个胰蛋白胨琼脂平板,5支2毫升胰蛋白软琼脂试管,10支9毫升胰蛋白胨肉汤培养基试管.器材: 酒精灯、 水浴、温度计、1毫升无菌吸管、无菌巴氏吸管.四、实验步骤: 1. 如下标记所有的稀释度试管和培养基: a. 5支胰蛋白胨软琼脂试管: 10-5, 10-6,10-7.10-8,10-9 b. 5个胰蛋白胨琼脂平板:10-5

35、,10-6,10-7,10-8,10-9 c. 10支胰蛋白胨肉汤管:从 10-1到10-102. 把5支标记过的胰蛋白胨软琼脂管放入水浴中加温到100溶化,冷却并保持于45.3. 将提供的噬菌体培养原液在10支9毫升胰蛋白胨肉汤管中进行10倍系列稀释.4. 在标记10-5胰蛋白胨软琼脂管中,用巴氏吸管加入2滴大肠杆菌培养物和1毫升10-5胰蛋白胨液体噬菌体稀释物,并将其倒在标记10-5的琼脂板上.这样就形成了双层平板培养物. 轻轻旋转平板,并使其固化.5.分别用巴氏吸管和1毫升吸管按第四步方法制成10-6或10-9稀释度的双层平板.6. 所有平板于37倒置温育24小时.实验十四 鉴定与分类系

36、统一、实验目的: 掌握鉴定与分类系统二、实验原理: 微生物的鉴定与分类是在对大量个别微生物进行观察、分析和描述的基础上,按照它们的形态,生理生化特性的异同等,分门别类地安排到一个系统. 现代微生物鉴定与分类的依据主要是形态特征,培养特征,生理生化特征,血清学反应,噬菌体敏感性,及一些包括核酸分析,细胞壁成分分析,红外光谱,数值分类等新技术的应用.要完成鉴定与分类,首先必须获得纯的培养物,其次通过最少数量的试验项目来完成鉴定实验. 利用显微镜及相应染色技术观察明显的形态特征,检查肉眼可见的生长外观,并辅以其它一些方法来完成最终的鉴定.本实验将结合对已分离的微生物进行的各种观察与试验的基础上,对细

37、菌, 放线菌, 霉菌和酵母进行鉴定与分类的方法进行介绍.三、实验材料: 培养物: 各种已分离得到的微生物四、实验步骤: 1.汇集实验考察记录和数据 2.利用分类检索系统进行分类3.鉴定已分离的微生物附: 分类系统介绍一、 细菌分类系统“ 伯杰氏鉴定细菌学手册” (Bergeys Manual ofDeterminative Bacteriology) 自1923年第一版以来,相继于1925、1930、1934、1939、1948和1957年出版了第二到第七片,几乎每一版均吸取了许多微生物学家的经验,其内容经过不断扩充和修改.特别是第八版,有美,英,德,法,日等14个国家的细菌学家参与了编写工作

38、. 在这个系统内,描述了19个部分,296个属,包含一个或许多个种,对每一属和每一个种都做了较详尽的属性描述. 是现在比较有代表性和有参考价值的一个分类系统. “手册”第八版不同于以前所有的版本,尤其是七,八版之间的变化甚大.“手册”第七版包括了比纲到种，亚种的全面的分类大纲和相应的检索表以及各分类单位的描述。将细菌列于原生植物门的第二纲裂殖菌纲，共分十目；假单胞菌目（Pseudomonadales），鞘细菌目（Chlamydobacteriales），生丝微菌目（Hyphomicrobiales）、真细菌目（Eubacteriales）、放线菌目（Actinomycetales）、显核菌目（

39、Caryophanales）、贝日阿托氏菌目（Beggiatoales）、粘细菌目(Myxobacteriales)、螺旋体目(Spirochatales)和枝原体目(Mycoplamatales)等. 但“手册”第八版没有从纲到种的分类系统，而着重于属、种的描述和比较. 它没有分类大纲,而只是根据形态、营养型等分成十九个部分。 把细菌、放线菌、粘细菌、螺旋体和枝原体、立克次氏体等归于原核生物界，下分两个门，六个纲，十九个部分。列表说明如下：原核生物界（Procaryotae） （一） 光能营养原核生物门（Photobacteria） 纲： 蓝绿光合细菌纲 纲： 红色光合细菌纲（第一部分） 纲

40、： 绿色光合细菌纲（第一部分） （二） 化能营养原核生物门（Scotobacteria） 纲： 细菌纲- 第二至第十七部分 纲： 立克次氏体纲（在真核细胞内专性寄生物）-第十八部分 纲： 枝原体纲（无细胞壁的化能营养微生物）-第十九部分 细菌十九个部分的检索表 光能营养的 第一部分 化能营养的 A. 化能矿质营养的 1. 由氮,硫或铁的化合物的氧化取得能量,不从二氧化碳形成甲烷 a. 细胞滑动 第二部分 aa.细胞不滑动 b. 细胞有鞘的 第三部分 bb.细胞无鞘的 第十二部分2. 不氧化氮、硫或铁的化合物，从二氧化碳形成甲烷 第十三部分B。 化能有机营养的1. 细胞滑动 第二部分2.细胞不滑

41、动(第十九部分除外) 第三部分 a.细胞丝条状的和有鞘的 aa. 细胞非丝条状的和有鞘的 b.两分裂的产物不是等量的(具有鞭毛和纤毛之外的附枝或以芽殖而生殖) 第四部分 bb.不如上述 c. 细胞没有僵硬边界 d.细胞螺旋形,有细胞壁 第五部分 dd. 细胞非螺旋形,没有细胞壁 第十九部分 cc. 细胞有僵硬边界 d. 革兰氏阴性 e. 专性细胞内寄生菌 第十八部分 ee.不如上述 f.弯曲杆菌 第六部分 ff.非弯曲杆菌 g.杆菌 h.好氧性 第七部分 hh.兼性厌氧的 第八部分 hhh.厌氧性 第九部分 gg.球菌或球杆菌 h.好氧性 第十部分 第七部分 hh.厌氧性 第十一部分dd.革兰

42、氏阳性e.球菌 f.形成内生孢子 第十五部分 ff.不形成内生孢子 第十四部分ee.杆菌或呈丝条 f.形成内生孢子 第十五部分 ff.不形成内生孢子 g.直形杆菌 第十六部分 第十七部分 gg.不规则形杆菌（棒杆菌型）或趋向于形成丝条或丝条状 第十七部分有关十九个部分中，各部分的目、科、属介绍，见“伯杰氏鉴定细菌学手册”第八版。二.放线菌的分类系统放线菌的分类系统比较多,其中较在代表性,用得较广的主要有:美国瓦克斯曼(Waksman,1961)的分类系统；苏联克拉西里尼科夫（Kpacnnbhnkob 1965）的分类系统。这两个分类系统都是以形态特征为主来划分科属的。1971年美国Lechev

43、a-lier提出了一个新的分类检索表，它以形态和细胞壁化学成份相结合的方法来划分科、属。中国科学院吸收了瓦氏和克氏两个分类系统的优点，也拟定了一个划分科属的分类检索表。由于各家的观点不一，放线菌止以下科属排列也不一样，学名也不完全一致（中国科学院的分类系统与瓦氏分类系统学名相同），应用时要注意加以区别。下面介绍中国科学院放线菌目分科分属检索表。菌丝体多方向分裂形成或迭的立方形细胞嗜皮菌科(Dermatophilaceae) 1.人和动物皮肤寄生菌嗜皮菌属(Dermatophilus) 2.土壤微生物地嗜皮菌属(Geodermatophilus)放线菌中的植物共生菌弗兰克氏菌科(Frankiac

44、eae) 1弗兰克氏菌属（Frankia） 基内菌丝体分裂成杆菌或球菌状小体放线菌科(Actinomycetaceae) 1.只有基内菌丝体，无气生菌丝体，厌氧放线菌属(Actinomyces)2.只有基内菌丝体,无气生菌丝体,好氧罗氏菌属(Rothia)3.同放线菌属,但胞壁内有二氨基庚二酸,产丙酸蛛网菌属(Arachmin)4.过氧化氢酶阴性的土壤放线菌农霉菌属(Agromyces)5.有时有气生菌丝,两种菌丝体都断裂成不能运动的小体诺卡氏菌属(Nocardia)6.同5,但小体能运动厄氏菌属(Oerskovin)基内菌丝体不断裂,只有气生菌丝体形成孢子链链霉菌科(Streptomycet

45、aceae) 1.孢子丝形成多种多样链霉菌属(Streptomyces) 2.形成菌核钦氏菌属(Chainia) 3.形成分生孢子器孢器放线菌属(Actinopynidium)孢子单个或成短链寡孢菌科(Paucisporaceae) 1.只有基内菌丝体,无气生菌丝体,孢子单个生长(1)基内菌丝体不分裂小单孢菌属(Micromonospora)(2)基内菌丝体分裂原小单孢菌属(Promicromonospora) 2.有基内和气生菌丝体(1)基内菌丝体分裂,两种菌丝体都产生单个孢子和短孢子链小多孢菌属(Micropolyspora)(2)基内菌丝体不分裂 两种菌丝体上都产生单个孢子高温放线菌属(

46、Thermoactinomyces) 同,孢子柄两歧分枝双歧放线菌属(Actinobifida) 只在气生菌丝体上产生单个孢子高温单孢菌属(Thermomonospora) 只在气生菌丝体上产生纵对的孢子小双孢菌属(Microbispora) 只在气生菌丝体上产生四孢短链小四孢菌属(Microtetraspora)形成孢囊游动放线菌科(Actinoplanaceae) 1.孢囊在菌丝间形成间孢囊菌属(Intrasporangium) 2.孢囊在孢囊柄顶端形成 (1)孢囊孢子能运动 孢囊近球开或不规则,通常无气丝,孢囊孢子具极生或周生鞭毛游动放线菌属(Actinoplanes) 孢囊筒形、瓶形、

47、孢囊孢子杆状极生或周生鞭毛小瓶菌属(Ampulariella) 孢囊球形,孢囊孢子杆状,弯曲,具侧生鞭毛螺孢菌属(Spirillospora) 孢囊指状,孢囊内2-3个孢子,成一直行,能运动指孢囊菌属(Dactylosporangium) 孢囊孢子成纵对，能运动游动双孢菌属(Planobispora) 孢囊成排并列,只含一能运动的孢囊孢子游动单孢菌属(Planomonospora) 孢囊形状很不规则,孢囊孢子短杆状无定形孢囊菌属(Amorphosporangium) 孢囊棒状,孢囊孢子常成对,带一根鞭毛北里菌属(Kitasatoa) (2)孢囊孢子不能运动. 孢囊近球形,孢囊孢子近球形或短杆状

48、孢囊链霉菌属(Streptosporangium) 孢囊棒状,只含一短孢子链小耳孢囊菌属(Streptosporangium) 孢囊球形或长圆,带粗突出物,时常含有1-3个孢囊孢子小棘孢菌属(Microechinospora)三.霉菌的分类系统霉菌(Molds)不是一个分类学上的名词,而是一些丝状真菌的通称.凡是生长在营养基质上,形成绒毛状态、蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌，统称为霉菌。真菌学家对于真菌的分类系统，有很不同的看法，其中以Smith G.M的分类系统比较简明。在Smith G.M的分类系统里，藻状菌纲，子囊菌纲和不完全菌纲中的许多真菌，都是霉菌，所以我们下面介绍的霉菌分类系统也主要是

49、Smith G.M的分类系统。Smith G.M分类系统纲要根据真菌的有性繁殖特点，将其分为三个纲和一个类：一菌丝如存在，通常无隔膜，有性孢子为合子，卵孢子或接合孢子藻状菌纲(Phycomycetes)二.菌丝有隔膜,如无菌丝靠出芽繁殖. (一)有性世代存在. 1.有性孢子为内生在子囊内的子囊孢子子囊菌纲(Ascomycetes) 2.有性孢子为外生在担子上的担孢子担子菌纲(Basidiomycetes) (二)有性世代不详半知菌纲(Fungi imperfecti)、藻状菌纲（Phycomycetes）藻状菌是和真菌中最小的一纲,估计200余属,1,500种.分布很广,水生或陆生,其中包括腐

50、生和寄生的菌种.它们的物征是:(1)典型的无隔多核菌丝体.(2)孢子囊中产生大量的孢囊孢子.(3)有性繁殖形成合子、卵孢子或接合孢子. 根据孢囊孢子能否游动和游动的孢囊孢子鞭毛数目,将藻状菌纲分为三个亚纲如下:一.形成能动的孢囊孢子. (一)孢囊孢子有一根后生单鞭毛单鞭毛菌亚纲(Uniflagellatae) (二)孢囊孢子双鞭毛双鞭毛菌亚纲(Biflagellatae)二.形成不能动的孢囊孢子无鞭毛菌亚纲(Aflagellatae)1.单鞭毛菌亚纲包括三个月：壶菌目（Chytridialer）芽枝菌目（Blastocladiales)单毛水菌目（Monoblepbaridales）2.双鞭毛

51、菌亚纲包括四个目：链壶菌目（Lagenidiales）水霉目(Saprolegniales)水节霉目(Lepronosporales)霜霉菌目（peronosporales）3. 无鞭毛菌亚纲分为两目：毛菌目(Mucorales)虫菌目（Rntomophorales）. 子囊菌纲(Ascormycetes)子囊菌纲是真菌中比较大的一个纲，估计有1.700多属，2.600多种。它们的显著特点是产生子囊。菌体有简单的单细胞至复杂的多细胞结构。有性生殖由两个已分化的或形态无区别的雌雄细胞相结合后形成子囊，或结合后形成造囊丝，再由造囊丝形成子囊，内生子囊孢子。子囊裸露或孢子由菌丝所结成的子囊果中。根据造囊丝和子囊果的有无，将子囊菌分成两个亚纲；一。凡是不产生造囊丝，不形成子囊果的称为半子囊菌亚纲（Hemiascomycetes）.二。凡是产生造囊丝并由此形成子囊，且有子囊果的称为真子囊菌亚纲（Euascomycetes）.1.半子囊菌亚纲包括两个目；内孢霉目（Endomycetales）外囊菌目（Taphrinales）2.真子囊菌亚纲根据子囊果的机构可分为三大类；(1)凡子囊果是封闭无孔口的菌种，属于闭囊壳菌类（Pyrenomyce