HPLC测定板蓝根腺苷含量

1、皖南医学院本科生毕业设计（论文） 2014届本科生毕业设计（论文） 题目：HPLC法测定板蓝根药材中腺苷含量 所 在 学 院药 学 院所 学 专 业药学年级、班级2010级药学(9)班学 号10080257完成人姓名冯学武指导教师姓名张文芝 2014年4月23日HPLC法测定板蓝根药材中腺苷含量摘要 目的：建立一种高效液相色谱法（HPLC）测定板蓝根药材中腺苷的含量。方法：用60%甲醇超声提取板蓝根药材，HPLC法检测腺苷含量，Lichrospher C18柱（4.6mm×250mm，5m）为色谱柱，甲醇-水（10:90）为流动相；检测波长为260nm，流速为1.0ml/min，柱温

2、为30。结果：腺苷在0.198-0.66µg范围内呈现出良好的线性关系，r=0.9993(n=5)；平均回收率为99.68%，RSD%=1.03%。结论：该方法简便快速，测定结果准确可靠，可用于板蓝根药材的质量控制标准。关键词 腺苷；板蓝根；高效液相色谱法Determination of Adenosine Content in Banlangen by HPLC MethodABSTRACTOBJECTIVE: To develop a method for adenosine content in banlangen herbs by HPLC METHOD: Extracted

3、 with 60% methanol content ultrasound banlangen by high performance liquid chromatography, .Eluted with methyl:water(10:90) in a flow rate 1.0ml/min,adenosine was analyzed under the wavelength of 260nm in ODS C18 column, temperature was 30.RESULTS: Adenosine in the range of 0.198-0.66g showed a good

4、 linear relationship, r = 0.9993 (n = 5); average recovery was 99.86%, RSD% = 1.03%. CONCLUSION: The method is simple, rapid, accurate and reliable measurement results can be used for quality control of banlangenKey words: Banlangen HPLC method Adenosine 第 1 页 共 2页目 录 中文摘要1英文摘要1 1引言12仪器材料12.1 实验仪器12

5、.2试剂药品13 方法13.1实验原理13.2色谱条件13.2.1检测波长选择13.2.2最佳色谱条件13.3 对照品溶液的制备13.4 供试品溶液的制备13.5 线性关系考察23.6 精密度试验23.7稳定性试验23.8重复性试验2 3.9加样回收试验24.讨论35.结论 36 参考文献57 致谢6第 0 页 共 1 页1 引言板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatisindigotica Fort.的干燥根,中国药典1985一2010年版一直有收载,具有性寒味苦,有清热解毒、凉血消肿的功效,临床应用广泛。而中国药典未规定其质量控制的含量测定方法和指标。腺苷是板蓝根所含的一种天然成分,具有抗

6、凝血、抗扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经和抗心率不齐的作用1，板蓝根药材是公认的具有抗病毒的有效中药，在临床中广泛使用。尽管对它们已作了很多研究，但其有效成分及其作用机理尚未有确切的结论，几十年来板蓝根药材及其制剂的质量监控一直未能解决2.3。文献报道中有人主张它们的质量控制指标应选靛蓝、靛玉红。但也有人认为“抗内毒素试验表明:靛蓝和靛玉红不具有抗内毒素活性。”4而它们的水溶性成分却具有很强的抗病毒、抗菌、抗内毒素、增强机体免疫作用。口前含板蓝根制剂多采用水作为提取溶剂，而靛蓝和靛玉红具有很强的脂溶性，有人对水提取液的靛蓝、靛玉红作了含量测定，结果发现其提取率仅为1.5% -3.5

7、%。此外，浓缩过程的损失率高达92 4%;在通过提取、浓缩、醇沉、收膏等操作后，其转移率仅为3.3%-13%5.6 。文献报道，板蓝根药材的水溶性成分腺苷，具有抗炎作用6.7，与板蓝根药材功能主治一致。但目前尚未有板蓝根腺苷含量测定的相关报道。腺苷的含量测定方法有薄层扫描法、薄层一紫外法、紫外分光度法及高效液相色谱法等。高效液相色谱法具有简便、快速、灵敏、重现性好等特点。通过试验，建立了腺苷含量测定的高效液相色谱法，为板蓝根药材及其制剂的质量控制提供了较为实用的检测方法。1化学成分 到目前为止，己经从板蓝根中分离出近百个化合物，据文献报道主要有以下十一大类。即生物碱类、有机酸类、黄酮类、木脂素

8、类、蒽醌类、甾醇类、芥子类苷、含硫类、氨基酸类、核苷类及其它类化合物。 1.生物碱类化合物1.1吲哚类生物碱:靛蓝(indigotin) ,靛红(isatin)，靛玉红(indirubin) ,靛苷(indoxyl-glucoside)8,2,5-二羟基吲哚(2,5-dihydroxy-indole), 2,3-二氢-4-羟基-O-吲哚-3-乙腈(2.3-dihydro-4-hydroxy-2-oxo-indole-3-acetonitrile),吲哚-3-乙腈-6-O-D-葡萄糖苷(indole-3-acetonitrile-6-O-D-glucopyranoside)9,羟基靛玉红(hyd

9、roxyindirubin)10，依靛蓝酮(isaindigodione)11和(E)-二甲氧羟苄吲哚(E)-3-(3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene)-2-indolinone)12,青黛酮(qingdainone)13, 1-甲氧基-3-乙腈基吲哚，3-乙酸基吲哚，3-吲哚醛(3-formyl-indole), 1一甲氧基一3-吲哚醛14，脱氧鸭嘴花碱酮(deosyvasicinone)15 ,(E)-2-(3-吲哚）腈基亚甲基3-吲哚16 1.2喹唑酮类生物碱:isaindigotone10, 2,4(1H,3H)-喹唑二酮17，色胺酮(tryptant

10、hrin)9,3-(2-羧基苯基-4(3H)-喹唑酮(3-(2-carboxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone), 4(3H)-喹唑酮(4(3H)-quinazolinone)13, 3-羟苯基喹唑酮(3-(2-hydroxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone)11。 1.3喹啉类生物碱:依靛蓝双酮(isaindigotidione)12，板蓝根甲素(Isatan A)31, 3-2-(5-羟甲基)呋喃基-1 (2H)一异喹啉酮-7-O-D-葡萄糖苷(3-2-(5-hydroxymethyl)furyl-1 (2H)-is )quinolinone-7

11、-O-D-glucoside)32, 2，3-二氢-1H- 吡咯并2,1-c1,4苯并二氮杂萝-5.11(10H.11aH)-二酮(2,3-dihydro-1 H-pyrrolo 2,1-c 1,4benzodiazepine-5.,11(1 OH,1 l aH)-dion .)20。 2.有机酸类化合物:吡啶-3-羧酸(3-pyridinecarboxylic acid)，顺丁烯二酸(maleic acid),2-羟基-1,4-苯二甲酸(2-hydroxy-1,4-benzenedicarboxylic acid)，苯甲酸(benzoic acid)，水杨酸(salicylic acid)，

12、丁香酸(syringic acid)18，棕榈酸(palmitic acid),琥珀酸(succinic acid)19,邻氨基苯甲酸(2-amino benzoic acid)20, 5-羟甲基糠酸(5-hydroxymethyl furoic acid)21。 3.黄酮类:新橙皮苷(neohesperidin)，甘草素(liquiritigenin)，异甘草素(isoliquiritigenin)22 ,异杜荆苷(isovitexin)，蒙花苷(linarin)20，半齿泽兰素(eupatorin)15 。 4.木脂素类:(-)关落叶松脂素(-)-lariciresinol)，落叶松脂素-

13、4-O-D葡萄糖苷(la -iciresinol-4-O-D-glucopyranoside)，落叶松脂素-4，4-二-O-D-葡萄糖苷(la -iciresinol-4,4-di-O-D-glucopyranoside) , 4-(1,2,3一三羟基丙基）-2,6-二甲氧基苯基-1-O-D-葡萄糖苷(4-(1.2,3-trihydroxypropyl)-2,6-dimethoxyphenyl-l-O-D-glucopyranoside),紫丁香苷(syringin)13(+)-异落叶松脂素(+)-isolariciresinol)15 。 5. 蒽醌类化合物:大黄素(emodin)6，大黄素

14、-8-O-D-糖苷(emodin-8-O-D-glucoside)20。 6.甾醇类化合物:-谷多醇（-sitosterol)，胡萝卜昔(daucosterol)20 ,-谷甾醇(-sitosterol )24，扶桑甾醇。 7.芥子苷类化合物:黑芥子苷(sinigrin),葡萄糖芸薹素(3-indolylmethyl gluosinolate)，新葡萄糖芸薹素(neoglucobrassicin), 1-硫代-3-吲哚甲基芥子油苷(1-sulpho-3-indolylmethylgluosinolate)25。 8.含硫类化合物:表告依春(epigoitrin) , 1-硫氰基-2-羟基一3-

15、丁烯(1-thiocyano-2-hydroxy-3-butene)26。 9.氨基酸类化合物:脯氨酸(praline)，精氨酸(arginine),酪氨酸(tyrosine),缬氨酸(valine),谷氮酸(glutamate acid),-氨基丁酸(-aminobutyric acid)23，亮氨酸，色氨酸，天门冬氨酸.苏氨酸，丝氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，赖氨酸。 10.核苷类化合物:尿苷(uridine)，次黄嘌呤(hypoxanthine)，尿嘧啶(uracil)，腺苷(adenosine)，鸟嘌呤(guanine)13。 11.其他类:甲酸铵22，蔗糖(suc

16、rose), 5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furaldehyde), n-丁基-O-D-毗喃果糖21,n-丁基-O-D-塔格糖苷27，甘露醇mannitol 26，焦脱镁叶绿酸(pyrophaeophorbidea)13，远志醇(polygalitol)18 。 其他物质 微量元素K, Ca,Mg,Zn, Fe,Cu Mn, Pb,Hg,Ce,Co，Ni,Cd和As其中Ca, M n, Zn, Fe含量较为丰富2药理活性 板蓝根临床上多用于流感等病毒感染性疾病，疗效确切。现代药理研究表明板蓝根具有明显的体内外抗流感病毒活性，抗病毒作用是它的主要药效作用之一。同时由于板蓝根成

17、分复杂多样，经药理试验表明还具有抗菌、清除内毒素等药理活性。2.1抗内毒素作用 多数认为是有机酸类成分有较强清除内毒所作用，而可能的机制为对于内毒素诱生炎性介质(TNF-，I L-6)有抑制作用35。2.2抗病毒作用 水提液、醇提液等有明显的抗流感病毒作用;抗流感病毒活性部位可能为结合氨基酸;有抑制HBsAg活性作用33，腺苷可抑制HSV-1病毒的生物合成，对腮腺炎病毒、疱疹病毒有抑制作用;板蓝根抗病毒可能的机制为保护宿主细胞或直接抑制病毒的活性34。2.3抗菌作用 水浸液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、八联球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、甲型链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌均有

18、抑制作用35。2.4抗炎作用 乙醇提取液可通过对非特异性炎症模型及肉芽肿组织增生的抑制，而发挥抗炎作用。多糖可抑制炎症反应相关基因的表达，减少炎症因子的产生，用于炎症性疾病的防治。2.5免疫调节作用 板蓝根多糖可显著促进小鼠免疫功能。进一步研究表明板蓝根凝集素(属板蓝根多糖)可与细胞表面糖蛋白结合，促进小鼠胸腺的发育和胸腺细胞的增殖，间接地维持胸腺微环境，促进T淋巴细胞、胸腺上皮细胞分泌胸腺素和细胞因子，提高机体的免疫力。从板蓝根二氯甲烷一甲醇(1:1)提取物中分离出的A、B、C、D、E5个流分及其相应的亚流分对人多形核细胞化学发光的影响既有增强作用，又有抑制作用，提不有可能从板蓝根中获得免调

19、节类药物40。2.6活血化瘀作用 从欧洲菘蓝中分离得到尿苷、次黄嘌呤、尿嘧啶、水杨酸等对ADP诱导的家兔血小板聚集表现一定的抑制活性，在0.21mg/ml最终浓度抑制率分别为18.2 %,24.2%、10.8 %, 20 %40.温热病发展到一定阶段常见血小板功能亢进、内外凝血系统激活、血液流变性改变等血瘀证表现。游松等发现板蓝根对二磷酸腺苷(ADP)诱导引起的家兔血小板聚集有明显的抑制作用，并有一定活血化瘀功效，并认为有效成分为尿苷、雌黄嘌呤、尿嘧啶、水杨酸，这些化合物对沟通中药的清热解毒药物与活血化瘀药物之间的联系起着某种积极的作用 。 以上分析可见，板蓝根具有多种药理活性，然而其作用机制

20、和物质基础并未完全阐明，其抗病毒活性是多成分、多靶点、多途径的整合作用结果。3.质量控制以中国药典一部2010年版收载的板蓝根药材质量标准为主对其质量控制现状分析如下: 板蓝根药材质量控制研究现状36373839标准/方法项目主要内容药典标准【基原鉴定】植物来源【性 状】外观、断曲、颜色、气味【鉴 别】显微、荧光、薄层色谱(精氨酸定性检识) 其 他水分、浸出物其他标准/方法【含量测定】指标成分:尿苷、腺苷、氨基酸、有机酸、多糖、靛蓝、靛玉红、表告依春【指纹图谱】化学指纹图谱【生物控制】抑菌活性测定、抗病毒活性测定、生物热力学活性测定等。 以上分析可以看出，常规鉴别在板蓝根药材的定性鉴别方面有一

21、定价值，但以感官鉴别为主，不能很好地进行定量分析，对于丧失外观性状特征的加工品、提取物、制剂等则不能很好的鉴别分析;对于成分的定性/定量检测的研究中，则对板蓝根所含的大类成分几乎均有涉及，但与药效关联性不强、专属性差或无法检测，化学指纹图谱的研究也不能包涵板蓝根的所有化学信息，同样存在关联性不好，重现性差等局限性;生物控制方法有望成为解决板蓝根质量控制难题的有效途径之一，符合中药质量控制研究的新趋势，但目前的研究处于起步阶段，尚无实际应用。 本课题将以板蓝根主要功效和生物活性为指标，尝试以板蓝根药材中水溶性成分腺苷作为质量控制标准进行系统的研究，以期建立板蓝根品质评价与质量控制的检定方法，制订

22、相应质量标准和标准操作规程，与现有药典方法为主要参考，以完善和提高板蓝根现有的质量标准和质控水平。2 仪器材料2.1 实验仪器LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津），SPD-M20A型紫外检测器（日本岛津），超声清洗器（KQ3200E型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司），容量瓶，微量注射器，分析天平（FA2004型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司）粉碎机，回流装置，微波炉2.2 试剂药品 板蓝根药材（购于亳州市贡药饮片厂），腺苷对照品（沪试商标，国药集团化学试剂有限公司），甲醇为色谱纯（沪试商标，国药集团化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水（皖南医学院药学实验中心供）3

23、 方法3.1实验原理 高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的淋洗液和固定相间的分配系数不同，但是杨岁流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两相间进行反复多次（103-106)的分配（吸附-脱附-放出）由于固定相对各种组分的媳妇能力不同（既保存作用不同），因此各组分在色谱柱的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。3.2色谱条件3.2.1检测波长选择 取腺苷对照品，加流动相制成每1ml中含20g的溶液，用紫外检测对其扫描，发现腺苷标准品在260nm处有最大吸收，且没有干扰，因而选择260nm为最佳检测波

24、长3.2.2最佳色谱条件 十八烷基硅烷键合硅胶填充剂作为色谱柱；甲醇水（10:90）为流动相；检测波长260nm；流速为1.0mL/min；柱温为30。3.3对照品溶液的制备 精密称取腺苷对照品6.6 mg，置50 ml容量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，制成浓度为0.132 mg/ml标准液备用3.4 供试液溶液的制备 取买来的市售板蓝根药材块，研碎成粉末（过40目筛），精密称取板蓝根药材粉末1g，置50ml具塞锥形瓶中，分别精密加入60%甲醇20mL，称定重量，超声提取（功率250W频率20kHz)30 min，取出过滤，冷却后加入60%甲醇补足重量，于0.5m微孔滤

25、膜过滤，取续滤液即得供试品溶液3.5线性关系的考察 精密量取储备液0.6ml、1.0ml 、1.3ml 、1.7ml 与2.0ml于10ml容量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度，高效液相色谱仪测定峰面积。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，y=5252.1x-323.21，相关系数为0.9993，腺苷进样量在0.198-0.66g范围有良好的线性关系。结果见下表、 表1 线性关系实验进样量（g)0.198 0.33 0.429 0.561 0.66峰面积(Au)724.113 1424.341 1886.184 2642.900 3145.497 方程y=5252.1x

26、-323.21 R2=0.99933.6精密度试验 取腺苷对照品溶液25l重复进样5次，按上述实验方法项下的色谱条件测定，测得的峰面积如下： 35.5778, 35.5569, 35.6554, 35.4050, 35.7046, ，RSD%=0.377%，表明仪器精密度良好。3.7稳定性试验 取新制备的供试品溶液，分别于0,2，4，8,12h测定峰面积，测定的峰面积如下:25.1987,25.5894,25.4876,25.3365, 25.6966, RSD%=0.19%，表明供试品溶液在12h内稳定。3.8重复性试验取同一批号的板蓝根药材3份，按供试品项制备供试液，得板蓝根颗粒的RSD%

27、=1.58%，表明方法重现性良好。 供试品重复性实验图谱3.9加样回收实验取同一批号的板蓝根药材0.5g，精密称定，平行5份，精密加入适量的腺有对照品溶液，按“3.4"项下制备供试品溶液并测定。(见表2) 表2加样回收实验 编号样品腺苷含量（mg)加入腺苷含量（mg)测得量（mg)回收率%平均回收率%RSD 10.19920.15900.356598.8799.681.03% 20.21350.19880.407899.75 30.21090.27820.487899.53 40.24950.31800.559697.50 50.23320.39750.629799.75由上表可得平

28、均回收率为99.68%，且回收率均在95%-105%之间，符合HPLC定量分析的要求。3.10样品含量的测定 取不同来源的板蓝根药材3批，精密称定1g，粉碎，过3号筛，按供试品溶液的制备方法项制备，进样测定腺有含量，3种来源的板蓝根药材的腺含量有差别显著。(见表3） 表3 不同来源的板蓝根药材中腺苷含量 来源亳州市贡药饮片厂河北省安国市瑞琪中药材有限公司亳州养生坊中药材专售含量（g/g)160.6216.3110.824讨论1.现代药理研究发现板蓝根具有多方面药理作用。目前，板蓝根及其制剂的质量控制多以靛蓝、靛玉红的含量测定(高效液相色谱法)为指标，而板蓝根中靛蓝、靛玉红的含量仅为百万分之几，

29、且样品溶液的制备需用氯仿回流提取很长时间(回流提取一次8h或回流提取3次，每次2h)，因而不利于板蓝根饮片炮制或板蓝根制剂制备工艺的筛选控制和成品质量控制。板蓝根所含的腺苷具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经和抗心率不齐的作用1，在板蓝根中含量较高(约0.2 mg/g)，且化学性质稳定，用高效液相色谱法便于测定其含量，操作简便、易行。2. 样品处理方式的选择，包括提取溶剂的考察和提取方式的考察，据谢宗明等人的实验参考，在不同比例的溶剂中，60%甲醇提取板蓝根药材效率最高，超声提取腺苷的效率也明显高于回流提取，且方法更高效方便443. 通过对来自不同厂家的板蓝根药材的核苷类成

30、分的分析，发现腺苷的含量差别很大，含量高的达216g/g，含量低的仅10.82 g/g。另由陈矛等人的研究也同样证实了这一点43。腺苷的含量水平反映了板蓝根药材的用量，我们通过对提取工艺过程中腺苷转移率的考察表明，腺苷的转移率达90%以上。板蓝根中药材用量的悬殊的差别严重影响了板蓝根药材的质量和疗效，影响了板蓝根中成药的市场形象，由此可见，制订能够反映板蓝根颗粒中板蓝根药材用量的含量标准对于质量控制非常重要。 4.流动相选择根据文献报道41 -45先后用分别以甲醇-水（10:90）、乙腈-水（4：96）、甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（15:85）、甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=7.3)(

31、10：90)等为流动相进行考察，结果以甲醇-水（10:90）为流动相，所得腺苷峰型良好，峰型尖锐且对称性号，分离度高，效果较好。 5 结论 通过以上实验分析，表明HPLC法测定板蓝根药材含量样品处理方法便捷，测定方法简单，测定结果准确可靠，方法学验证结果也符合规定，为测定板蓝根中腺苷建立了一个稳定可靠的定量分析方法。 考文参献1 张敏如洪亮郭群.高效液相色谱法测定发酵虫草菌粉和金水宝胶囊中腺苷的含量J.中草药1994.25(2): 772 张润珍张玉文.板蓝根的研究进展J.中草药2000 31( 6 ):474-4773 周海燕，薄少英，安静，等.板蓝根的基础研究及临床应用J.北京中医药人学学

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