酶工程第7章酶的别构效应

1、第七章 酶的别构效应一、别构酶与代谢调节一、别构酶与代谢调节二、别构酶的基本概念二、别构酶的基本概念三、别构机制的模式三、别构机制的模式四、引起非双曲线动力学的其他现象四、引起非双曲线动力学的其他现象 酶的别构效应 本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以外的部位，通过外的部位，通过酶分子构象的改变来调节酶的活酶分子构象的改变来调节酶的活性性。这种效应叫做。这种效应叫做别构效应别构效应（all

2、osteric effects），），这种效应剂叫做这种效应剂叫做别构效应剂别构效应剂，受别构效应剂影响，受别构效应剂影响的酶叫的酶叫别构酶别构酶（allosteric enzyme）。）。 一、别构酶与代谢调节 生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应调节酶活性是各种酶活性调节方式中调节酶活性是各种酶活性调节方式中最迅速的最迅速的一种一种，大多数代谢物的反馈抑制就属于别构调，大多数代谢物的反馈抑制就属于

3、别构调节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别构激活作用。构激活作用。 1 1别构抑制作用反馈抑制可分为五种类型：反馈抑制可分为五种类型： 线性通路中的反馈抑制线性通路中的反馈抑制一条途径的最终产物抑制途径中起始酶的活性。一条途径的最终产物抑制途径中起始酶的活性。e1别构抑制作用 趋同通路中的反馈抑制趋同通路中的反馈抑制 为了有效地合成为了有效地合成d，要求，要求b和和c的浓度大致的浓度大致相等。当相等。当c浓度大时，对产生浓度大时，对产生b的途径的最初的的途径的最初的酶有激活作用；当酶有激活作用；当b浓度大时，对产生浓度大时，对产生b的途径的途径的最初

4、的酶有抑制作用。的最初的酶有抑制作用。 别构抑制作用 趋散通路中的反馈抑制趋散通路中的反馈抑制 ec和和ed为两种同工酶，分别受为两种同工酶，分别受c和和d的反馈抑的反馈抑制。当制。当c太多时，不仅抑制从太多时，不仅抑制从b到到c的第一个酶，而的第一个酶，而且抑制从且抑制从a到到b的第一个反应两种同工酶中的一种，的第一个反应两种同工酶中的一种，使得使得b合成的速率下降。合成的速率下降。b的合成不能完全停止，的合成不能完全停止，因为合成因为合成d还需要还需要b。当。当d太多时情况相似。太多时情况相似。 别构抑制作用 顺序反馈抑制顺序反馈抑制 一条途径中有多个反馈抑制步骤。一条途径中有多个反馈抑制

5、步骤。 协调反馈抑制协调反馈抑制 需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制作用。作用。 2 2别构激活作用 当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，atp大量大量合成，合成，amp和和adp减少，由于减少，由于amp和和adp是异柠是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活乙酰度增高，柠檬酸能激活乙酰coa羧化酶和己糖激羧化酶和己糖激酶，同时抑制酶，同时抑制pfk（磷酸果糖激酶）。激活乙酰

6、（磷酸果糖激酶）。激活乙酰coa羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶且抑制且抑制pfk，可使，可使g-6-p更多地进入磷酸戊糖途径，更多地进入磷酸戊糖途径，合成更多的合成更多的nadph，供脂肪酸合成使用。，供脂肪酸合成使用。 二、别构酶的基本概念1一个典型的别构酶一个典型的别构酶天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶 天冬氨酸转氨甲酰酶（天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate trans-carbamoylase, atc）是嘧啶核苷酸生物合成途）是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一个酶（径的第一个酶（ utp ctp）。）。天冬氨酸转氨甲酰酶 atc的活性受

7、到的活性受到ctp的强烈抑制，又受到的强烈抑制，又受到atp的高效激活。的高效激活。天冬氨酸转氨甲酰酶 在对照、加在对照、加atp、加、加ctp三种情况的三种情况的v对对s图中可以看出，对照呈图中可以看出，对照呈s形曲线而不是双曲形曲线而不是双曲线；加线；加atp减小了反应的表观减小了反应的表观km值，使曲线向值，使曲线向双曲线靠近；加双曲线靠近；加ctp增大了反应的表观增大了反应的表观km值，值，使曲线的使曲线的s形更加明显。加形更加明显。加atp和和ctp并不影并不影响响vm。 天冬氨酸转氨甲酰酶atc的结构与功能 为了解释这种现象，研究者设想在酶分子中为了解释这种现象，研究者设想在酶分子

8、中有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另一个部位是反应，另一个部位是atp或或ctp等效应剂的结合等效应剂的结合位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，atc的活性并不丧失，但对的活性并不丧失，但对ctp抑制的敏感性下抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道，实了两个部位的设想。现在我们知道，atc由由12条多肽链组成，条多肽链组成，2个个3亚基，亚基，3个个2亚基。亚基。 atcase的亚基结合方式rrccat

9、c 的特点 根据对根据对atc的研究，得出了的研究，得出了5点结论：点结论： 酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位。位。 这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。 调节部位可与多种效应剂结合，并产生不同的效应。调节部位可与多种效应剂结合，并产生不同的效应。 效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶与底物效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶与底物的结合能力和催化能力。的结合能力和催化能力。 调节部位的

10、效应是构成别构抑制或别构激活的基础，调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而后两者又是代谢调节的有效方式之一。而后两者又是代谢调节的有效方式之一。 2 2别构酶的协同效应 协同效应（协同效应（cooperative effects）也是多亚）也是多亚基别构酶的一个特征。能与酶结合的底物、激基别构酶的一个特征。能与酶结合的底物、激活剂和抑制剂统称配体，所谓协同效应是指当活剂和抑制剂统称配体，所谓协同效应是指当一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个配体与酶结合。个配体与酶结合。 （1 1）协同效应的分类 同种效应和异种效应同种效应和异种效应 同种

11、同种效应（效应（homotropic effects）指的是一）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的结合；异种效应（酶的结合；异种效应（heterotropic effects）指）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与配体与酶的结合。酶的结合。 协同效应的分类 正协同和负协同正协同和负协同 一分子配体与酶结合后促进另一分子配体一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶结合叫正协同（与酶结合叫正协同（positive cooperation），抑），抑制另一分子配体与酶结合叫负协同（制另一分

12、子配体与酶结合叫负协同（negative cooperation）。）。 同种效应一般是正协同；异种效应有正协同种效应一般是正协同；异种效应有正协同，也有负协同。同，也有负协同。 （2 2）协同效应的鉴别方法 通过动力学作图，可以鉴别底物之间的正通过动力学作图，可以鉴别底物之间的正协同、负协同和无协同。协同、负协同和无协同。 动力学作图法鉴别协同效应（3 3）协同指数和协同系数 协同指数协同指数（cooperative index，ci）是指）是指酶的底物结合位点被底物饱和酶的底物结合位点被底物饱和90%和饱和和饱和10%（即（即v = 0.9vm和和v = 0.1vm）时的底物浓度之）时的底

13、物浓度之比 ， 故 协 同 指 数 又 称比 ， 故 协 同 指 数 又 称 饱 和 比 值饱 和 比 值 （ r a t i o saturation，rs）。）。 对于一个可结合对于一个可结合n个底物分子的酶，其反应式个底物分子的酶，其反应式可用下式表示：可用下式表示：按米氏方程的推导过程可得按米氏方程的推导过程可得式中式中 这里假设这里假设n n个底物是同时结合上去和同时解离个底物是同时结合上去和同时解离下来的。下来的。 协同系数nsnmsksvvnnsessekreturn协同系数当当v = 0.9vm 时，时，s0.9 = ；当当v = 0.1vm 时，时，s0.1 = 。 nsk1

14、)9(nsk1)91(1 . 09 . 0ssn181ci = rs = =协同系数 n 的意义 因此，当因此，当n1时，时，ci81，和以前讲过的单，和以前讲过的单底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当当n 1时，时，ci 81，为正协同，表示，为正协同，表示v对对s改变改变的灵敏度增加，且的灵敏度增加，且n越大正协同效应越大；当越大正协同效应越大；当n 81，为负协同，表示，为负协同，表示v对对s改变的灵敏改变的灵敏度减小，且度减小，且n越小负协同效应越大。越小负协同效应越大。n值即为协同值即为协同系数系数。 1 . 09 . 0ssn181

15、ci = rs = =n 值的理论错误 从理论上推导上式时，从理论上推导上式时，n是与酶结合的底是与酶结合的底物分子数，但实际上测出的物分子数，但实际上测出的n值（测定方法见值（测定方法见后）有小于后）有小于1的情况。上面说的的情况。上面说的n 1、n1、n s0.9或或 s s0.1），），n常等于常等于1，故在一个广泛的，故在一个广泛的s范围内范围内作图时，得到的是折线。作图时，得到的是折线。 n值与底物结合位点数的关系 hill模式忽略了模式忽略了es，es2，esn-1等形式的存等形式的存在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响，根据影响

16、，根据hill作图计算出来的作图计算出来的n值往往小于酶对值往往小于酶对底物的结合位点数，底物的结合位点数，hb（hemoglobin，血红蛋白），血红蛋白）上有上有4个个o2结合位点，但计算的结果是结合位点，但计算的结果是n2.62.8。在负协同效应中，每分子酶也结合在负协同效应中，每分子酶也结合n个底物，但计个底物，但计算的结果却是算的结果却是n k2 k3 k4是正协同是正协同性，性，k1 k2 k3k2k3k4（内在解离常数）为正协同效应，（内在解离常数）为正协同效应，k1k2k3k4为负协同效应。为负协同效应。 四、引起非双曲线动力学的其他现象1酶的记忆现象酶的记忆现象 有些单体酶能

17、有些单体酶能表现出表现出s形曲线，这也是因为形曲线，这也是因为别构效应引起的。别构效应引起的。1967年年rabin提出酶提出酶底物底物复合物能进行异构作用的机制来解释复合物能进行异构作用的机制来解释s形形曲线。曲线。 es必须先缓慢地异构成必须先缓慢地异构成fs，然后快速地分，然后快速地分解（解（break down）成）成f和和p，f能够回复到能够回复到e，也，也可以直接与可以直接与s结合形成结合形成fs。 return酶的记忆现象引起s形曲线的机理 在低浓度在低浓度s时，酶主要以时，酶主要以e和和es形式存在，形式存在，产物形成速度被缓慢的产物形成速度被缓慢的 异构化作用所异构化作用所限

18、制。由于限制。由于s低，低，f有较多的比例回复到了有较多的比例回复到了e，只有少量的只有少量的f直接与直接与s结合成结合成fs。当。当s高时，有高时，有较多的较多的f直接与直接与s结合成结合成fs，由于直接生成，由于直接生成fs，避免了避免了 这个限速步骤，所以大幅度地这个限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现出加快了反应速度，从而表现出s形曲线。形曲线。 反应式反应式别构效应剂对记忆酶的影响 别构激活剂与别构激活剂与e结合后可以提高异构化速结合后可以提高异构化速率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影响应剂通过影响k4及及k1也会影响也会

19、影响s形曲线的形状。形曲线的形状。 记忆酶举例 fs释放出释放出产物产物后仍保持后仍保持f构象可以认为是构象可以认为是一种一种“记忆记忆”现象。有记忆现象的酶称为记忆现象。有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双酶。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中的己糖激酶都是典型的记忆酶。的己糖激酶都是典型的记忆酶。 2 2可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因素 酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。 底物和激活剂形成底物和激活剂形成复合物，如复合物，如atp-mg2+，当，

20、当atp与与mg2+ 以以1:1混合后以不同的量加到反应体系混合后以不同的量加到反应体系中，则加的量增加中，则加的量增加1倍，倍，atp-mg2+ 增加不止增加不止1倍。倍。 酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的底物不能作酶的底物。在低底物不能作酶的底物。在低s时，有较大比例的时，有较大比例的s与杂质结合，而在较高与杂质结合，而在较高s时，与杂质结合的时，与杂质结合的s比例比例下降，所以表现出正协同假象。下降，所以表现出正协同假象。 可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因素 随机机制的双底物反应随机机制的双底物反应 如果如果eeaeab途径快于途

21、径快于eebeab途途径，则当径，则当a或或b有一种饱和时，有一种饱和时，v对另一种底物浓对另一种底物浓度的关系约为双曲线。但如果是度的关系约为双曲线。但如果是b低于饱和浓度低于饱和浓度（a不行），则不行），则v对对a的关系为的关系为s形曲线，形曲线， 因为因为在在a很低时，很低时，e主要与高浓度的主要与高浓度的b结合，使反应主要走结合，使反应主要走eebeab这条慢途径，整个反应速度较慢；随着这条慢途径，整个反应速度较慢；随着a的增加，快途的增加，快途径占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出径占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出s形形曲线。曲线。 可引起正协同作用动力学

22、曲线假象的其它因素 酶对底物有极高的亲和力酶对底物有极高的亲和力 如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学参数，往往要使用较低的底物浓度，参数，往往要使用较低的底物浓度，即即s不特大于不特大于e（因为底物浓度不太高时，酶就处于（因为底物浓度不太高时，酶就处于被底物饱和被底物饱和的状态，为零级反应，没有变化，所以无法测定动的状态，为零级反应，没有变化，所以无法测定动力学参数）。在这种条件下力学参数）。在这种条件下 不能约等于不能约等于 。 ) () (0esesseseksess s可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因素 酶对底物有极高的亲和力酶对底物有极高的亲和力其双倒数方程为：其双倒数方程为：1 41) (11) (112102002seskeskeskvmm 双倒数作图会表现出假的正协双倒数作图会表现出假的正协同现象。如果酶反应速