植物生殖工程

1、植物生殖工程第一节 植物生殖工程的概念与概况一、植物生殖工程的概念与研究范围植物生殖工程(plant reproduction engineering或plant reproductive ceIl engineering)是通过控制和利用植物有性生殖过程而改良植物的应用技术领域，主要指在离体条件下以生殖细胞和原生质体为对象所进行的遗传操作。它是当前生殖生物学研究的一个热点。植物生殖工程是建立在植物生殖生物学和实验生殖生物学的基础上的，三者之间相互联系、相互促进。杨弘远和周嫦(1989)认为，植物生殖生物学是以认识植物生殖过程的自然规律为基础的研究学科，植物生殖工程是进行改良植物的应用技术领域

2、，而实验生殖生物学则是把二者联结起来的桥梁。植物生殖工程包括整个有性生殖过程的控制和利用，比受精工程(fertilization engineering)的范围更广，改造植物遗传性的能动性更强。植物生殖工程操作的对象是生殖的器官、细胞，与体细胞工程比较具有独特的优点。有性生殖是大多数植物的自然生殖过程，是无性生殖或无融合生殖过程所不能取代的。这种顺乎自然的繁衍后代的生殖过程是一种阻力较少的途径。生殖过程中提供了许多基因操作的机会，如花粉管是引导雄配子完成受精作用的运载工具，具有作为外源基因载体的功能。植物生殖系统中拥有许多天然的单倍体细胞，可以直接制备单倍体原生质体。在雄性生殖系统中包括小孢子

3、四分体、小孢子、花粉粒、花粉管、生殖细胞、精子。在雌性生殖系统中包括有大孢子、胚囊、卵细胞及其他胚囊成员细胞。这些细胞都是单倍体。精细胞为天然原生质体，卵器细胞、中央细胞在一定阶段存在半原生质体状态。操作这种天然的原生质体比酶法分离原生质体更具优点。生殖系统中丰富多样的细胞类型可用于不同研究途径。单倍性的生殖细胞经过减数分裂发生了各种形式的遗传重组，具有极大的遗传变异性，因此通过生殖工程操作可以直接获得各种类型的新个体(杨弘远、周嫦，1989；胡适宜，1986；Bajaj，1983)。植物生殖工程包括二大生殖系统：雄性生殖系统和雌性生殖系统；两种操作方式：活体操作(in vivo manipu

4、lation)和离体操作(in vitro manipulation)；三个研究水平：即器官、细胞和原生质体水平。器官操作包括花药培养、子房培养和胚珠培养、胚和胚乳培养、试管受精等。细胞操作主要是指花粉和胚囊的分离和培养；原生质体操作是指由四分体或胚囊细胞分离而获得原生质体并进行培养；受精工程即离体的精卵细胞的融合和培养。二、植物生殖工程研究简介1.离体器官操作(1)试管授粉 试管授粉或试管受精是指为了克服交配的不亲和性，离体培养子房或胚珠而在试管中完成受精过程。这种技术已较广泛地应用于克服远缘杂交或自交不亲和性。(2)子房和胚珠培养 它包括受精或未受精子房和胚珠培养。受精子房和胚珠培养的目的

5、也是在于克服杂交或自交胚的败育，详见第六章。未受精子房和胚珠培养既是诱导卵器细胞形成单倍体植株进行单倍体育种的途径，又是研究人工诱导无融合生殖和实验生殖生物学的好方法，下一节中将予以详细介绍。(3)胚和胚乳培养 胚培养是克服远缘杂交困难经常采用的方法(见第七章)。胚乳是极核受精的产物，一般多为3n。因此进行胚乳培养的目的之一，在于培养三倍体植株以获得无籽的瓜果，如无籽西瓜、无籽柑桔和无籽枇杷等。(4)花药培养 离体培养花药是大量获得单倍体进行单倍体育种和遗传学研究的重要技术，也是研究雄核发育(androgensis)等生殖生物学问题的良好方法。(5)再生雄蕊和花粉的研究 离体再生雄蕊和花粉对于

6、研究整个雄性系统的发育和调控具有十分重要的意义。该项研究首先由陆文梁(1988)在风信子上获得成功。2.离体细胞的操作(1)大孢子母细胞、大抱子和胚囊的分离 大孢子母细胞、大孢子和胚囊被子房壁、珠被、珠心组织所包裹，长期以来不能直接研究和利用。自从70年代前苏联学者用酶法分离烟草、列当活胚囊以后，周嫦和杨弘远(1982、1984)，胡适宜等(1985)改进技术方法，采用酶解、振荡分离纯化技术或压片技术获得固定的或生活的大孢子母细胞、大孢子和胚囊。在烟草、泡桐、芝麻、颠茄、金鱼草等植物中获得成功，为直接研究这些细胞和进行遗传操作奠定了基础。(2)花粉培养 花粉培养是吸收花药培养的经验，直接培养游

7、离花粉。花粉培养的优点是：可以直接观察研究培养条件下花粉细胞的发育、脱分化与再分化过程。体细胞组织来源的愈伤组织或胚状体形成的植株及混倍体的频率均可大幅度降低。可以减少体细胞对花粉细胞发育的竞争和抑制作用，提高花粉诱导频率和成苗率。因此花粉培养代表着单倍体育种的发展趋势。花粉培养已在烟草、油菜、水稻等作物中获得成功。3.性细胞原生质体的分离与培养它包括卵及其他胚囊分子的分离、花粉原生质体的分离与培养、生殖细胞与精细胞的分离与培养、配子-体细胞融合的研究、受精工程的尝试等等。卵及其它胚囊分子一般是单倍体，由于它们在受精前后阶段呈部分无壁的天然原生质体状态，加上酶解的分离作用，因此获得的原生质体对

8、于开展生殖工程研究具有十分重要的意义(胡适宜，1986)。虽然在分离活胚囊之后辅以压片技术已能获得烟草、颠茄的卵及其胚囊分子的原生质体(胡适宜等，1985；李乐工和胡适宜，1986)，但是，由于胚囊细胞深藏在胚珠内部，一个胚珠又仅含一个胚囊，如何大批量地获得和收集纯净的胚囊及胚囊中的细胞的关键技术尚未突破。因此，该技术仍处于探索阶段。对于雄性细胞的操作，花粉原生质体、生殖细胞和精细胞的分离和培养，在80年代中后期，已形成一个新的研究热点。目前已从几十种植物中分离出花粉原生质体、生殖细胞和精细胞；利用配子一体细胞融合技术已从矮牵牛、烟草等植物中获得花粉原生质体与体细胞原生质体融合的三倍体植株；利

9、用分离的精子和卵进行确切意义上受精工程的尝试也已经开始(Kranz，1990，1991)，已从受精工程形成的合子诱导发育至愈伤组织并分化出根。人们正期待着受精工程植株再生成功。第二节 未受精子房和胚珠培养一、概况San Noeum(1976，1979)首次利用大麦未受精子房培养出单倍体植株，并采用“离体雌核发育”(in vitro gynogenesis)的术语来说明在离体条件下未受精胚囊细胞产生单倍体植株的现象。该项研究成功的意义在于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花粉培养尚未获成功的物种尤为重要，并且为实验生殖细胞学，特别是雌核发育的研究建立了良好体系，同时为开展植物的遗传工程提供了新的

10、受体(蔡得田和陈冬玲，1986)。经过十几年的研究，目前未受精子房和胚珠培养成功的植物已达7个科19个种(表81)。研究较多地集中在禾本科、茄科及菊科，占全部再生植株物种的23，尤以禾本科植物研究最多，占全部种的13。周嫦和杨弘远(1982)对影响未受精子房和胚珠培养的因素、雌核发育胚胎学、胚囊植株的细胞遗传学曾作过综述。在水稻(周嫦1983)、向日葵 (阎华等1985)、非洲菊中已分别建立起可重复的培养流程。二、未受精子房和胚珠培养的技术未受精子房和胚珠培养的技术因物种不同而有所差异，但均包括以下基本技术程序：选择合适的基因型材料；确定合适的接种期；选择合适的培养基；采用一定的接种方式，如固

11、体培养、液体漂浮培养、平放或直插等；保温培养；染色体鉴定；染色体加倍；胚囊植株及其后代观察。这里仅就两项的方法予以介绍。1.材料的基因型在未受精水稻子房培养中，胚囊愈伤组织的诱导频率依野生稻、籼稻、粳稻的次序而增加(周嫦等，1982；蔡得田，1984；蔡得田等，1988)。在同一类型的水稻中，不同的品种具有不同的诱导频率。如周嫦等试验了19个品种，其中15个粳稻品种全都诱导出胚囊愈伤组织，诱导频率变幅为1.5-2.0；而在籼稻的4个品种中，2个未能诱导出愈伤组织，2个品种的诱导率也较低，分别为1.19和2.8。蔡得田试验的5个种的野生稻中仅从一个种的野生稻子房里诱导出愈伤组织，但未分化出苗；但

12、培养具有无融合生殖特性的多胚水稻时，2个粳稻和2个籼稻品种都诱导出胚囊愈伤组织(蔡得田等，1991)。这种现象是否与无融合生殖特性有关值得考虑。2.接种时期一般以花粉发育时期为接种子房或胚珠的参照时期。确定接种时的胚囊发育时期很重要，对诱导结果有明显影响。目前培养成功的植物大多接种处于胚囊单核至近成熟时期的材料(San Noeum，1979；周嫦和杨弘远，1981；郭仲琛，1982；吴伯骥和郑国锠，1982；黄群飞等，1982；Truong-Andre和Demarly，1984；阎华等，1985；Bornman，1985；蔡得田等，1988；1991)，而接种大孢子发生时期的子房(周嫦和杨弘远

13、，1981；黄群飞等，1982)或过于幼嫩的子房(敖光明等，1982)时，难以诱导雌核发育。尽管在烟草、黄花烟草和在大卫百合(Lilium davidii)等植物中在大孢子发生阶段接种，仍有部分雌核发育始于近成熟的胚囊。特别是周嫦等(1982，1983)观察到接种大孢子时期的水稻子房，要在离体条件下发育到胚囊细胞形成以后才启动雌核发育，而不是由大孢子直接启动胚胎发生。若接种胚囊完全成熟的材料，虽然可被诱导，但频率很低，而且发育前途不大(李国民和杨弘远，1986)。接种近成熟胚囊时期的材料较易诱导成功，这在向日葵的子房和胚珠培养中得到证实(蔡得田和周嫦，1983；阎华等，1985)。玉米的成熟子

14、房不仅比幼嫩子房利于诱导单倍体，还可不经愈伤组织直接出苗(敖光明等，1982)，因此认为接种时期是比选择培养基更重要的因素。三、胚囊植株的起源从现有的雌核发育胚胎学研究看，胚囊植株的起源主要有四种类型：卵细胞孤雌生殖为主。甜菜、向日葵(阎华等，1985)是这种类型的代表：它们的雌核发育起源于卵细胞。此外在大麦(黄群飞等，1982)、青稞(谷祝平与郑国锠，1984)和玉米中，除了以卵细胞孤雌生殖为主外，还有反足细胞的无配子生殖，但这种无配子生殖的前途如何尚未确定。助细胞的无配子生殖。据田惠桥与杨弘远(1984)观察，水稻助细胞的无配子生殖是原胚的主要来源；反足细胞偶尔亦可分裂成类似原胚的结构，但

15、卵细胞仅能进行异常的游离核分裂，出现一种衰退的趋势。这种助细胞的无配子生殖较稳定，不因条件的变化而改变(何才平与杨弘远，1988)，似乎说明这种无配子生殖方式受遗传因子决定。反足细胞无配子生殖。田惠桥和杨弘远(1989)在韭菜(Allium tuberosum)中观察到以反足细胞起源为主的雌核发育，而且能够培养出完整小植株。其他类型。在烟草和黄花烟草中，单倍体既可来自成熟卵细胞，又可来自大孢子(吴伯骥与郑国锠，1982；祝仲纯等，1984)。谷祝平与郑国铝(1983)认为大卫百合是由大孢子直接进行雌核发育的。但是周嫦和杨弘远(1980)曾观察到接种处于大孢子发育阶段的水稻子房需要继续发育到胚囊

16、细胞形成后才启动雌核发育。看来，直接起源于大孢子的雌核发育值得深入研究。四、胚囊植株当代及后代的遗传表现刘中来与周嫦(1984)比较了同一品种在相同培养条件下产生的胚囊植株与花粉植株类型。胚囊植株中的单倍体比例较高，二倍体比例较低，混倍体较少。而且胚囊植株绿苗率高(可达89.3%)，白化苗率低(8.8)，与花粉植株白化苗率高的特点呈鲜明的对比，构成子房培养的一个十分突出，而且十分有意义的特点。尽管胚囊植株当代及二代株系的形态性状和结实性与二倍体花粉植株及原始品种相似，各株系内的植株亦基本整齐一致，但在胚囊植株中也曾出现过不育株的变异。研究其花粉母细胞减数分裂的染色体行为，在中期I发现675的细

17、胞中具数目不等的单倍体。在大卫百合的胚囊植株中也发现23的二倍体和13的单倍体两种类型(谷祝平与郑国锠，1983)。向日葵子房培养则出现混倍及二倍体占优势的胚囊植株群体(Gelebart和San，1987)。在小麦(严健汉等，1979)、水稻(蔡得田等，1991)等禾本科作物中同样发现胚囊植株有白化苗的存在。在非洲菊中，有报道认为胚囊植株较花粉植株更整齐一致，更健壮(Sitbon，1981)。五、胚囊植物遗传工程的受体胚囊作为植物遗传工程受体的优点是：胚囊内的卵细胞、助细胞和中央细胞在子房成熟时期呈现部分无壁的状态。这种天然原生质体状态与酶分离的原生质体相比较，无壁状态持续时间长，没有酶造成的

18、损伤。单倍体。胚囊细胞由单倍体组成，有利于外源基因的引入和表现，不易出现嵌合体。世代交替的转折期与再生潜能。卵细胞正是配子体世代向孢子体世代的转折期，与花粉单核靠边期由孢子向配子体转折相类似，可能具有一定的生理生化特性，易于诱导培养，因此卵细胞具有很强的再生潜能。虽然一般未受精子房或胚珠培养的诱导率为5-10 ，与花粉培养比较相对较低，但每个胚珠只有一个胚囊，胚囊中只有一个卵细胞，所以从细胞水平比较，卵细胞的再生率是高的。胚囊体积大，胚囊壁结构特殊。许多植物胚囊壁由角蛋白或胼胝质组成，有利于遗传操作(蔡得田与陈冬玲，1986)。可能正是基于这样的特点，周光宇等(1983)对受精前后的棉花子房进

19、行DNA微注射引入外源基因选育出了抗枯萎病的棉花品系；罗忠训等(1986)利用水稻未受精子房培养和微注射技术引入玉米醇溶蛋白基因；范云六、吴瑞等同样是利用受精前后子房内的胚囊细胞的特点和花粉通道技术引入外源基因获得转基因植株。第三节 花药和花粉培养一、花药和花粉培养的重要意义花药和花粉培养是人工获得单倍体的重要途径。人工获得单倍体的途径有四种：花药和花粉培养；未受精子房和胚珠培养；染色体消除；半配受精。其中以花药和花粉培养最易大批量地获得单倍体，并且从花药或花粉获得的单倍体植株可斟经自发或诱发染色体加倍而形成纯合二倍体，因此应用得最为广泛。此外，花药内花粉数量多，本身为单倍体细胞，离散性好，发

20、育同步性高，因此在遗传操作中具重要作用。花药培养的简史与现状可参见第四章，本章不再赘述。二、花药培养的基本技术和影响因素花药培养的基本程序包括：挑选适宜的基因型作材料；确定花粉发育时期；材料的预处理；诱导培养；分化培养；染色体数观察和染色体数加倍；花粉植株当代及后代观察鉴定。影响花药培养的因素很多，如材料生理状况和基因型、接种时期、接种方式(如直插、或平放)、培养方式(固体、漂浮、液体浅层连续培养、条件培养等)、培养基（H、N6、C17、B5、禾谷类通用培养基等)、激素、密度效应与条件培养等等。现仅就材料基因型和材料预处理加以阐述。1.材料基因型材料基因型的选择是花药培养中的重要措施。从目前培

21、养成、功的植物种来看，茄科、禾本科、十字花科的植物所占比例较大。花药培养首先在茄科植物毛叶曼陀罗(Guha和Maheshwari，1964；1966)获得成功。在水稻中已从各种类型栽培稻、野生稻的花药培养出单倍体植株(蔡得田等，1991)。水稻的花药愈伤组织诱导率按粳稻、籼稻、野生稻的顺序依次降低，但分化白化苗出现的频率则恰恰相反。此外不同物种的花粉愈伤组织诱导频率不一样，如蔡得田发现尼瓦拉野生稻诱导频率高达23.1，而药用野生稻诱导频率为零。烟草、大麦等不同品种对花粉愈伤组织诱导亦有不同反应(Devaux，1992)。少数具有高度雄核发育能力的玉米基因型已被选育出来，玉米花药可培养性已被联系

22、到一套RFLP标记，并与已知染色体位置相关(Petolino，1992)。2.材料的预处理材料的预处理指的是在花药接种之前，将离体的花蕾或连同花序一起在一定的条件下经过一段时间处理后接种，这样往往司以提高花粉愈伤组织诱导频率。预处理有三种主要方法：低温预处理；离心处理；高温预处理或预培养。一般情况下，接种花药的花粉多处于单核中、晚期。此时花粉(即小孢子)从形态结构上表现极化，即细胞中存在较大的液泡，核处于花粉的一端，正是孢子体向配子体转折的时期。小孢子需要从生理生化特点上准备进行一次重要的细胞分裂(大多数为不均等分裂)。因此采用低温、离心预处理的目的，就是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改

23、变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育前途。实践证明低温预处理显著地提高了诱导频率(Maheshwari等，1982)，甚至可以直接诱导孢子体途径。离心的作用主要在于使花粉的极性分布受到破坏，从而有利于诱导孢子体发育。关于低温预处理的机制有几种可能：低温条件改变了小孢子第一次有丝分裂的轴向，纺锤体的改变导致花粉沿孢子体途径发育。低温预处理使小孢子处于低代谢状态，延长了小孢子的生活力，从而提高了诱导频率。低温预处理可能耗尽花粉中贮藏的物质，致使花粉向配子体途径发展时缺乏原有的物质基础，此时外界因素的诱导有可能使之转向孢子体途径。最后一点在亚微水平研究中得到证实。花粉培养中，花粉胚胎发生的胞质特

24、征是：贮藏物质稀少，细胞器数量少，核糖体密度低，整个细胞质电子密度较低。低温预处理使花粉粒中与辅酶A连接的糖基连结物发生明显的改变，而这些改变与胚胎发生的诱导密切相关。对于高温预处理的作用机制，Dunwell等(1983，1985)的解释是：高温破坏了药壁与小孢子间的发育联系。高温对大多数小孢子是致死的，这样可以减少成活小孢子的数目，减少它们之间的竞争。高温使小孢子发育同步化，增加了处于发育周期中诱导敏感阶段的小孢子数。高温损害非单倍体组织，可以促进单倍体胚的生长。此外，高温处理还引起热刺激蛋白发生，似乎表明钙调蛋白亦起一定作用(Pechan，1991)。三、雄核发育途径、饥饿与花粉二型性雄核

25、发育的途径是根据花药(粉)培养中花粉起始分裂的形式，以及分裂后的细胞在形成花粉胚状体或愈伤组织中的作用而划分。其主要类型有：营养细胞发育；小孢子发育；营养核、生殖核共同发育；生殖核发育；其他发育类型，如游离核型。花粉的二型性(pollen dimorphism)指同一花药中存在两类不同的花粉。一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一致，染色较深；另一类为异常花粉，这类花粉较小，它们的细胞质较淡、染色较浅，发育落后(Dunwell，1992)。Sunderland等在研究花药培养的发育途径中发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花粉胚，因此特称为胚性花粉或E花粉(embryonic pollen

26、)。他们从曼陀罗、烟草等植物中观察到花药(粉)培养诱导率与这种E花粉的多少有关，因此认为选择材料的基因型亦即选择E花粉多的材料，是花药和花粉培养的关键。这种雄核发育与花粉二型性相关的想法在大麦等花药培养中得到一定的验证。但是在一些花粉二型性不明显，而诱导频率较高的植物中，以及象油菜花药培养诱导频率低，而改进后的花粉培养诱导率大为提高的情况下，花粉二型性的解释则值得商榷了。最近应用细胞学、生物化学和分子生物学分析方法对小孢子胚胎发生机制进行研究，获得了极其重要的进展(Dunwell，1992)。Bhojwani等(1973)在烟草花药培养中发现，胚胎发生的小孢子的蛋白质和RNA含量仅及无胚胎发生

27、的花粉粒的六分之一。某些物质的亏缺即“饥饿”被看作是胚胎发生启动的重要条件。Benito等(1988)认为在蔗糖饥饿情况下，诱导启动时培养基中与之有关的组成物是蔗糖。Kyo和Harada(1985，1986)把高度纯合的二核中期花粉培养在含有谷酰胺的基本培养基中，大多数花粉发育成正常的成熟花粉。如果将花粉首先培养在无谷酰胺的培养基中，它们的细胞质则发生退化(Bhojwani等，1973)；当将这些花粉转入具有谷酰胺和蔗糖培养基中时，细胞分裂出现。对于这种谷酰胺“饥饿”时期诱导启动事件进行生化标记研究，发现了一系列特异磷蛋白(Kyo和Harada，1990 ab；Kyo和Ohkawa，1991)

28、。进一步深入研究发现，淀粉合成酶基因和一种尚未鉴定的cDNA克隆NTP C303基因是发生在花粉胚胎发生诱导期间的潜在有用的标记。Vicente等(1992)在研究饥饿时期蛋白质和RNA类型时，也发现两种诱导产生的特异mRNA。对花粉的营养细胞进行细胞周期研究发现，正常的花粉发育过程中，营养核保持或接近于GI期的1C DNA水平。而在饥饿情况下，诱导发生了部分花粉的营养核DNA合成，这表明饥饿诱使营养核通过了一个细胞周期控制点。这个控制点可能是在GI后期，在酵母中称为START。这种类似于酵母中的cdc 10+基因的功能可望得到分析研究。在油菜小孢子培养诱导启动研究中，Hamaoka等(199

29、1)发现，油菜的花粉如同烟草一样，仅仅由营养核参与胚形成，花粉的被诱导启动时间严格限制在8小时以内。Peehan等(1991)研究诱导花粉的mRNA和蛋白质类型，在32情况下培养4小时，发现了一些编码高分子量的蛋白质的基因转录物；双向电泳分析证明一些18、19、20和69kD的蛋白质是小孢子胚胎发生的相关物。这说明热刺激蛋白确实与小孢子细胞的增殖有关。四、花粉培养花粉培养是以游离花粉粒进行直接培养的技术。由于没有药壁的哺育作用，游离花粉培养往往较花药培养困难，起初的诱导频率也很低。以后由于技术的改进，注意处理花药因子与预培养的关系，将花药预培养后再作游离花粉培养，大大地提高了诱导率。花药预培养

30、在早期游离花粉粒培养中起重要作用。小孢子的启动发育离不开花药，药壁组织对小孢子的启动发育可能提供重要的促进物质，称为花药因子。钟华鑫和梁海曼(1981)认为这种作用至少涉及两个方面：在花粉去分化中药壁组织向花粉提供了必要的营养物质。药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质，起着花粉代谢库的作用。改进花粉培养的技术之一是采用液体浅层连续培养方法，把花粉的预培养与花粉的启动分裂和自由离散特性联系在一起。陈之征与陈正华诱导了油菜花粉胚状体。Keller，采用3234高温预培养大大地提高了花粉培养的效果。Chuong和Beversdorf(1985)在油菜游离花粉培养中也获得重大进展，在一定条件下高

31、频率地诱导出胚状体，最高使每个花药的花粉形成54个胚状体。他们成功的关键在于：将适期花药的花粉离散出来，培养在2232条件下：其中以先在32下培养三天，然后转入25下培养34星期的处理效果最好，诱导产生胚状体的总数较对照高出500800。用13 蔗糖改良Nitsch培养基加入1mgL NAA和0.5mgL BA进行诱导培养。由于油菜游离花粉培养的诱导频率远远高于一般花药培养的频率，已能应用于油菜育种实践；利用花粉离散性好的优点，进行诱变筛选和胚胎发生启动机理等方面的研究，也远较花药培养方便。五、花粉植株的遗传研究花药培养产生的花粉植株常出现染色体数和染色体倍数性的各仲变异类型。高等植物的单倍体

32、(haploid)是指具有配子体染色体数目的孢子体。由二倍体植物的花药(粉)培养获得的单倍体只含有一个染色体组，称为一倍体(monoploid)。而由多倍体产生的单倍体花粉植株，虽然其体细胞的染色体数是正常植株体细胞染色体数的一半，但仍含有多个染色体组。1974年在加拿大召开的“高等植物单倍体第一次国际讨论会”上通过了以下名词术语。整单倍体(euhaploid)、一倍体(monohaploid，由二倍体衍生)，多元单倍体(polyhaploid)，非整倍单倍体(aneuhaploid)、二体单倍体(disomic haploid，n+1)，附加单倍体(addition haploid，n+1，

33、n+2等)，缺体单倍体(nullisomic haploid，n-1)，代换单倍体(substitution haploid，n-1 +1)，错分裂单倍体(misdivision haploid)。由于花粉植株既是孢子体又是单倍体，并可由不同染色体组构成，因此描写花粉植株的染色体数公式则与正常的二倍体植株不同。例如水稻花粉植株染色体数公式为2nx12；小麦花粉植株染色体数公式为2n3x21。这里2n表示孢子体，x表示染色体组。花粉植株的倍性与其发生途径有关。烟草花药培养通过胚状体途径形成的花粉植株几乎全是单倍体(Maheshwari等，1982)。禾本科植物花药培养主要经愈伤组织途径形成植株，

34、染色体倍性比较复杂。水稻和小麦花粉植株中以单倍体为主，也有少数二倍体。在小麦中发现有多倍体、混倍体或非整倍体如缺体等。玉米、大麦花粉植株中多数为混倍体，典型单倍体与二倍体植株却较少。二倍体的产生主要是染色体自发加倍。大麦花粉植株自发二倍体可高达59-90(Devaux，1992)。吴妙桑等(1990)对野生稻花粉植株H1H3的遗传性和抗性等进行研究，筛选出高抗病虫的株系和高蛋白质含量的株系，目前正应用于水稻育种中。禾本科花药培养的另一障碍是产生白化苗。在一些野生稻类型的花药培养中甚至全部产生白苗。白苗的产生，虽然与环境条件和培养基组成有关，但与材料的基因型关系很大。在水稻中产生白苗的趋势是野生

35、稻>籼稻>粳稻。野生稻与栽培稻杂交，则以野生稻作母本的杂种白苗频率高于以栽培稻作母本的材料，说明白苗的产生与细胞质有关。王敬驹等对水稻白苗的一系列研究表明，白化苗产生是由手叶绿体不能正常形成，而叶绿体的异常是由于存在于细胞质中的rRNA缺失。第五节 花粉原生质体的分离与培养一、分离与培养的意义从广义上讲，花粉原生质体包括小孢子四分体原生质体、花粉粒原生质体和花粉管原生质体。与体细胞原生质体比较，花粉原生质体具有几个突出的特点：花粉群体数量大，均一性好，取材方便。花粉是一种天然单倍体系统，单倍体在遗传育种及生物工程中有重要作用。利用花粉原生质体可进行花粉发育，如分化与脱分化、壁的生理

36、生化研究。是进行突变研究和配子-体细胞杂交的最有价值的材料。诱导花粉原生质体再生成植株。分离生殖细胞、精子的途径之一；可进而开展离体条件下精卵融合的受精工程(胡适宜，1986，周嫦和杨弘远，1989)。二、四分体原生质体的分离与培养四分体是由小孢子母细胞经减数分裂形成的4个小孢子，具有特殊的壁结构，包藏在共同的胼胝质壁中。胼胝质是不分枝的B-1，3-葡聚糖，它能被蜗牛酶、纤维素酶、崩溃酶等酶解。自从Bhojwani和Cocking在70年代率先开展四分体原生质体的分离，获得原生质体以来，现已从烟草、小麦、黑麦、曼陀罗、颠茄、矮牵牛、麝香百合等多种植物的四分体分离出原生质体。在合适的离体条件下，

37、经过12小时的酶解，就可从四分体获得大量的原生质体，分离率最高可达100。研究表明，四分体原生质体的分离率受介质的渗透压、酶液组成的浓度、酶解时间和pH值的影响(Bajaj，1983)。四分体原生质体经培养能够再生细胞壁，形成管状出芽状、念珠状和椭圆状结构，细胞核可发生几次分裂。采用每天更换新鲜的、不含蔗糖的培养基时，烟草四分体原生质体可发育到二核阶段，频率高达70；一旦转入含蔗糖的培养基，则产生花粉管状结构。由四分体原生质体培养尚未能获得再生植株。利用四分体原生质体进行原生质体融合则获得较大成功。70年代已分离了木豆、玉米、丝瓜和番茄的四分体原生质体。四分体原生质体之间的融合率可达70-80

38、。在适当的培养过程中，约5的异核体(heterokaryon)进一步发生核融合。80年代利用四分体原生质体与体细胞原生质体融合，已在烟草属的种间杂交和矮牵牛属的种间与种内杂交中获得成功，培养出了三倍体杂种植株。这条配子-体细胞杂交途径为选育三倍体品种，特别是优良无籽瓜果品种开辟了新的道路。华中农业大学邓占鳌(Deng，1992)利用此技术已获得柑桔不同种间的体配杂交(gameto somatic hybridization)的胚状体。三、花粉原生质体分离和培养花粉壁一般由含孢粉素的外壁、含纤维素和果胶质的内壁所组成。由于孢粉素是类胡萝卜素酯的氧化多聚化的衍生物，因此性质坚固，具有抗酸和抗生物分

39、解特性，因此突破外壁以获得花粉原生质体的方法甚为重要。70年代至80年代初，主要采用“强攻”的方法。Southworth、Bajaj和Davey 曾分别试用30多种强酸、强碱、强氧化剂和有机溶剂等分解外壁，以及试用多种酶结合机械压力的方法去分离花粉原生质体，但收效甚微。因为采用酸、碱、氧化剂等化学药剂分解外壁的同时往往杀死花粉本身；采用酶类与机械压力相结合的方法仅从烟草、小麦、矮牵牛中分离出少量的花粉原生质体。80年代中后期，在化学分离以及酶法结合水合作用分离上获得重要进展。Loewus等(1985)采用一种多糖剂MMNO·H2O在75下处理麝香百合花粉，能快速溶解外壁和内壁，获得大

40、量原生质体，但因高温和药物毒害致使分离的花粉原生质体没有活性。Bddi等(1987)改进了技术，将花粉在20条件下先溶解壁，得到孢子原生质体(sporoplast)后，再用酶降解内壁获得成活率达60o的原生质体。此后，采用纤维素酶和果胶酶方法，Tanaka等(1987)和周嫦(1988)分别从麝香百合、鸢尾和风雨花近成熟花粉分离出大量原生质体，分离率可达到7080。尤其是从萱草的单核后期至成熟花粉不同发育时期的花粉都分离出大量原生质体。周嫦认为此方法的原理是在水合作用下花粉外壁从萌发孔处开裂，露出内壁，酶液得以接触内壁从而降解内壁，分离出生活原生质体。由此可见，这种分离方法是一种避开含孢粉素外

41、壁而酶解内壁的“巧攻”方法。水合一酶法分离技术的建立为花粉原生质体的分离起了重要的推动作用。此后，在唐菖蒲、黄花菜、含笑、荷花玉兰、紫菜苔、甘蓝型油菜、柑桔等植物中分离出大量生活花粉原生质体。现将花粉原生质体分离与培养的技术介绍如下。（1）花蕾的预处理 周嫦(1989)曾将处于单核后期花粉的萱草花蕾经56低温预处理后加酶分离原生质体。程红(1991)将唐菖蒲、黄花菜、鸢尾、含笑、荷兰玉兰、蚕豆等材料的单核靠边期至二核早期的幼嫩花蕾置于4下低温预处理110天。实验结果表明，未经低温预处理的花粉分离的原生质体不能启动细胞分裂，低温预处理促进了诱导脱分化，启动了细胞分裂。预处理的时间因材料而异。（2

42、）花粉原生质体分离 它包括挤压花粉、水合、酶解、纯化等步骤。挤压花粉是将经过预处理或新鲜的花蕾经表面消毒后，剥离出花药置于装清洗液的培养皿中，用带平头的玻棒挤压出花粉，离心去除残渣。清洗液的成分一般含许多成分如K。、KM8P、渗透压稳定剂、膜稳定剂如1Polybuffer 74、甘露醇和蔗糖等。水合是将花粉置于一定浓度的蔗糖溶液中(如0.51.2molL)，使花粉粒吸收一定的水分后再进行酶解，这样花粉原生质体较易从花粉壁中分离出来。水合的时间随花粉壁的结构(如花粉沟、萌发孔)和花粉发育时期而不同。花粉萌发沟大的一些植物如麝香百合、鸢尾、风雨花等仅需稍加水合就可以转入酶解(即一步法)；花粉发育时

43、期较早的幼嫩花粉也采取一步法分离。而在三沟型花粉的紫菜苔和油菜的较成熟花粉的原生质体分离中则采用二步法，即先经89小时的水合，使其脱除外壁得到去外壁的花粉粒后再转入酶解(李仕琼，1991)。酶解花粉的酶液一般由1左右的纤维素酶和果胶酶、无机盐类(如K3大量元素)、膜稳定剂(如葡聚糖硫酸钾)、渗透稳定剂(如甘露醇)所组成，经过水合的花粉粒置于酶液中酶解。在一步法中，酶液通过外壁裂开处(多在萌发海处)酶解内壁物质，花粉原生质体逐步从裂口处逸出，最后完全从外壁内释放出来，成为完整的原生质体。在二步法中，经足够的水合作用后，花粉粒大多数脱去了外壁，在酶液中花粉内壁充分暴露，随之逐步降解，具内壁的花粉粒

44、由长椭球形逐渐转变为球形，最后形成球形的原生质体。整个酶解过程较快，原生质体分离率较高，而且分离的原生质体具有较高的生活力。纯化酶解完成后，离心弃去酶液，首先加入等渗的清洗液进行离心洗涤，一般洗三次左右。然后在加有甘露醇与蔗糖或Ficoll等介质的清洗液中漂浮纯化原生质体，使破碎细胞沉淀，而收集漂浮在上层液体中的花粉原生质体。下面是李仕琼(1991)采用的紫菜苔和油菜花粉原生质体分离技术流程：制备花粉粒悬浮液：将花粉置于lm01L蔗糖中。挤出花粉粒，然后除去残渣。水合：将花粉粒置于28恒温箱中温育89小时。酶解：将水合后的花粉粒悬浮液离心去上清液，沉淀物用酶液(K3+lmolL甘露醇+1纤维素

45、酶+1果胶酶+0.5葡聚糖硫酸钾)重新悬浮后置于恒温箱中酶解46小时。（3）花粉原生质体的培养 花粉原生质体培养的难度较大，在培养的花粉原生质体中一般能观察到壁的再生，花粉管式的结构，不同形式的管状、念珠状、结节状、哑铃状等培养产物，有时观察到出芽方式的增殖。但这些结构培养的前途不大，增殖到一定程度即停止向前发展，不能再生出植株。当选择的材料和取材时期适宜，改变培养基成份后，周嫦(1989)在萱草幼嫩花粉原生质体的培养中，观察到经花蕾低温预处理的单核后期花粉原生质体启动分裂，并形成了原胚。四、花粉管亚原生质体的分离与培养花粉管壁主要由果胶质、纤维素、胼胝质三种成分构成，可被果胶酶、纤维素酶、胼

46、胝质酶等酶类降解。1973年Power最早从烟草花粉管分离原生质体。经果胶酶和纤维素酶的处理，花粉管释放出含液泡和不含液泡的花粉管原生质体。随后，Condeelis(1974)分离出朱顶红的花粉管原生质体，研究了肌动蛋白与其形态发育关系。80年代后研究进展较快，Pargney利用质壁分离和酶解结合的方法，从黄菖蒲、垂笑君子兰的花粉管中分离出原生质体。朱瀓等(1984，1985)先后从金鱼草、烟草、木番茄(Cuphomandru belacae)等多种植物的花粉管中分离出生活的花粉管亚原生质体。这些植物的花粉管一般能释放二至三个有核或无核的亚原生质体，在烟草中还获得含一个精子的亚原生质体。对金鱼

47、草和烟草花粉管亚原生质体进行了培养，培养物能在用于体细胞原生质体的培养基中进一步生长，再生出壁，长出类似花粉管状的结构。但未能观察到亚原生质体分裂和进一步的发育。朱瀓和胡适宜等认为花粉管亚原生质体具有以下优点：分离方法简便；可收集大量亚原生质体；原生质体的活性高；能获得有核或无核亚原生质体，为细胞工程和遗传工程提供理想的材料。第六节 生殖细胞和精子的分离与培养一、意义与进展生殖细胞和精子都是天然的单倍体，以前只能在活体状况下即在花粉粒或花粉管中对它们进行研究。生殖细胞和精子的分离和培养成功，将使对诸如生殖细胞的形态变化、细胞壁的有无、精子的二型性、精子的生活力与保存等生物学问题的研究更加深入，

48、并为实验操作生殖细胞和精子奠定基础。一些学者在70年代初开始分离出生殖核和营养核进行核的生化研究。至80年代中后期，分离生活的生殖细胞获得重要进展，新的分离技术不断建立。周嫦等采用压片法从多种植物花粉中分离出生殖细胞并进行了细胞生物学研究。但压片法分离的生殖细胞数量有限。为满足对生殖细胞的大量需求，周嫦在分离蚕豆生殖细胞的过程中又建立二步渗透压冲击法，即将花粉在一定浓度的蔗糖溶液中温育一段时间，再加水冲击，造成渗透压骤降，促使花粉大量而同步地破裂释放生殖细胞。Tanaka采用了花粉原生质体释放法，即用酶法分离出花粉原生质体，再用机械搅拌使其破裂释放生殖细胞。用此方法从麝香百合、郁金香、延龄草中

49、分离出生活的生殖细胞。最近，吴新莉和周嫦通过大规模实验，比较研究了四种分离方法，即一步渗透压冲击法、二步渗透压冲击法、低酶法和花粉原生质体释放法。结果成功地从6科11种植物的成熟花粉粒中分离出大量生活的生殖细胞(周嫦和吴新莉，1990；吴新莉和周嫦1991)。她们将11种植物分为三种类型。第一类植物如棉花花粉在蔗糖溶液中容易破裂而释放生殖细胞，所以适用一步法；第二类植物包括烟草、玉帘风雨花、石蒜和风仙花，花粉在蔗糖溶液中容易萌动，加水冲击后，花粉大量同步地破裂，释放出生殖细胞，适于采用二步法；第三类植物有鸢尾、唐菖蒲、黄花菜、韭菜和朱顶红，花粉在蔗糖溶液中既不易破裂，也较难萌发，在一步法、二步

50、法分离较困难的情况下应用低酶法，大幅度地提高了分离率。对第三类植物和第二类的风雨花也可采用花粉原生质体释放法获得大量生殖细胞。因此她们认为，根据各种植物花粉特点采用适宜的方法，是生殖细胞分离成功的关键。徐是雄采用修改的二步法分离黄蝉生殖细胞的成功进一步说明了这一观点。分离精子也始于70年代初。Cass曾以大麦为材料分离精子以观察其形态和运动机能。此后，Russell和Cass在百花丹中观察到精细胞和营养核从花粉中释放的过程。80年代中后期获得突破性的进展，先后分离出9科18种植物的精细胞，它们是百花丹、大麦、玉米、小麦、黑麦、黑麦草、白菜型油菜、甘蓝型油菜、紫菜苔、甘蓝、蔓菁、非洲菊、菠菜、甜

51、菜、蓝猪耳、唐菖蒲、杜鹃花和麝香百合(Russel，1986；Cas。等，1986；MatthysRochon等，1987；Keijzer等，1988；Shivanna等，1988；MatthysRochon等，1987；莫永胜和杨弘远，1991；杨弘远和周嫦，1989)。利用分离的精子进行了一系列的生殖生物学研究，如精子的生活力测定，精子的形态变化和运动，微管对保持精子原有形态的作用，精子的二型性以及雄性生殖单位的形态特征等等。二、生殖细胞的分离与培养（一）分离方法 (1)压片法 压片法即将挤压出的花粉粒滴入载玻片中直接压片，从中分离出生活的生殖细胞。周嫦等首先采用此法从绣球百合中分离出生活

52、的生殖细胞，以后又成功地从三个科7种植物中分离出生殖细胞。她们认为，压片法用于细胞生物学观察是简便有效的，但不适于收集大量生殖细胞以供其他研究用(周嫦和杨弘远，1989)。(2)渗透压冲击法 分一步渗透压冲击法和二步渗透压冲击法。一步法是将花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间使花粉自行破裂释放出生殖细胞。Russell(1986)、吴新莉和周嫦(1991)采用此法把棉花的花粉置于525蔗糖溶液中，使花粉大量破裂分离出生殖细胞，分离率高达85 以上。从鸢尾、烟草、玉帘中也能分离出生殖细胞，但分离率不如棉花，也不如采用二步法等。作者认为适于一步法的植物种类少，而且花粉的发育时期、溶液成分和蔗糖浓度都

53、与分离效果有关。只能采集开花当天的花；溶液中只需要蔗糖而不能添加无机盐类，否则将降低分离率；在低渗条件下易使花粉破裂释放出生殖细胞，若蔗糖浓度增加，分离率降低。二步法是将花粉在等渗蔗糖溶液中温育(即水合)，当部分花粉开始萌动时加入蒸馏水使渗透压突然下降，花粉破裂释放出生殖细胞。该方法分离多种双子叶和单子叶植物的生殖细胞效果都很好。吴新莉和周嫦(1991)认为二步法中起始蔗糖浓度太高则分离率下降。分离玉帘生殖细胞起始蔗糖浓度为15时效果最佳，分离率达66；浓度为22时，分离率下降到23 。其他几种供试植物与玉帘的反应相类似，起始浓度也以15 为佳，但烟草在较高的起始浓度(30)时分离效果最好。(

54、3)低酶法 由吴新莉和周嫦(1991)试验采用，即将花粉置于含少量纤维素酶和果胶酶(一般各0.1)的低渗蔗糖溶液中短时温育而使花粉破裂。在低酶法中酶液浓度十分重要。浓度过高则生殖细胞分离率较低，而且花粉释放物不易分散，生殖细胞较难纯化；浓度为0.05 时分离率最高，生殖细胞的生活力也不影响；浓度低至0.1时分离率有所下降。吴新莉采用此法成功地从鸢尾、韭菜、唐菖蒲、朱顶红、黄花菜等植物的开花前3天至开花当天的花粉中分离出生殖细胞。与渗透压冲击法相比，低酶法不需要加水率击就可以分离出生殖细胞。(4)花粉原生质体释放法 Tanaka采用酶法分离出麝香百合近成熟花粉的原生质体，再用机械搅拌法使原生质体

55、破裂，释放出生殖细胞。吴新莉采用此法从鸢尾、唐菖蒲、黄花菜、韭菜、朱顶红和风雨花等植物花粉中分离出生殖细胞。她认为酶浓度高于0.5时，花粉原生质体和生殖细胞的分离效果均较好。（二）纯化将分离生殖细胞的悬浮液经过25m和10m孔径的尼龙网二次过滤，除去花粉壁等残渣，然后将细胞悬浮液铺于相对高浓度的蔗糖溶液上，在500转分速度下进行间断密度梯度离心12分钟，使生殖细胞降至界面下，其他花粉的颗粒漂于上层。小心吸出上层的溶液，将界面以下的溶液再离心5分钟，使生殖细胞富集于底部即可得到较纯净的生殖细胞。Tanaka用Percoll作离心介质经间断密度梯度离心后从麝香百合分离出较纯净的生殖细胞，分离率为3

56、3.3(引自吴新莉和周嫦，1991)。如果采用低酶法或花粉原生质体释放法，悬浮液经筛网过滤后，尚须离心除去酶液。（三）培养生殖细胞的培养较难。为了提高生殖细胞的分裂频率，吴新莉和周嫦(1991)在材料的前处理、发育时期、培养基等方面作过比较研究。一般是借鉴体细胞原生质体培养的经验如Bead培养方式进行培养。将纯化的生殖细胞与融化的低熔点琼脂糖培养基混匀，在培养皿中央铺一薄层，待凝固后再在周围加入液体培养基。培养温度控制在25左右，黑暗条件下培养，细胞密度为l5×105个ml。应用的培养基有MS、K3和KM8P的基本培养基，添加物有10小牛血清、Polybuffer 74、蔗糖、不同浓

57、度的甘露醇和激素。有时在培养基中放置一定数量的花药作为饲养物(吴新莉和周嫦，1990)。培养过程中部分细胞发生核分裂，形成二至多核细胞。分离出的生殖细胞形状有纺锤形、椭圆形和圆球形等，它们都能进行核分裂，但以圆球形的生殖细胞诱导频率较高。开花前5天的幼嫩花粉比开花前一天的较成熟花粉的生殖细胞易发生核分裂，并易产生多核细胞。低温预处理、K3培养基、添加椰乳，以及一定的激素组合等处理对核分裂有一定的促进作用，但提高频率不明显。徐是雄在BK培养基中黑暗培养黄蝉生殖细胞时观察到多种分裂相，并发现生殖细胞从分裂末期开始已改变了正常的形成两个精子细胞的规律，不形成明显的成膜体连接区。（四）融合生殖细胞的融

58、合有电激融合法和PEG融合法。从使用的融合材料来看，有同种生殖细胞间的同源融合，也有异种生殖细胞之间的异源融合，还有生殖细胞与体细胞原生质体的配子体细胞融合。Ceda等采用电激融合法诱导了麝香百合生殖细胞原生质体之间，以及生殖细胞原生质体与花粉原生质体之间的融合，但未能发生核融合。吴新莉和周嫦(1991)采用PEG法诱导了石蒜、玉帘、朱顶红、黄花菜和鸢尾5种植物同种生殖细胞之间，石蒜和玉帘异种生殖细胞之间，石蒜生殖细胞与花瓣原生质体之间的融合，获得了含二至多个细胞核的同核体和异核体。尤其是石蒜和玉帘各自同源融合率分别达到21.1和23.8。在石蒜中观察到细胞核的融合，多种荧光鉴定表明融合体是生活的。三、精子的分离（一）三细胞花粉的精子分离方法1.研磨法 将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器轻轻研磨，使花粉壁破裂而释放精子。采用此法已从玉米、油菜、甘蓝、非洲菊和紫菜苔中成功地分离出精子(Cass等，1986；Mattys-Rochon等，1987；李仕琼，1991；莫永胜和杨弘远，1991)。周嫦和杨弘远认为该方法较简便，不太依赖于花粉的成熟度与生理状况，但研磨时需要手工精巧，研磨后