层析介质层析填料

1、ge healthcare2 2ge healthcare10/29/2021如何选择凝胶？五大类层析方法 - 1. 凝胶过滤 ( gc)2. 离子交换 ( iex)3. 亲和层析 ( ac)4. 疏水层析 ( hic)5. 反相层析 ( rpc)介质 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高 (source介质例外)物理稳定性 - 新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保持柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性化学稳定性 - 新一代介质能承受极端ph，高盐度，促溶剂和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(cip)，大大延长介质寿命和提高重复性3 3ge healthcare

2、10/29/2021bioprocess 凝胶特别适合生产应用, 特点包括： 高重复性：适用于任何规模的工艺放大 高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介质 寿命特长 高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省凝 胶用量(尤其xl介质，载量可比普通介质高达10倍！) 每种凝胶均有完整的文献、档案和regulatory support file4 4ge healthcare10/29/2021用空柱子须留意使用调节器( flow adaptor ) - 保护柱床的同时更可提高 分辨率，节省凝胶柱子物料须生物兼容，并有尤良的化学抗性加上装柱器( packing reservoir )，可一

3、步把凝胶装满柱 子，大大提高柱效，尤其是凝胶过滤柱柱子的过滤网孔径应该是凝胶颗粒的1/3, 一般10um孔 径就够用，如用source15介质装hr柱和xk柱，须换上5um的网xk柱完全配合akta及各种自装的凝胶，是最佳的选 择5 5ge healthcare10/29/2021线性流速对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较， 一般都换算成线性流速，再作比较： 体积流速 ( ml/min ) x 60 线性流速 (cm/hr) = - 柱子横切面积 (cm2) 线性流速 (cm/hr) x柱子横切面积 (cm2 )体积流速 ( ml/min ) = - 606 6ge healthc

4、are10/29/2021装柱检测检测装柱效果一般用0.5% (30um介质)或2% (90um 介质) 柱体积的1%丙酮测柱效和峰形柱效 hetp=l/n l:柱床高度n=理论塔板数n/m=5.54 x (ve/w1/2)2 * (100/l) 每米理论塔板数ve:保留体积w1/2:半峰高峰宽7 7ge healthcare10/29/2021选择层析方法若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法：用分离范围宽广的凝胶过滤介质如superose, sephacryl hr依据分子量将样品分成不同组份用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质

5、 偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯化；高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品又可直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用8 8ge healthcare10/29/2021融合蛋白质融合蛋白质非融合蛋白质非融合蛋白质表达表达简单纯化简单纯化一步一步 亲和层析亲和层析90 - 97 % 纯度纯度更高纯度更高纯度三步纯化策略三步纯化策略粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化多步纯化多步纯化蛋白质纯化策略9 9ge healthcare10/29/2021准备工作 考虑考虑:纯度水平纯度水平需要量需要量保持生

6、物活性保持生物活性有效和经济有效和经济 蛋白质特性蛋白质特性:稳定性稳定性 - ph - 离子强度离子强度 - 温度温度分子量分子量等电点等电点蛋白蛋白的的疏水性疏水性蛋白蛋白的特异结合的特异结合1010ge healthcare10/29/2021ph 的重要性: 蛋白质净电荷随 ph 改变滴定曲线蛋白质净电荷蛋白质净电荷 1210稳定性范围用阳离子交换用阳离子交换用阴离子交换用阴离子交换3ph不同 ph 下的分离情况21+-1111ge healthcare10/29/2021ph 的重要性: 蛋白质净电荷随 ph 改变流动相的流动相的 ph 选择性选择性vvv阳离子阴离子ph0+-vvv

7、vvabsabsabsabs表面净电荷abs abs abs abs1212ge healthcare10/29/2021目的目的纯化粗样纯化粗样快速浓缩快速浓缩 (减少体积减少体积) 和稳定样品和稳定样品 (去除蛋白去除蛋白酶酶)最适用层析技术最适用层析技术: 离子交换离子交换 / 疏水层析疏水层析分辩率快速快速回收率载量载量 粗 提1313ge healthcare10/29/2021粗提: 离子交换填料预装柱预装柱 20ml 颗粒大小颗粒大小 流速流速hiprep 16/10 q xl & sp xl 90 m 10 ml/minhiprep 16/10 deae & c

8、m 90 m 10 ml/minsepharose big beadsstreamlinesepharose fast flow1414ge healthcare10/29/2021粗提: 疏水层析填料高载量高载量高流速高流速hiprep 16/10 phenyl (高 & 低取代)hiprep 16/10 butylhiprep 16/10 octylhitraphic 选择试剂盒放大1515ge healthcare10/29/2021中度纯化目的目的 去除大部分杂质去除大部分杂质最适用层析技术最适用层析技术: 离子交换离子交换 / 疏水层析疏水层析hiload离子交换和疏水层析预

9、装柱分辩率分辩率快速回收率载量载量1616ge healthcare10/29/2021中度纯化: 离子交换填料sepharose hp 34 mq & sp150 cm/hr小包装和预装柱小包装和预装柱 交联琼脂醣交联琼脂醣source 30 msepharose high performancesource 30 q & s 25 mg 上样载量上样载量3 m: mini q & smini beads q & s 2 mg上样载量上样载量精细纯化:离子交换填料2222ge healthcare10/29/2021mini q 和 mini s 离子交换柱

10、(3mm)高分辨sample:da12-da30 mixturebuffer a:10 mm naohbuffer b:10 mm naoh, 2m naclflow rate:1.0 ml/minmini q pe 4.6/50 用少於 15 min 分离 12-30 碱基的 da 寡核酸2323ge healthcare10/29/2021精细纯化:离子交换和疏水层析填料resource15 mq, sp, phenyl, ether, isopropyl1 ml 预装柱流速高达预装柱流速高达10 ml/min resource hic test kit2424ge healthcare1

11、0/29/2021source 介质：高流速、低反压2525ge healthcare10/29/2021source - 高速，反压低快速1-2 分钟完成分离 5 mm 15 mm30 mm凝胶过滤离子交换x x亲和层析疏水层析 x x反相层析 x x 2626ge healthcare10/29/2021精细纯化:反相层析填料sephasilrpc硅胶硅胶3 mc2/c18聚苯乙烯聚苯乙烯/二乙烯基苯二乙烯基苯120 : 肽类肽类c4, c8, c185 and 12 m硅胶硅胶100 : 肽类肽类300 : 蛋白质蛋白质ph 1 - 12 (14)肽类肽类5, 15 and 30 m27

12、27ge healthcare10/29/2021source30 m15 m5 m离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析2828ge healthcare10/29/2021source 5rpc st 4.6/150 反相柱高分辨疏水性和 c18 相近兼容从ph 1-12分辨率特高选择性更宽可分离一般反相柱分不开的峰 5 mm 15 mm30 mm凝胶过滤离子交换x x 亲和层析疏水层析x x反相层析 x x 2929ge healthcare10/29/2021source 5rpc st 4.6/150 反相柱高分辨3030ge healthcare10/29/2021

13、层析柱的种类c柱系列简易层析柱，无夹套及flow adaptorxk柱系列标准层析柱tricorn(hr)柱系列高压层析柱（最大10mpa）sr柱系列耐有机溶剂层析柱3131ge healthcare10/29/2021凝胶与层析柱配套xkk9csrtricronsephadexsepharosesephacrylsuperdexsource(换膜)3232ge healthcare10/29/2021层析技术层析技术样品起始状态样品起始状态样品结束状态样品结束状态iex低离子强度高离子强度或 ph 改变样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩hic高离子强度低离子强度样品被浓缩样品被浓缩ac特异

14、性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩gf样品体积受限制交换缓冲液 (200cm/hr)，非特异性吸附极低，适合工业规模生产 sephadex以渐被以上的bioprocess介质所代替，除了sephadex g-25 在工业上用作去盐和交换缓冲液，也 有预装了的易用 的hitrap desalting柱和fast desalting column hr10/104040ge healthcare10/29/2021吸附性层析的凝胶基架 在纯化步骤的选择凝胶基架粗粗分分中度纯化精细纯化s s t tr r e e a a m m l li in n e e ( (1 10 00

15、 0- -3 30 00 0u um m ) )s s t tr r e e a a m m l li in n e e x x l l ( (1 10 00 0- -3 30 00 0u um m ) )s s e ep ph ha ar ro os se e b b i ig g b b e ea ad ds s( (1 10 00 0- -3 30 00 0u um m ) )s s e ep ph ha ar ro os se e f fa as st t f fl lo ow w( (4 45 5- -1 16 65 5u um m ) )s s e ep ph ha ar ro o

16、s se e h h i ig gh h p p e er rf fo or rm m a an nc ce e( (2 24 4- -4 44 4u um m ) )s s o o u u r r c c e e 3 30 0 ( (3 30 0u um m ) )s s o o u u r r c c e e 1 15 5 ( (1 15 5u um m ) )4141ge healthcare10/29/2021离子交换介质 最受欢迎的层析纯化方法 强阴q、强阳s和sp、弱阴deae、弱阳cm分别在于 介质完全离子化的ph范围，较宽者为强，与结合强度无关；工作ph范围宽广，更易保持高载量

17、，所以宜用 强者代替弱者 传统的纤维素介质如de52，cm52由于流速慢，柱床 高度随缓冲液改变，又不能承受0.1m naoh在位清洗 ，重生效果差，所以已被sepharose fast flow 等为 基架的离子交换介质代替4242ge healthcare10/29/2021mono q hr, mono s hr 预装柱: 10um均一颗粒， 高分辨率，大量应用文献source15q, 30q, 15s, 30s：低压系统中分辨率 最高，颗粒大小均一，反 压低，可用蠕动泵操作， 流速 1000cm/hr以上仍然 保持高分辨率；自装 source 15 介质时，柱子要用小于5um孔径的过

18、滤网，否则会让介质漏走resource 乃填满了 source 15um介质的预装 柱4343ge healthcare10/29/2021 q and sp sepharose high performance (34um): 琼脂糖凝胶中颗粒最小，分辨率最高，可作经济的精细纯化 q，sp，deae，cm sepharose fast flow (45-165um): 高流速加上高载量，能快速纯 化大量粗产品和作中度 纯化 q and sp sepharose big beads (100-300um): 高物理稳定性的大颗粒凝胶， 能在最短时间内浓缩、初步 纯化大量粗产品；亦适宜处理 高黏

19、性样品4444ge healthcare10/29/2021streamline deae and sp (100-300um): 利用扩张柱床吸附技术直接从含菌体、破碎细胞的发酵液中俘获目标 蛋白，把离心、超滤、初纯化结合 为一； 如 采用streamline deae and sp xl超高 载量介质，可俘获多一、二倍以上的蛋白！4545ge healthcare10/29/2021新一代层析介质新一代层析介质 挑战载量极限！挑战载量极限！ xl介质拥有琼脂糖骨架配合葡 萄糖长链，大大增加高流速下 的动力载量 大大减少柱床体积，降低放大 工艺时的成本xla = macroprep high

20、 q b = fractogel emd, tmae 650c = superq 650 d = q hyperde = streamline q xlf = q sepharose xl 050100150200250abcdefmg bsa/ml载量可比一般介质高达10倍！1ml q sepharose xl 可载 250mg bsa！4646ge healthcare10/29/2021hitrap q sepharose xl(5ml) hitrap sp sepharose xl(5ml) 经济、易用、快速、可用针筒操作，数分钟内可完成 一个提纯步骤 更可接上层析系统如 fplc，a

21、ktapurifier 等，提高分离效果4747ge healthcare10/29/2021亲和层析 配体偶联在介质上，纯化能与配体结合的生物分子； 通常一步便能得到高纯的样品；配体的特异性越强， 所获产品纯度越高 用抗体亲和介质提纯单抗非常方便，以重组蛋白a的载量最高；蛋白g则能结合更多不同源的igg4848ge healthcare10/29/2021 金属螯合介质(chelating sepharose fast flow) 可反复螯合不同金属，再用已结合依赖不同金属 的蛋白，一种介质可做多种纯化工作 其他常用配体包括：肝素 - 纯化抗凝血酶iii，凝血因子脂酶等cibacron bl

22、ue(颜料) - 纯化白蛋白，干扰素等外源凝集素如刀豆球蛋白a - 多糖，糖蛋白等glutathione谷胱甘三肽 - 重组融合蛋白等等. 可自行把所需配体偶联到活化偶联介质，最常用的是nhs activated 4 fast flow 和cnbr activated 4 ff； 要注意化学基最好不会参与配体和被纯化生物分子的 结合作用中4949ge healthcare10/29/2021疏水层析生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环 境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接

23、层析 步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术比反相层析的配体密度低很多，无须有机溶剂洗脱， 保存生物活性配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合 ，可用疏水层析试盒选择介质5050ge healthcare10/29/2021resource 疏水预装柱 有resource phe(苯基)，resource iso (异丙基) 和 resourc eth(乙醚基)三种，疏水性由 高至低，适合精细分离 用source15作基架，高流速(可达1800cm/hr)，时 仍有高分辨率，高稳定性(可用1m naoh在位清洗， cip)，重复性好 低反压，除了fplc 和 hplc外，更可用蠕动泵操作5151

24、ge healthcare10/29/2021不同配体有不同特异性不同配体有不同特异性5252ge healthcare10/29/2021凝凝胶胶基基架架粗粗分分离离中中度度纯纯化化精精细细纯纯化化p ph he en ny yl l s se ep ph ha ar ro os se e 6 6 f ff f ( (h h i i g gh hs su ub b) )p ph he en ny yl l s se ep ph ha ar ro os se e 6 6 f ff f ( (l lo ow ws su ub b) )o o c ct ty yl l s se ep ph ha

25、ar ro os se e 4 4 f ff fb b u ut ty yl l s se ep ph ha ar ro os se e 4 4 f ff fp ph he en ny yl l s se ep ph ha ar ro os se e h h p ps so o u u r r c c e e 1 15 5 p ph h e e, , i i s so o , , e et th h疏水介质选择疏水介质选择5353ge healthcare10/29/2021凝胶的应用例子测定分子量：用凝胶过滤介质；分离范围广阔的 superose hr预装柱很适合测定未知蛋的分子量测定pi:

26、 用少量的离子交换介质放在多个不同ph缓冲 液中，可简易地测出pi，并选择纯化用缓冲液的最佳 ph去除内毒素(热源)：1.高盐下会凝集，无法上疏水柱，因此可用疏水层析试盒选择适合介质同时纯化目标蛋 白 ；2. 热源带负电，可用阴离子交换介质如q sepharose ff 吸附; 3. 偶联内毒素底物如lal到 cnbr或nhs sepharose ff, 自制亲和介质；4. 内毒素经常是多聚体，用凝胶过滤可有效将之除去5454ge healthcare10/29/2021策划蛋白纯化1. 纯化企划2. 工艺开发3. 工艺优化4. 放大研究5555ge healthcare10/29/2021纯

27、化策划1. 最终产品质量要求质 量 要 求程 度检 测 方 法活 性总 蛋 白 含 量纯 度污 染 物 含 量核 酸 ：内 毒 素 ：其 他 ：核 酸 ：内 毒 素 ：其 他 ：5656ge healthcare10/29/2021纯化策划2. 目标蛋白性质性 质数 值检 测 方 法分 子 量等 电 点稳 定 性p h 范 围 ：硫 酸 氨 范 围 ：5757ge healthcare10/29/2021纯化策划3. 样品性质性 质数 值检 测 方 法总 蛋 白 量目 标 蛋 白 量目 标 蛋 白 所 在5858ge healthcare10/29/2021样品稳定性离心后，测量 280 吸收

28、和活性 ph：ph 2 - 9 (1 ph 间隔) 盐：0-4 m 氯化钠，0-2 m 硫酸氨 (0.5 m 间隔) 有机溶剂：0 - 50 % 乙腈，甲醇 (10 % 间隔) 温度：4 - 40 摄氏度 (10 度 间隔) 时间：室温保存 (1 小时间隔)5959ge healthcare10/29/2021样品预处理污 染 物害 处预 防 措 施絮 状 物堵 柱 以 0.22 - 0.45 mm 滤 膜 过 滤 高 速 离 心 10000 g 10 - 15 分 钟 细 胞 匀 浆 ： 离 心 40000 -500000g脂 类 阻 断 配 基 作 用 引 致 凝 集 引 起 非 特 异 性 吸 附 离 心 10000 g 10 - 15 分 钟 如 可 跟 目 标 分 子 兼 容 ： 可 选 择 有机 溶 剂核 酸 阻 断 配 基 作 用 高 黏 度 添 加 硫 酸 链 霉