海南地区乙型肝炎基因型与YMDD自然突变的相关性

1、海南地区乙型肝炎基因型与YMDD自然突变的相关性【摘要】 目的：了解海南地区未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD突变和乙型肝炎病毒基因型情况及两者之间的关系。方法：收集49例未使用抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测乙肝病毒表面标志物，PCR反向点杂交方法测定HBV突变及基因型。结果：49例患者中，检出B型8例(16.33%)，其中发生YMDD自然突变1例(12.5%);C型34例(69.39%)，其中发生YMDD自然突变6例(17.65%)，YMDD自然突变的发生率C基因型与B基因型相比差异无统计学意义(P>0.05);同时两基因型之间

2、乙肝标志物的比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：海南地区慢性乙型肝炎患者中，优势基因型为C型。在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中存在YMDD变异株。 【关键词】 肝炎病毒，乙型;YMDD突变;酶联免疫吸附测定;聚合酶链反应;海南省ABSTRACT Objective: To investigate the hepatitis B virus genotypes and the natural mutation of HBV YMDD motif in the patiens with chronic hepatitis B who were not treated wi

3、th lamivudine and to observe the relationship between the YMDD natural mutation and the hepatitis B virus genotypes. Methods: Enzyme linked immuno sorbent assay(ELISA) was used to test HBV markers. The natural mutation of HBV YMDD motif and HBV virus genotypes was detected by PCR and reverse dot blo

4、t in 49 patients with chronic hepatitis B. Results: Among the 49 patients, 8(16.33%) were genotype B, 34(69.39%) were genotype C. Of the 49 patients, 6 were detected to be YMDD mutants, the rate of YMDD mutant was 17.65%. No significant difference of YMDD mutant was found between patients with genot

5、ype B and C (P>0.05). The same result occurred for HBV markers between them (P>0.05). Conclusion： Genotype C is the dominant genotype of HBV in this area. There is no significant difference of HBV YMDD mutation between genotype B and C.KEY WORDS Hepatitis virus, B type; YMDD mutation;

6、ELISA; PCR; Hainan Province拉米夫定是目前公认有效,且应用广泛的一种抗乙肝病毒核苷类似物的药物，但长期使用拉米夫定能诱导HBV P基因产生变异，从而使其失效。该变异是多位点的，其中以YMDD变异最为重要。而一些研究表明，未进行任何抗病毒治疗的乙肝患者同样存在YMDD变异1，并且部分文献阐述YMDD变异可能与基因型有关2。本研究即探讨海南地区未接受任何抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者自然YMDD突变的情况、HBV基因型分布及两者的关系。1 资料与方法1.1 一般资料收集2006年1月12月海南医学院附属医院门诊与住院的慢性乙型肝炎患者共49例，其中男性34例，女性15例。年

7、龄1972岁，平均40岁。1.2 诊断标准所有患者均符合2000年修订的病毒性肝炎诊断标准3。(1)乙型肝炎血清学标志物异常;(2)抗HIV、抗HDV和抗HCV均阴性;(3)从未使用拉米夫定进行抗HBV治疗。1.3 试剂ELISA试剂购自英科新创科技有限公司;全血DNA提取试剂盒、HBV耐药(突变)及分型基因芯片试剂盒、PE7300PCR扩增仪、基因芯片阅读仪均购自深圳亚能生物技术有限公司。1.4 方法空腹采集患者外周血，分离血清20 保存。使用ELISA方法检测HBV血清标志物;HBV DNA提取操作严格按说明进行，采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA 的质量;使用PCR反向点杂交法测定H

8、BV YMDD突变与基因分型。(1)PCR扩增：取PCR反应管，管壁上作标记，分别加入提取的待测样本DNA 10 L。设置阴性和阳性对照。PCR扩增条件为：50 15 min95 10 min(95 45 s48 45 s72 45 s)×35个循环72 10 min。(2)杂交和显色：取所有扩增产物25 L，采用反向点杂交(Reverse dot blot， RDB)法检测HBV基因型及YMDD突变。检测严格按照操作说明进行。(3)结果判定：HBV胶条上的探针排列顺序。注：(1)528、552、555 位点为拉米夫定耐药检测位点，181、236 位点为阿德福韦耐药检测位点。(2)胶

9、条第一排前5个位点代表野生型检测位点(药物敏感),其下的5个位点为突变检测位点。(3)若555W有信号则555位点无突变。若555W位点无信号而其他位点有信号则555位点发生耐药突变。(4)HBVB、HBVC、HBVD代表相应3个基因型位点。(5)PC位点为阳性对照点。1.5 统计学处理采用2 检验，检验水准=0.05。2 结果2.1 HBV YMDD突变及基因分型检测结果49例患者中检出B型8例(16.33%)，其中发生YMDD自然突变1例(12.50%);检出C型34例(69.39%)，其中发生YMDD自然突变6例(17.65%)，两基因型之间YMDD自然突变比较差异无统计学意义(P&am

10、p;gt;0.05)。2.2 基因型之间乙肝标志物的比较结果B基因型HBeAg阳性7例(87.50%)，HBeAb阳性1例(12.50%);C基因型HBeAg阳性19例(55.88%)，HBeAb阳性15例(44.12%),两者之间乙肝标志物的比较差异无统计学意义(P>0.05)。3 讨论我国是乙型病毒性肝炎高发区，乙型病毒性肝炎大约有9.5%为表面抗原阳性，乙肝在我国已成为疾病发生及死亡的第3位，严重危害了人们的身心健康4。根据HBV全基因序列的同源性>92%或S基因序列同源性>96%,可以将HBV分为AH 8种基因型。大量研究表明,HBV基因型具有

11、明显的地域性分布特征5：A型主要分布在西北欧、北美及非洲中部;D型主要分布在中东、北非、南欧及地中海地区，美国、中国及法国也有报道;B型和C型主要分布在亚洲东部及南部;E型只分布于非洲;F型主要存在于南美、波利维亚和美国;G型主要发生于美国、法国;H型则分布于尼加拉瓜、墨西哥、美国。我国以B、C型最为常见，D型仅见于少数民族地区。有学者报道5，在我国B型由北向南逐渐增多，而C型逐渐减少。本实验可检测B、C、D 3种基因型，经检测B型占16.33%，C型占69.39%，未见D基因型，可见海南地区HBV基因型以C型为主。这与先前的报道不相符。 YMDD突变的主要原因。据国内学者观察6，服用拉米夫定

12、1年、2年和3年YMDD突变的发生率分别为14.16%、49.17%和70.15%。YMDD变异株对拉米夫定的耐药性增强，另外导致患者的HBV DNA定量反调及肝功能异常，给临床治疗带来一定的困难。然而，不是所有YMDD突变都与药物有关，有一部分YMDD突变是自然发生的结果。日本学者Kobayashi等7发现18例无症状携带者，未曾使用任何抗病毒药物，其中有5例检测到YMDD突变，突变率为27.78%。国内张岩等报道8，60例未曾用过任何抗病毒药物的患者，其中有5例检测到YMDD变异，变异率为8.34%。本研究对49例未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD基因变异进行检测，发现有7例YMDD

13、突变，突变率为14.29%，表明海南地区亦存在YMDD自然变异。目前认为HBV基因型与病毒复制和变异有关。C基因型HBV的HBeAg阳性率高于B型和A型;B型HBeAg阴性率低于C型，而HBeAb阳性率显著高于C型。同时C型YMDD变异发生率显著高于B型5。本研究观察了B基因型和C基因型YMDD自然变异发生率和乙肝标志物的表达，均未发现差异有统计学意义(P>0.05)，与先前报道HBeAb阳性者容易发生YMDD自然变异不同，同时也未发现基因型与YMDD自然变异有关。本实验样本数较小，有待于进一步扩大样本进行研究。不同基因型致病性和药物敏感性均存在差异5，基因型的鉴别有助于临床评估

14、病情、选择药物和判断预后9，而YMDD突变可能会影响核苷类药物的抗病毒效果。本研究表明海南地区以C基因型为主，同时存在YMDD自然变异，因此，在临床抗乙肝病毒治疗前应检测HBV基因型及YMDD突变情况，便于临床医生判断病情、制定合理的抗病毒治疗方案。【参考文献】 1 崔儒涛,王宝恩,张福奎,等.拉米夫定治疗相关的乙型肝炎病毒变异的研究进展J.中华肝脏病杂志,2002,10(3):238240.2 马英,朱宁川,窦晓光,等.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效和基因变异的研究J.中国现代医学杂志,2005,15：961965.3 中华医学会传染病与寄生虫病学会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案J.中华肝脏病杂志,2000,8:324329.4 徐立文,刘玉兰.乙肝病毒YMDD变异与血清标志物的相关性J.职业与健康，2005，21：11871189.5 董梅.乙肝病毒基因型的研究进展及临床意义J.武警医学院学报,2005,14(4)：319322.6 姚光弼,王宝恩,崔振宇,等. 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎3年疗效观察J.中华内科杂志，2003，42:382387.7 Kobatashi S, Ide T, Sara T. Detecrion of YMDD morif mutations in so