细胞电融合仪 ECM2001 安装操作手册

1、选取日期细胞电融合仪ECM®2001安装/操作手册 目 录1 检查清点货物及安装2 技术规格3 操作细则4 产生杂交瘤的实验方法5 服务及保修6 附录：电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用第一节 检查清点货物及安装1. 拆封包装：ECM 2001细胞电融合仪采用纸箱包装，收到货物后，请检查包装完好程度，如果有任何损伤请速与我公司联系。请小心地拆开包装，将仪器及附件取出，并依据合同清点货物内容及数量，如果有任何外观损伤或者货物与合同有差异，请速与我公司联系。请保留包装箱，以便满足将来一旦要运送该仪器的需求。2. 电源： 该仪器采用220V电源，请确认您的电源为稳定的220V。如果电源不

2、稳定的话，有可能对仪器造成严重损害！请确认您的电源严格接地，我们提供给您的电源线为三芯带地线电源。请不要改动该三芯电源线结构，否则有可能对仪器造成严重伤害！3. 安装： 如果确认仪器包装无问题，且与合同相符，则可以进行安装。 请将仪器安装在一个干燥，水平，常温环境中。尽量避免灰尘和化学药品对仪器的损害。 仪器与其他物品的距离不少于15厘米，以保证仪器冷却的需求。 将电源线等附件拆包装，待用，依据后续章节继续操作。第二节 技术规格1. 外观尺寸：宽：17高：11长：17.52. 重量：47磅3. 电气规格： 电源：220V，单相，7A耐熔保险 交流：频率固定在1MHZ 电压： 0 75 V （从

3、零到峰值） 脉冲时间：0 99 秒 直流：高电压模式（HV） 电压： 10 3000 V （峰值） 脉冲时间：1 99 毫秒 低电压模式（LV） 电压： 10 500 V （峰值） 脉冲时间：1 99 毫秒0.01 0.99 毫秒 脉冲次数：1 994.前面板控制介绍：编号名称功能1SET AC VOLTAGE此旋钮用于设置交流电压（0-75V）。调整的数值显示在左侧的显示屏上。2AC DURATION SECONDS此按钮用于设置自动模式下交流电被激活时间的长度。时间用“+”和“-”按钮设置，最大到99秒。3POST FUSION AC SECONDS此按钮用于设置自动模式下脉冲施加后作用的

4、时间。最大到9秒，使融合后的细胞聚集在一起。4SELECT THE MODE此旋钮用于选择电穿孔模式：HV高压模式（10-3000伏/1-99微秒）；LV低压模式（10-500 伏 /0.01-0.99毫秒）；LV低压模式（50-500 伏/1-99毫秒）。一旦模式选择好，相应的指示灯就会亮起。5PULSE LENGTH此按钮用于控制电穿孔/电融合方形脉冲的脉冲长度，设定选择用Lower(+)和Upper(-)按键。6SET VOLTAGE此旋钮用于调节脉冲电压。HV高压模式下，电压显示单位为千伏，设定范围为10-3000伏； LV低压模式下，设定范围为10-500伏。顺时针旋转电压增加，逆时

5、针旋转电压减小7NUMBER OF PULSES此按钮用于设定脉冲个数（1-99）。“+”和“-“ 按钮用来选择所需脉冲个数。每向融合池发送一个脉冲，黄灯就会亮一下，同时发出一声嘟嘟声8WAIT当仪器运行到一个循环结束时，出于安全原因放掉电容器中的所有电荷，此灯会亮。当此灯亮起的时候，绝对不能操作主机。9AUTOMATIC START按一下并释放此按钮，可根据预先设定的电压、脉冲长度、脉冲个数激发一个排列和电穿孔循环。10REMOTE此接口用于连接远程控制盒，可以远距离操作主机。11NUMBER OF REPEATS此按钮用于设定重复循环次数，最多可达9次。12MANUAL START此双位置

6、按钮允许手动控制ECM 2001，第一次按下按钮，仪器开始工作，灯亮表示电压持续施加。第二次按出按钮，灯熄灭时，电融合电压被送到融合池上。13PRINT SETTINGS此按钮用来打印排列设置和电融合/电穿孔参数。如果使用Enhancer 400的话，请使用Enhancer 400上的该功能按钮。第三节 操作细则1. 注意事项： 请严格按照下述操作细则对ECM 2001进行操作。在没有连接打印机的情况下，严禁按“PRINT SETTINGS”按钮！否则仪器将会锁死。如果打开仪器电源的时候，发现“MANUAL START”按钮处于亮灯状态，请马上关闭电源！2. 程序或步骤（操作过程）高电压警告：

7、为了实际操作和安全的原因，在手动或自动操作模式中，ECM 2001在施加交流电场或直流脉冲的过程中，请不要接触任何电缆或电极连接处，当需要连接或拆下电缆时，要检查系统不在操作中或处于备用状态。Automatic自动操作模式：1. 连接Chamber（融合池）和位于ECM 2001背面的输出插口。2. 如果使用打印机的话，把打印机电源电缆插到ECM 2001背面的打印电源接口上(J4)。3. 如果使用打印机的话，用串口线缆将打印机连接到ECM 2001背面的打印机输入口上。4. 如果使用Enhancer 400（示波器）的话，将Enhancer 400的电源线插在市电上。5. 如果使用Enhan

8、cer 400（示波器）的话，先用电缆将Enhancer 400的输入插口与ECM 2001背面的输出插口连接，然后用电缆把融合池连接在Enhancer 400上的输出插口上。6. 把ECM 2001的电源线插到合适的电源插座上（220伏）。7. 打开ECM 2001背面上的电源开关。8. 设定所需的AC Voltage (1) 即交流电压。9. 设定所需的AC Duration Seconds (2) 即交流持续时间。10. 选择HV或LV模式(4)。11. 设定DC Pulse Length (5) 即直流脉冲长度。12. 设定DC Voltage(6) 即直流电压。13. 设定Numbe

9、r of Pulses (7) 即脉冲个数。14. 设定Post-Fusion AC Seconds (3) 即融合后交流时间到所需的脉冲长度。15. 把细胞悬液/试剂倒入BTX Chamber（融合池）中。16. 检查所有的设置。17. 按下Automatic Start(9) 即自动按钮，ECM 2001发出一声嘟嘟声，把预先设 置的所有参数送到Chamber（融合池）上。18. 仅对电穿孔来讲，设置AC Voltage (1)、AC Duration (2)和Post-Fusion AC (3) 为零，其余步骤不变。 Manual手动操作模式：1 其余步骤同1-11，按一下Manual

10、Start(12) 即手动按钮，手动模式中，AC Duration (2) 即交流持续时间按钮不再起作用，持续施加交流电场。在显微 镜下观察Chamber中细胞，当细胞相互接近成二聚体时，再次按一下Manual Start(12) 即手动按钮，结束交流场。ECM 2001发送电穿孔脉冲。注意：交流电压的值不能在指示器上调节。3. 仪器设置：² 与打印机的连接方式：1. 将ECM 2001的电源线插在市电插线板上。（220伏）2. 把打印机电源电缆插到ECM 2001背面的打印电源接口上(J4)。3. 用串口线缆将打印机（501型）连接到ECM 2001背面的打印机输入口上。4. 使用

11、5343型连接电缆或者464型连接电缆（适用于Microslide 450，450-1，450-2， 450-3）或者465型连接电缆（适用于Microslide 453，453-10）连接ECM 2001与 Microslides, 将连接电缆插入到ECM 2001背面的输出插口中。630B安全操作池或 者其他电极针的连接与此类似。与Enhancer 400的连接方式：1. 仔细阅读Enhancer 400的使用手册。2. 将ECM 2001的电源线插在市电插线板上。（220伏）3. 将Enhancer 400的电源线插在市电插线板上。（220伏）4. 将红/黑高电压电缆两端分别依照颜色插入

12、ECM 2001的相对应的输出和Enhancer 400的相对应的输入插口中。5. 连接电击设备。（参见与打印机连接的第四步）4. 操作：自动操作1. 打开ECM 2001背面的电源开关。2. 设置所需的交流脉冲时间（2）。3. 选择高压模式（HV）或低压模式（LV）（4）。4. 设置直流脉冲长度（5）。5. 设置直流电压（6）。6. 设置直流脉冲个数（7）。7. 设置融合后所需的交流脉冲时间（3）。8. 把细胞悬浮液/试剂倒入BTX Chamber中。9. 检查所有的设置。10. 按一下自动按钮（9）会发出一声嘟嘟声，ECM 2001输送设置的所有参数 到融合槽中。11. 对于电穿孔，设置A

13、C Voltage (1)、AC Duration (2)和Post-Fusion AC (3)为零， 其余步骤不变。手动操作：1. 其余步骤同自动操作中的1-9步。2. 按一下Manual Start(12) 即手动按钮（指示灯只亮90秒）。手动模式中，AC Duration (2) 即交流持续时间按钮不再起作用，持续施加交流电场。在倒置 显微镜下观察载玻片上的细胞时，可以变动AC幅值，以得到最优的排列 （串）结果。3. 当细胞近似成串时，再次按一下手动按钮，撤掉交流电场，加上所设置的直 流参数。打印数据：1. 从ECM 2001打印输出，按打印按钮两次（2）。2. 从Enhancer 40

14、0打印输出，按Enhancer 400上的打印按钮一次。5. 操作参数的选择：1. 排列参数： AC Voltage：设置交流电压。 AC Pulse Length：设置脉冲长度。2. 电穿孔参数： 选择高压模式（HV）或低压模式（LV）（4） Pulse Length ： 设置直流脉冲长度。 DC Voltage：设置直流电压。 Number of Pulses：设置脉冲次数。3. 融合后交流参数：6. 显微镜和载玻片的使用 用464连接电缆或465 连接电缆连接载片与ECM 2001 ，用461连接电缆连接464连接电缆或465连接电缆与 1269同轴电缆接头连接。（参见前述章节） 选择A

15、C Voltage使细胞缓慢向载片电极移动，建议用胶带固定同轴电缆在显微镜载物台上来防止电缆线过重使载波片移动。用微量移液吸头或注射器加入或吸出细胞悬液。 选择AC Voltage，使细胞向向载片电极缓慢移动。按10%比率逐渐增加融合电压和脉冲长度，使融合率增加。靠近电极的电场最强，融合首先在这里发生，如果电场太强，细胞会立即解体。 如果细胞不移动和电压的增加导致培养基的沸腾，说明细胞溶液的作用象电解使用新鲜的甘露醇配置准备0.3 M甘露醇（0.2微孔过滤）（pH 7-7.3），用无菌0.1 N NaOH调节pH。在融合前调节甘露醇的pH。缓冲液在融合前程序5.3.1中说明。其它低分子量糖类如

16、蔗糖和葡萄糖也已得到成功的应用。 在显微镜下操作载玻片时，使用手动模式更有利。这样，只要排列已经成功立即停止 使用秒表测量所需的排列时间。当使用更大一些的融合池时，在自动模式中设定相同的或更长一点的时间。如果演示给许多人，使用带有电视摄象机和显示器的显微镜。第四节 产生杂交瘤的实验方法本章节中的相关具体步骤请参照英文版说明书，以英文说明书为准！ 下面只是一种推荐的方法，每个研究者应根据不同的细胞密度、融合培养基和融合前和融合后的不同处理进行实验，并参考相关文献。Ohnishi 等(BTX 书目#218)和Ruzin(BTX 书目#183)成功描述了哺乳细胞的融合方案4.1 材料4.1.1细胞4

17、.1.2融合液4.1.3融合促进剂4.1.4仪器及其他材料 1 含10%胎牛血清和2mM/Lglutamine的RPMI1640或DMEM 2 Trypsin blue 3 无菌96微孔板 4 无菌 5 带10×和40×物镜的显微镜 6 可选择：2 个冰槽，一个用于试剂 7 8 放置BTX仪器的水平桌或实验台 9 台式离心机10 无菌圆锥试管11 可用的高压灭菌锅4.2融合用小鼠细胞的预处理4.3融合程序 最优融合参数的建立可能花费一些时间，并且对每种新的骨髓癌/淋巴细胞对都必须进行实验。融合通常在室温下进行，在融合过程中细胞悬浮液也可以放置冰上。此外，也可以在实际的操作过

18、程中，使融合槽放置在冰槽上。融合前必须浓缩细胞，并且用非电解质溶液洗涤。4.3.1使用标准的0.3M甘露醇（MANNITOL）的融合 骨髓癌细胞和淋巴细胞以1：4的比率混合，混合液1000rpm离心6分钟得到细胞沉淀，弃去上清液，加入无菌0.3M甘露醇（pH 7-7.3）。 细胞用无菌0.3M甘露醇洗涤2次，重新悬浮细胞使密度为2×106/ml备用。细胞在0.3M甘露醇只能保留2小时。 因此，在实验中，准备数个细胞沉淀可能是必需的。4.3.2使用葡萄糖（GLUCOSE）的融合 也可选择其他的非电解质缓冲液如0.3M葡萄糖（pH 7-7.3）作为标准的0.3M甘露醇的替代，这种情况只需

19、用糖类代替甘露醇，除非细胞可以在葡萄糖中保存4小时。4.3.3融合促进剂（ELECTIVE）4.4标准0.3M甘露醇、葡萄糖和相关糖类的融合后程序1融合后，在无菌条件下用移液管小心的把细胞悬浮液从融合槽转移到无菌试管。加10（500）ml 含10%胎牛血清和2mM/Lglutamine的RPMI1640或DMEM，静置15分钟。2500rpm离心5分钟，弃去上清液。小心的用培养基重新悬浮细胞，把细胞转移到96微孔板，使每孔有2×105个细胞（0.2 ml/孔）。检查所有的孔，确定有足够的培养基。337 5% CO2中孵育过夜4第二天取出一半的培养基，并加入HAT培养基。在第4、7、1

20、0天，再取出一半的培养基，并加HAT培养基。也可以给细胞补充饲养层或其他的生长因子。5每天都检查HAT培养基的筛选情况。一旦观察到克隆形成，就开始在膨大的第一时期提供HAT培养基。4.5提高融合产物的产量的程序 按以上方法准备好用于融合的细胞后，下面的程序有助于优化融合参数。这一点对于没有过去实验数据的融合的细胞系很重要。1.用Microslide 确定仪器参数2.设置AC Voltage (1)和DC Voltage(6)为零3. 设置AC Pulse Length (2)和DC Pulse Length (5)零4.在电极间隙中加入细胞悬液5.增加AC Voltage为10V6.按一下手动

21、按钮（12），观察30秒。如果细胞没有移动，每次10 V逐渐增加交流电压（AC Voltage）直到看到细胞移动。7.如果看到加热或蒸干现象，就改变细胞悬浮液。8.若改变细胞悬液，关闭排列信号。第二次按一下手动按钮（12）（90秒限制）。只要红色的指示灯在亮着，信号就在作用中。9. AC电压和脉冲时间要一直试验到在10-20秒内细胞形成二聚体的比率相当高。记录设置条件。10.设置AC脉冲时间在几分钟内都可观察到排列的值11.设置融合后AC脉冲时间（3）直到9秒，使细胞在电融合后保持成串。12.根据细胞的生活力优化系统参数。使用最早得到的基本参数设置和用修改的参数设置作数个实验组每个实验组的细胞

22、在含10%胎牛血清、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和2mM/Lglutamine的RPMI1640或DMEM中培养4天。每天都用trypan blue exclusion 检测部分培养细胞的活力。选择4天后细胞活力最高的那组参数设置。13.研究细胞活力的系统参数应按以下进行： 每次按20%的大小改变排列电压（Alignment Voltage）和脉冲时间。电压高要求时间短。14.按20%逐步改变DC电压和脉冲时间。15.试验融合后AC脉冲时间时细胞在融合后仍在一起。4.6植物原生质体的电融合程序 以下的方案仅作为研究人员用植物原生质体进行遗传工程研究的一个指导。4.6.1基本程序1.按常规程序分离

23、得到新鲜的原生质体（注意：如果已发生细胞壁再生，融合不会成功）。2.小心的用移液管加入非电解质融合液3.弃去上清液，细胞重悬于非电解质融合液，根据细胞大小调节细胞密度为1.5-6×105个/ml4.进行电融合。4.6.2融合液一般地，非电解质融合液与融合前的溶液的渗透压、pH和组成最相近时，得到的细胞生活力最高。1.可使用非电解质的糖如甘露醇、葡萄糖、山梨醇等。2低盐浓度如CaCl2(140M)或.Hepes 600M为最优的选择，而且在一定时间内，对细胞并没有害。3.对每一类型的原生质体都应该研究其最适pH。 pH在7.0-7.5之间，融合最为成功。4.渗透压应该与分离原生质体的溶

24、液相同。5.再钙化的原生质体已经成为融合到一起。4.6.3仪器设置 典型的融合产率在使用protease时为20%，不使用时为7%；PEG处理的融合率一般为1%。1.增加1个或2个脉冲似乎并不增加融合产量（频率），对原生质体却有损伤。2.用于Microslide的典型设置 时间 排列（成串） 35V 25秒电穿孔 260V 40微秒产量 总融合率8.6% 异核率2.6%4.7.1细胞不排列其余部分及Protocol请参见英文说明书。第五节 服务与保修获取服务：1. 保修期内的服务：ü 请置电服务维修部门，并将所发现的问题以文本的方式传真到维修部门；ü 依照维修部门的建议，进

25、行调节和观察；ü 如果问题仍未解决，请按照维修部门的通知，将仪器装箱回运到厂家维修部门进行专业维修。如果用户未经维修部门授权，自行将仪器进行解体维修，将失去保修权利！2. 保修期外的服务：ü 请置电服务维修部门，并将所发现的问题以文本的方式传真到维修部门；ü 依照维修部门的建议，进行调节和观察；ü 如果问题解决，将没有费用发生。ü 如果问题仍未解决，请按照维修部门的通知，将仪器装箱回运到厂家维修部门进行专业维修；ü 此时发生的费用，将至少包含运费，维修硬件所产生的元件费用。测试#测试表格是否1确认电源线确实插牢，并电压为220伏。2打

26、开电源开关。仪表亮了吗？3设置交流（1）和直流（6）全为0。4设置Select Mode 按钮（4）为HV（高电压）模式1-99usec。HV模式的绿色指示灯亮了吗？5设置Select Mode 按钮（4）为LV（低电压）模式0.01-0.99msec。lV模式的绿色指示灯亮了吗？6设置Select Mode 按钮（4）为LV（低电压）模式1-99msec。lV模式的绿色指示灯亮了吗？7按下Manual Start手动按钮。手动按钮灯亮了吗？8再按一下Manual Start手动按钮。手动按钮灯灭了吗？9在仪器上设置下列参数设置AC Voltage（1）为30伏设置AC durations (

27、2)为03秒设置Post Fusion为03设置Select Mode（4）为HV模式1-99usec设置Pulse length (5)为40设置DC Set Voltage (6)为50伏设置the Number of Pulses (7)为02按the Automatic Start (8),并释放。SET AC上的绿色指示灯亮了吗？如果以上问题中的答案有任何否出现，请与维修服务部门联系！附录：电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用郝新保 综述 (第四军医大学唐都医院 西安 710038)摘 要 电穿孔技术利用电场造成细胞膜的改变从而将DNA导入细胞内，同时还可用于细胞融合以及动物克隆等。

28、基因电转移的效率通常比化学法提高1-2个数量级，主要与脉冲波形、长度、缓冲液等有关。方波直流电脉冲应用广泛，在有关细胞核移植的多项研究报告中均指出其重要作用。关键词 基因转移，克隆，电穿孔中国图书资料分类法分类号 Q13 过去十年中，关于基因功能的研究取得了丰硕的成果，并因此带动了基因工程、基因治疗以及单克隆抗体技术的进步，而在动物生殖生物学领域的革命性技术进步则导致了绵羊、牛、猴子和小鼠等多种动物的克隆成功。电穿孔技术和仪器的发展在这些成就中扮演了重要角色，使得人类不但能从胚胎细胞克隆动物，甚至能从完全分化的成熟细胞获得克隆动物。全新的基因操作和生殖技术将为21世纪带来重要的科学成就。电穿孔

29、技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。1 在基因转移和杂交瘤中的应用1.1 动物和昆虫细胞转染电穿孔技术在80年代初期开始用来将DNA导入多种动物细胞1，较之传统的磷酸钙和脂质体转染，电穿孔具有操作简便、转染效率高等诸多优点，特别是对那些其它方法难以奏效的细胞具有明显优势，但它的影响因素也比较多。电场强度：电压太低时，细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过，而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞细胞而言，

30、250-2500V/cm的电压可获得有效转染2,3。电脉冲形状和长度：电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种，大多历时20-100毫秒。缓冲液：通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液，但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高，血清也可以提高转染效率4。其它诸如转染温度，DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。1.2 大肠杆菌和酵母的转化电穿孔法在80年代末开始被用于转化大肠杆菌5，由于细菌相对较小，因此与DNA导入动物细胞相比，大肠杆菌通常要求4000-20000V/cm的脉冲强度才能获得有效转染。化学法感受态细胞的转染效率最高只能达到每微克DNA 106-108个转化体，而电穿孔法却可以达到1

31、09-1010个转化体的水平，较前者提高10-100倍，因此在制备cDNA文库等要求较高转化率的工作中就显得十分关键。 酵母菌电转化克服了乙酸锂和原生质体法烦琐和转化率低的不足，效率明显提高6。1.3 细胞融合制备杂交瘤 细胞融合主要用于产生杂交瘤细胞7,8。在单克隆抗体的制备过程中，传统用PEG融合法产生杂交瘤细胞，这在现代化生产中存在许多局限性。而电融合法制备杂交瘤可以大规模地批量、高效融合，缩短了整个生产周期。除此以外，在细胞生物学研究中电融合还被广泛应用于其它杂交细胞的制备9。2 胚胎工程的核移植和活化 在从简单的胚胎干细胞转染到核移植胚胎的电活化中，电穿孔技术都发挥了关键的作用，下面

32、是一些重要的应用。2.1 单性生殖、四倍体及嵌合体2.1.1 单性生殖中的电活化 反复的直流方波脉冲可以激活卵母细胞使其发生分裂而产生单倍体胚胎。可以通过细胞松弛素B抑制第二极体或通过电融合来获得二倍体细胞。2.1.2四倍体胚胎的制备 在胚胎的两细胞阶段应用直流脉冲可以导致细胞融合产生四倍体胚胎。这在小鼠和猪、牛都得到了应用10。2.1.3 胚胎干细胞嵌合体的制备 通过胚胎干细胞的电转染可以制备嵌合体转基因小鼠。将干细胞注入受体的胚泡，然后将这个胚泡转入代理母亲子宫。生出的后代之间互相杂交产生纯合子可供用于生殖研究。已经制备了如小鼠、猪、兔和鳉的胚胎干细胞嵌合体11。2.2 电融合在核移植技术

33、中的应用 1938年当Hans Spemann提出核移植的设想时克隆技术已经初露端倪。首次在两栖类动物进行的克隆报道于1952年，但直到1970年青蛙才被克隆成功。核移植是目前多个物种生殖研究的热点技术。 核移植克隆的目的是将被克隆生物的细胞核转移到宿主系统中来指导胚胎的发育并产下新的个体。首先将针插入去核卵母细胞的透明带，把供体细胞注入卵母细胞的卵黄周间隙。细胞融合仪提供的交流电使供体细胞和卵母细胞排列好，随后1到数个直流波使核移植胚胎被激活而发生分裂。分裂产生的胚胎细胞被移植到代理母亲子宫妊娠直到生产。2.2.1 供体和受体细胞的电融合 电融合首先使细胞膜融合，然后细胞变园成为一个细胞。影

34、响融合的因素有：细胞排列、融合缓冲液、脉冲参数、电极形状和卵母细胞成熟程度等。 融合过程的第一步是细胞排列。在这个过程中细胞被排成特定的方向使得发生融合的细胞膜与电场方向垂直。这个排列过程可以手工完成也可以用交流电场来控制，后者能够同时操作多个胚胎。 融合缓冲液通常是些较低离子强度的溶液如浓度在0.28-0.3M之间的甘露醇、葡萄糖和蔗糖。10-100mM的Ca2+能增强融合效率12。 脉冲参数包括电场强度、脉冲时间和脉冲次数。在核移植的卵母细胞融合时电场强度通常在600V/cm到3.6kV/cm之间，而脉冲时间多介于30-250ms之间。研究显示不同种类细胞需要的最佳参数各不相同。通常电场强

35、度和脉冲时间呈反比关系，较强的电场可以弥补较短的脉冲时间13。单个脉冲即可使细胞发生融合，有学者认为增加脉冲数能提高融合效率，但有的观点却相反。 对电极的研究还不多，常用的是平行的柱状电极，间隙为0.2-0.5mm.2.2.2 融合细胞的电刺激活化 细胞活化常用不同时长的直流方波。核移植过程中的电刺激活化对细胞融合必不可少也十分有效。Collas的研究显示成熟的卵母细胞活化效率比较高。活化效率与电场强度和脉冲时间无关，却与脉冲波形有关。非均一的电场能得到较高的活化效率。最佳的电场强度依赖电极间隙。脉冲数以及脉冲之间的间隔增加都可提高活化效率14。3 供核来源不同的核移植3.1 以胚胎为基础的核

36、移植 由核移植产生的哺乳动物胚胎克隆涉及8-64个细胞胚胎的其中一个细胞与去核的成熟卵母细胞之间的融合。Ilmense 和Hoppe于1981年首次报道了产生成活个体的核移植15。他们的研究没有被重复出来，但却产生了效率更高的核移植技术16。许多物种成功的核移植实验都使用了电融合技术。 Li Meng和Don Wolf把这一技术应用于灵长类于1997年发表了克隆恒河猴的实验研究结果17。他们的工作为基因治疗提供了有效的动物模型。3.2 以胚胎和初生动物细胞系为基础的核移植 应用胚胎分裂球作为细胞核供体有许多限制。如何产生合适的胚胎细胞是个瓶颈，而且分离的分裂球难以在体外进行遗传操作，使得克隆之

37、前无法有效地向其转移基因。因此许多学者从事发展基于胚胎或初生动物细胞系的核移植策略。 1996年位于苏格兰的Ian Wilmut研究小组报告他们利用细胞系获得转基因绵羊的结果18。用于核移植的细胞系来自于胚胎，已经在体外培养了6-13代，在移植之前用血清饥饿法诱导其停止生长。1997年利用转染人IX因子基因的绵羊羊胎纤维母细胞获得的核移植绵羊克隆获得成功19。 Cibelli, Stice and Robl首次报告了使用永生化的胎牛纤维母细胞作为细胞核供体获得的克隆转基因奶牛。他们的工作首次证明活跃分裂的细胞在进行细胞核移植以后可以继续发育20。3.3 以分化成熟细胞为基础的核移植 应用细胞系

38、的核移植研究为分化成熟细胞的克隆扫除了障碍。Ian Wilmut于1997年报告了第一只来自分化成熟细胞的动物克隆-绵羊多利21，这一成果震动了整个世界。为多利提供细胞核的是一只成年绵羊的乳腺上皮细胞，同样应用了血清饥饿诱导法处理细胞。 此后不断有应用体细胞作为细胞核供体获得克隆动物的报告22-24，证明了多利的技术路线确实是可行的。4电穿孔设备的性能 早期电穿孔设备的波形和时间都是固定的，使用不便且效果差。20年来的发展使得设备本身和附件的技术水平都有了很大提高。4.1脉冲形状早期的指数衰减式脉冲一直沿用至今，保留在低端产品的设计上，主要用于基因转染。新开发的方波脉冲产品成为目前市场上的主流

39、，在众多品牌中方波脉冲的纯度和重现性并不完全一致，应选择那些专业厂家的产品。有的产品用一系列高频脉冲代替方波，其导入基因和细胞融合的效率还有待于进一步证实。除了直流脉冲以外，有些用于细胞融合的设备还可以产生非正弦交流波使细胞按电场方向排列，可比单纯直流脉冲获得更高的融合效率。4.2 脉冲强度和时间 由于细菌和细胞的操作需要不同的脉冲强度和时间，而低端产品的强度和时间调整范围都比较窄，因此作用单一。通用型产品可以产生0-3000V的电压以及1微秒-10秒的脉冲，因此可应用于细胞、细菌转基因和细胞融合、胚胎工程等多种操作。4.3 外围设备带有监视器、打印机和遥控器接口的细胞操作系统已经出现，与这些

40、设备配套使用能方便地记录和优化实验参数，可以在最短的时间内取得最佳结果。参考文献1 Neumann E, Schaefer-Ridder M, Wang Y, et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric field. EMBO J, 1982;1(7):841-8452 Andreason GL, Evans GA. Introduction and expression of DNA molecules in eukaryotic cells by electroporatio

41、n. Biotechniques, 1988;6(7):650-6603 Ghosh C, Song W, Lahiri DK. Efficient DNA transfection in neuronal and astrocytic cell lines. Mol Biol Rep 2000 ;27(2):113-1214 Delteil C, Teissie J, Rols MP. Effect of serum on in vitro electrically mediated gene delivery and expressionin mammalian cells. Biochi

42、m Biophys Acta 2000 ;1467(2):362-3685 Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1988;16(13):6127-61456 Meilhoc E, Masson JM, Teissie J. High efficiency transformation of intact yeast cells by electric field pulses.

43、Biotechnology, 1990;8(3):223-2277 Ohnishi K, Chiba J, Guto Y, et al. Improvement in the basic technology of electrofusion for generation of antibody-producing hybridomas. Journal of Immunological Methods, 1987;100(1-2):181-1898 Kreutz FT, Xu DZ, Suresh MR et al. A new method to generate quadromas by

44、 electrofusion and FACS sorting. Hybridoma 1998;17(3):267-2739 Tyurin MV, Doroshenko VG, Oparina Nyu et al. Electrofusion of Escherichia coli cells. Membr Cell Biol 1997;11(1):121-12910 Curnow EC, Gunn IM, Trounson AO. Electrofusion of two-cell bovine embryos for the production of tetraploid blastoc

45、ysts in vitro. Mol Reprod Dev 2000;56(3):372-37711 Iwasaki S, Campbell KH, Galli C, et al. Production of live calves derived from embryonic stem-like cells aggregated with tetraploid embryos. Biol Reprod 2000;62(2):470-47512 Haritou M, Yova D, Loukas S. Agents facilitating the electric field-induced fusion of intact rabbit erythrocytes. Bioelectrochemistry 2000;52(2):229-23813 Collas P, Fissore R, Robl JM. Preparation of nuclear transplant embryos by electroporation. Anal Biochemistry, 1993;208(1):1-914 Collas P, Robl JM. Factors affecting the efficiency of nuclea