色谱分离技术

1、色谱分离技术1903年,俄国植物学家Tsweet将CaCO?固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醍浸出液，并用石油醍连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。色筠法豹克艮历鎚 1903年Tswett创立色谱法(在碳酸钙上分离了叶绿素)。由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一 般分离需要几小时至几天。 20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱(PC)和薄膜色谱法(thin-layerchromatography,TLC) 法简单、分离时间短，样為量要求小。 1952年，James和Martin提出了气相

2、色谱法(gaschromatography,GC) 特点：以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。值蔚术易气化 和热不稳定性差的化合物难以分离。 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料，高压输液泵和高灵敏度的 监测器的出现，发展出了高效液相色谱(High perfoimance liquid chromatograghy,HPLC)。如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色 物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在 仍沿用色谱法这个名称。色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的 手段。色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油 化工、有机合成、

3、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦 查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种 分离分析课题。什么是色谱法?色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。 它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数等的微 小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相 之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大 的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分 离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。5色谱过程吸附T解吸T再吸附再解吸两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多 次地吸附一解吸-再吸附一再解吸的过程使微小差异累积起来, 结果使吸附能力弱的组

4、分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后 流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。溶剂煖冲液图9-1色谱的主要装置对复杂混合物各组分进行定量和定性分析91,色谱法的特点：与经典的分离提纯手段（重结晶，升华，萃取 和蒸憾等）相比，色谱法具有快速，简便和高效进行分离。一液相色谱（含柱，薄层色谱）适合于固体物质 和具有高鳖汽压的油状物的分离，不适合低沸点 液体的分离。气相色谱适合于容易挥发物质的分离。2,色谱法的优点（1）分离效率高。（2）应用范围广。（3）分析速度快。（4）样品用量少。（5）灵敏度高。（6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪 器联用（7）易于自动化，可在工业流程中使用。色谱分类厂气木

5、目色谱J气固色谱气液色谱1 流动相与固定相聚集态液木目色谱j液固色谱液液色谱超临界流体色谱毛细管电泳13色谱法分类2根据操作压力的不同分类低压色谱 vO.5MPa中压色谱 0.55MPa高压色谱550MPa色谱法分类3按操作形式：柱色谱一分离体系米用圆柱管纸上色谱一固定相是滤纸或将固定相载于纸 上薄层色谱一固定相是一层吸附剂物料，平铺 于惰性平板上凝胶色谱4按分离原理分类:吸附色谱法:利用吸附剂（固定相一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分离。 分配色谱法：利用不同组分在两相间的分配系 数的差别进行分离。离子交换色谱：利用溶液中不同离子与离子交 换剂间的交换能力的不同而进行分离。凝胶色

6、谱法：利用多孔性物质对不同大小的分 子的排阻作用进行分离。175按应用目的分类： 制备性色谱：目的是 分离混合物，获得一定数量 的纯净组分。分析性色谱：目的是定量或者定性测定混合物中 各组分的性质和含量。定性 的分析性色谱有薄层色谱、 纸色谱等，定量的分析性色 谱有气相色谱、高效液相色 谱等。19生产型制备液相色谱系统高效液相色谱仪14色谱分离的基疋屈理利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、 吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。1515cdabSh15色谱相关术语:试样经色谱柱获得分离，按先后次序经过检测器时，检 测器就将流动相中各组分浓度变化转变成电信号，由记 录仪记录下信号一时间曲线，

7、称为色谱流出曲线或色谱由色谱图可直接得到的相关术语: 基线 色谱峰 色谱时间由色谱图可间接得到的相关术语: 色谱体积相对保留值15由记录其噪声均基线(Baseline)在色谱操作条件下，仅有流动相通过检测器时, 仪得到的信号一时间曲线。nr|T>SSSo进祥/1 空y峰1疔r才=! /Orz;JB1m 18 3 色谱诚出曲线基线漂移：基线随时间定向缓慢的变化。基线噪声：由于各种原因引起的基线波动。不论有无组分流出,存在，它是一种背景信号。色谱峰(Chromatographic peak)流动相带着组分通过检测器时，由记录仪得到的信号一时峰底(Peak base):从峰的起点到峰的终点之间

8、连线。峰高(Peak hight)：峰的顶点至峰底的垂直距离,通常用h表示。 峰面积(Peakarea):峰与峰底之间的面积，用A表示。色谱峰区域宽度(Peak width)是色谱流出曲线的一个重要参数，它直接反映了分离 条件的好坏。习惯上有下面三种表示方法： 1)标准偏差：峰高0.607处色谱峰宽度的一半，用q表示。 2)峰宽或基线宽度：通过峰两侧的拐点作切线与峰底相 交的宽度，用Y表示。与标准偏差的关系为：Y二4® 3)半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度，用表示。与标准偏差的关系为：Y,二2o(21n2)1/2o15色谱时间色谱时间主要有：死时间(Dead time):不被固定相吸附

9、或溶解的惰性组分，从 进样到出峰的峰顶点之间测得的时间，用t”表示。保留时间(Retention time):从进样到组分峰顶点之间测得的 时间，用tR表示。调整保留时间(Adjusted Retention Time)：调整保留时间指组分 的保留时间扣除死时间后的时间，用tR表示。tR=tR4M1*1 1 8 3色谱体积色谱体积主要有：死体积(Dead Volume):死体积指色谱柱填充固定相后的空隙体积, 又指在死时间内流动相流经色谱柱的体积。死体积通常用Vg表示。V 石 tM X FcFc表示流动相的体积流速(mL/min)保留体积(Retention Volume):保留体积指从进样开

10、始，到检测器 中样品浓度最大时，流动相流经色谱柱的体积。通常用Vr表示。Vr二 Ir X Fc调整保留体积(Adjusted Retention Volume)：调整保留体积指保留体 积扣除死体积后的体积。通常用Vr表示。vQr X Fc相对保留值(Relative Retention Value)相对保留值指某组分i与基准组分s的调整保留值之比。 通常用瓜表示。% =卽=以(S)一 一 f) 匕?(s) Vg(s)15色谱理论研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱 分离的内在联系。热力学动力学分离条件的选择和优化塔板理论它把色谱柱看成一个分懈塔.分憾塔是分离沸点不同的混合 物的

11、一种装置，一般有十儿层塔片。在塔的底层加热，利用 各组分的挥发性不同，在塔片上经过多次气液平衡，最终低 沸点组分在塔顶的流出液中含量高，而高沸点组分在塔底层 含量高。:塔板理论，是人为的认为在色谱柱中存在着塔片。在每个塔 片咼度的间隔内，样品混合物的各组分，在流动相与固定相 达到分配平衡。而后各组分被流动相携带转移至另一层塔片, 再达分配平衡。41经多次转移平衡，各组分按分配系数大小的顺序，依次流岀 色谱柱（分配系数小的先出柱）。由于一根色谱柱的塔片数 比精憾塔多得多（103104片），因此，只要分配系数间存 在微小的差别，则可获得很好的分离。#塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础

12、上发展 起来的。他们假定： 1.流动相按前进方向以脉冲式通过柱子，最小单位为一塔 板体积； 2.组分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在 柱内的位置无关； 3.组分在所有塔板上的两相平衡在瞬间建立； 4.流动相不能被压缩； 5.所有组分浓度以起始塔板中的浓度为基准由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽 的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达成“平衡”所需 的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论 板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡” 次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值 是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。:塔板理论回答了影响

13、色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问 题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操 作条件的影响。理论塔板数越大，峰形越窄，柱效越高。:塔板高度表示单位柱长下的柱效。塔板高度越小，表明柱效越高，理论塔板数越多。45非平衡速率理论1952年Lapidus等对填充柱色谱过程做了较详细的研究, 指出色谱过程中引起组分宽度扩张的因素主要是： 1 沿柱流动方向的纵向扩散效应；:2组分在两相间的平衡不能瞬时达成，即它在两相交换时 传质速度是有限的。#心必普+0.01/ d；(1+灯厂可7C越鲁u47#:这就是著名的范底姆特方程。也可把Van Deemter方 程描述为：H = A + B!U + C

14、U#:与气相色谱不同，液相色谱有其特点，因而其速率理 论的表述方式也有区别：H He + Hl + Hs + Hmm + sm各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）上一丄ILL_丄匸"传质速率控制理论根据溶质从液相主体到吸附剂上吸附点的过程建立模型。液膜传质扩散速率控制模型吸附剂表面吸附速率控制模型孔扩散速率控制模型气相色谱气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异， 以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合 物的色谱方法。一 气相色谱法的特点优点：分离效率高、应用范围宽、分析速度快、样品用量少； 灵敏度高、分离和测定一次

15、完成、自动化程度高.缺点：不适用于高沸点（450°C）、有生物活性的物质的分离测定 不适用于制备.气相色谱结构流程I- 载气钢瓶；2-减压阀；3-净化干燥管；4-针形 阀；5-流量计；6-压力 表；7-进样口； 8-色谱柱;9-检测器；10-放大器；II- 温度控制器；12-记录 仪或工作站载气系统进样系统k色谱柱温控系统:待测样品在高温的气化室气化后在惰性气体的带动下进入色 谱柱，色谱*主内含有液体或固体固定相每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平 衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立。由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配 或阪附、解吸。结果

16、是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定 相中分配浓度大的组分后流出色谱柱，进入检测器。550550.W0751-W151-7S Z-K275 Eg甲醇和乙醇混合样色谱图高效液相色谱高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展 起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前 已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技 术上釆用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具 备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。高效色谱仪59m 相髙MM相色谱仪红贱承焉憂llliil imIiii ill! tllMlI首

17、先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱， 然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品 同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记 录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。#蔬菜、水果中农药残的检测631艾氐齐2円，-DDT3?,卩 -DDT 4. 666£ 恩氏剂#浓度札I应对应关系图65>UJ<D詈o>3200 oa3000 0(J28OO.od2600.002400 oa2200 0(J2000 0(J1800.0(J1600.00 1400 00 1200 00 1000.00800.00600

18、 oq400 oa2oo. oao.oq(s沃 Am) so o o o o o o o o o o o9 8 7 6o o o o o o5 400 o3o o oo o o o2 1y = 6130. 5x + 863. 66R2 = 0. 98840. 40. 60. 81浓度(mol/L)1. 21.4#0 002.00Timemin苯和丙酮混合样的色谱图#液相色谱的主要特点是：分离效率高；选择性好，适用于多种多元组分复杂混合物的分离；应用范围广。从无机物到有机物，从天然物质到合成产物, 从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。凝胶色谱是以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根

19、据流动相中 所含各种组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一种色 谱技术。凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱基本原理大分子物质在凝胶颗粒间隙中运动小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝 胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中， 从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此 不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物 质结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出， 分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。69:优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、 凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。71ECHOS jo lunoluvVol

20、ume of effluent分离过程51:凝胶柱床总体积是各部分体积之和。溶质分子在流动相和固定相之间的分配系数与被分离物质分 子大小及凝胶颗粒内孔隙大小有关。Kd值在01之间。可通过实验求岀进而判断溶质的行为模式。#凝胶色谱介质理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐 受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围 窄，珠粒颗粒大小均一度高。凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 等。凝胶色谱的应用脱盐去除小分子物质相对分子质量测定一定范围内，蛋白质的分配系数与相对分子质量的对数呈线 性关系。分离纯化浓缩离子交换色谱是通过带电的溶质分子与离子交换介质中可交换的离子进行 交换而达到分离纯化目的的方法。该方法分辨率高、容量大、容易操作。55基本原理带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得 以相互分离。蛋白质是两性电解质。当pH < pl时，蛋白质带净正电 荷；当pH>pI时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过 改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的 吸附作用，从而将它们相互