第10章 吸光光度法

1、第第10章章 吸光光度法吸光光度法(Spectrophotometry) 基于被测物质的分子对光的选择性基于被测物质的分子对光的选择性吸收而建立的分析方法。吸收而建立的分析方法。10.1.1 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收1. 光的分类光的分类光是一种电磁波光是一种电磁波按波长不同分类按波长不同分类：x射线，紫外光，可见光，射线，紫外光，可见光， 红外光，微波等。红外光，微波等。10.1 物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律hchE400 nm750 nm电磁波谱范围表电磁波谱范围表2. 分子吸收光谱产生原理分子吸收光谱产生原理 由物质的价电子

2、能级跃迁由物质的价电子能级跃迁 （能量差在（能量差在120eV）而）而产生的吸收光谱产生的吸收光谱，是是紫外及可见分光光度法紫外及可见分光光度法本章本章研究内容。研究内容。 由物质的分子振动能级（能量差约由物质的分子振动能级（能量差约0.05l eV）和）和转动能级（能量差小于转动能级（能量差小于0.05 eV）的跃迁而产生的吸收）的跃迁而产生的吸收光谱，为光谱，为红外吸收光谱法红外吸收光谱法用于分子结构的研究。用于分子结构的研究。说明：物质只有对特定波长说明：物质只有对特定波长(能量能量)的光才能有吸收。的光才能有吸收。 吸收光谱是由物质对不同波长的光具有选择性吸收吸收光谱是由物质对不同波长

3、的光具有选择性吸收 作用而产生的。作用而产生的。3. 有色溶液对光的选择性吸收有色溶液对光的选择性吸收 单色光、复合光、互补光单色光、复合光、互补光单色光单色光:具有同一波长的光具有同一波长的光复合光复合光:包含不同波长的光包含不同波长的光互补光互补光: 若两种不同颜色若两种不同颜色的单色光按一定的强的单色光按一定的强度比例混合得到白光，度比例混合得到白光，这两种单色光为互补这两种单色光为互补光。光。蓝蓝黄黄紫紫绿绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿 有色溶液对光的吸收有色溶液对光的吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光溶液的颜色与其吸收掉光的颜色为互补色。溶液的颜色与其吸收掉光的颜色为互补色。 物质

4、的电子结构不同，价电子跃迁所需能量不同，物质的电子结构不同，价电子跃迁所需能量不同，所吸收光的波长不同，因此溶液对光的选择性吸收，所吸收光的波长不同，因此溶液对光的选择性吸收，使其呈现不同颜色。使其呈现不同颜色。有色溶液呈现不同颜色的原因有色溶液呈现不同颜色的原因:复合光复合光10.1.2 光吸收的基本定律光吸收的基本定律透光率：透光率：0IITtT 取值为：取值为：0.0 % 100.0 %全部吸收全部吸收:T = 0.0 %全部透射全部透射: T = 100.0 %入射光入射光 I0透射光透射光 Itb有色溶液浓度为有色溶液浓度为 C mol/LTAlg吸光度吸光度:1. Lambert-

5、Beer定律定律KbCA取值为：取值为：0 光度法定量依据光度法定量依据 一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。这是进行比。这是进行定量分析的理论基础定量分析的理论基础。 溶液中含有多种吸光物质时，由于各吸光物溶液中含有多种吸光物质时，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质之间相互不发生化学反应，该波长下溶液的物质之间相互不发生化学反应，该波长下溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。这一总吸光度应等于各

6、吸光物质的吸光度之和。这一规律称规律称吸光度的加和性吸光度的加和性。朗伯朗伯-比尔定律表明：比尔定律表明：吸光系数吸光系数 K 比例常数比例常数b：吸光物质的厚度：吸光物质的厚度 光程（光程（cm）C：吸光物质的浓度（：吸光物质的浓度（ g / L，mol / L等）等）入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质温度等温度等影响影响K的因素的因素:C：mol / L 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 L mol 1 cm -1C： g / L 吸光系数吸光系数 K L g 1 cm -1bCAKbCA K的单位：取决于的单位：取决于C的单位的单位2. 摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度

7、 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 其大小反应了吸光物质对光的其大小反应了吸光物质对光的吸收能力吸收能力, ,也反应了分光光度法测也反应了分光光度法测定吸光物质的灵敏度。定吸光物质的灵敏度。 的获得：实验测定的获得：实验测定 对同一吸光物质，对同一吸光物质，max 处的处的 最大最大, ,即在即在max处测处测定的灵敏度最高。定的灵敏度最高。 105低灵敏度低灵敏度中等灵敏度中等灵敏度高灵敏度高灵敏度 对同一种待测物质，不同的方法具有不同的对同一种待测物质，不同的方法具有不同的 ，表明具有不同的灵敏度。表明具有不同的灵敏度。 桑德尔桑德尔 (Sandell) 灵敏度灵敏度 S2cmugMS 当仪器的检

8、测极限当仪器的检测极限 A=0.001时，单位截面积光程内所时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，单位为能检测出来的吸光物质的最低含量，单位为 gcm-2 。S 越小，测定的灵敏度越高。越小，测定的灵敏度越高。例题例题 一单色光通过1cm厚的有色溶液是强度减弱20%,如通过5cm的相同溶液,其强度减弱了百分之几？A1 = Kb1C A2 = Kb2C 2121bbAAA1 = lgT1 A2 = lgT2T1802121lglgbbTTT232.8减弱了67.210.2 吸收光谱（吸收曲线）吸收光谱（吸收曲线） 测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长测量某物质对不同波长单

9、色光的吸收程度，以波长（ ）为横坐标，吸光度（为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化曲线，即为吸收光谱。长的变化曲线，即为吸收光谱。1. 最大吸收波长最大吸收波长max ：光吸收程度光吸收程度最大处的波长。最大处的波长。2. 同一物质浓度增加时，吸收曲线同一物质浓度增加时，吸收曲线形状相同，形状相同，max不变，吸光度增大。不变，吸光度增大。 可见光光度法：可见光光度法：测定的物质要有颜色测定的物质要有颜色参比溶液的选择参比溶液的选择参比的作用：扣除非待测组分的吸收。（利用参比溶液来调节仪器的零点） A 总 = A 待测物 + A 干扰 + A 池令

10、A 参比 = A干扰 + A 池 = 0参比溶液的选择： （1）当试液及显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比溶液；（2）显色剂为无色，而被测试液中存在其他有色离子，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液；（3）显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液；（4）显色剂和试剂均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰；（5）改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。10.3 显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素1. 显色反

11、应显色反应 待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为此反应称为显色反应显色反应，所用的试剂称为，所用的试剂称为显色剂显色剂。10.3.1 显色反应和显色剂显色反应和显色剂显色反应的类型：显色反应的类型：主要有氧化还原反应和络合反应主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。两大类，而络合反应是最主要的。显色反应的要求：显色反应的要求：a. 选择性好选择性好b. 灵敏度高灵敏度高 (104)c. 产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d. 化学性质

12、稳定化学性质稳定e. 反应物和产物有明显的颜色差别反应物和产物有明显的颜色差别 ( 60 nm)2. 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：有机显色剂： 磺基水杨酸，丁二酮肟，磺基水杨酸，丁二酮肟，1,10-邻二氮菲，邻二氮菲， 二苯硫腙等二苯硫腙等3. 多元络合物多元络合物混配化合物混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物离子缔合物 AuCl4-罗丹明罗丹明B金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮水杨基荧光酮-CTMAB 10.3.2 影响显色反应的

13、因素影响显色反应的因素溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液）显色剂的用量显色剂的用量显色反应时间显色反应时间显色反应温度显色反应温度溶剂溶剂干扰离子干扰离子10.4.1 测量波长和标准曲线的制作测量波长和标准曲线的制作1. 测量波长的选择测量波长的选择无干扰无干扰: 选择选择 max有干扰有干扰: 干扰最小，吸收最大干扰最小，吸收最大A A 10.4 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制定量方法定量方法: 标准曲线法标准曲线法AxCxAC0配制系列待测物标准溶液配制系列待测物标准溶液: C1、C2Cn 相同条件下测吸光度相同条件下测吸光度: A1、A2An 标准曲线的制作

14、标准曲线的制作:2. 标准曲线的制作标准曲线的制作AC0参比溶液选择不当，参比溶液选择不当，参比与待测液的吸收池厚度不等，参比与待测液的吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等，吸收池透光面不清洁等，被测物质在低浓度时显色不完全等。被测物质在低浓度时显色不完全等。 标准曲线不过原点的原因标准曲线不过原点的原因:10.4.2 对朗伯对朗伯- -比尔定律的偏离比尔定律的偏离AC0负偏离负偏离1. 非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离2. 介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离3. 由于吸光物质本身的化学反应引起的偏离由于吸光物质本身的化学反应引起的偏离A 解离解离B

15、络合络合C 缔合缔合正偏离正偏离4. 显色反应的干扰及其消除：显色反应的干扰及其消除：10.4.3 吸光度测量的误差吸光度测量的误差 吸光度标尺刻度不均匀，吸光度标尺刻度不均匀，吸光度的读数误差即吸光度的读数误差即为浓度的测量误差，故吸光度应控制一定的读数范围。为浓度的测量误差，故吸光度应控制一定的读数范围。%100%100cdcAdAEr透光率读数的绝对误差是均匀的透光率读数的绝对误差是均匀的因此，测量误差与透光率读数范围的关系：因此，测量误差与透光率读数范围的关系：%100lnTTTEr%100AdAEr%100lnTTdTT为透光率读数的绝对误差，一般为为透光率读数的绝对误差，一般为0.

16、01。TTAln434. 0lgTdTdA434. 0Er-T 关系图：关系图：T = 36.8 %，A = 0.434 时误差最小。时误差最小。 Er 4%时时: T: 15%65 % A: 0.20.810.5 示差吸光光度法示差吸光光度法1. 示差吸光光度法的原理示差吸光光度法的原理 (高浓度高浓度)常规法常规法: 以试剂空白为参比以试剂空白为参比示差法示差法: 以浓度为以浓度为 Cs 的标准溶液为参比的标准溶液为参比 (CsCx)示差法定量依据示差法定量依据ACCxAxbCAsxAA )(sxCCbxCbAsxxCCC2. 示差吸光光度法的误差示差吸光光度法的误差常规法常规法T0 5

17、1050100示差法示差法T0 5 1050100TsTx例：习题例：习题10-8例题例题 一未知浓度的有色溶液采用普通光度法一未知浓度的有色溶液采用普通光度法,其其吸光度值为吸光度值为1.22,相同条件下测得同一物质标准相同条件下测得同一物质标准溶液的吸光度为溶液的吸光度为1.0, 如改用示差法测定未知浓如改用示差法测定未知浓度的溶液度的溶液,其吸光度有多大？其吸光度有多大？解解:普通光度法普通光度法: As=1.0 Ts=10% . 示差法示差法: %100ST扩大了扩大了10倍倍,%60XT22. 0SAAx=1.22 Tx=6% 1. 弱酸弱碱离解常数的测定弱酸弱碱离解常数的测定HR

18、= H+ + R-R RA HR HRC= HR + R10. 6 吸光光度分析法的应用吸光光度分析法的应用配制高酸度、高碱度、某配制高酸度、高碱度、某pH条件下总浓度条件下总浓度 C 相同的三份相同的三份HR 溶液。溶液。绘制酸式绘制酸式 HR 或碱式或碱式 R- 的吸的吸收曲线，选择收曲线，选择最佳最佳吸收波长。吸收波长。在该波长处，测某在该波长处，测某pH条件下条件下HR溶液的吸光度溶液的吸光度A。aaRaHRKHKAKHHAARbHRbARHRaaRaHRKHCKbKHHCbA(4) 当高酸度时，当高酸度时， HR C，则，则AHR HRbC。(5) 当低酸度时，当低酸度时， R C，

19、则，则AR RbC。根据分布系数的概念根据分布系数的概念AAAApHpKHRRalg说明：说明：AHR 酸性溶液中全部以酸性溶液中全部以HR存在时的吸光度存在时的吸光度 AR 碱性溶液中全部以碱性溶液中全部以R存在时的吸光度存在时的吸光度 A 某某pH下下HR+R的吸光度的吸光度 且三个吸光度的测定波长相同且三个吸光度的测定波长相同RHRaAAAAHK2. 络合物组成的测定络合物组成的测定（1）饱和法（摩尔比法）饱和法（摩尔比法）M + nR = MRn 固定固定CM，改变，改变CR，使其从，使其从 0 开始增大，开始增大， 配制系列标准溶液。配制系列标准溶液。 以试剂空白为参比在特定波长测定

20、以试剂空白为参比在特定波长测定A。 以以 A 对对 CR/CM 作图。作图。ACR/CMn（2）连续变化法（等摩尔系列法）连续变化法（等摩尔系列法） 固定固定CM+ CR =C （CM / C 从从 0 1），）， 配制系列标准溶液。配制系列标准溶液。 在络合物的在络合物的 max 处测定处测定A。 以以 A对对 CM/C 作图作图 , 求得求得 CR / CM =n。0.501.0ACM / C0.33CM / C =0.5，n = 1CM / C =0.33，n = 2M + nR = MRn1. 解释下列名词：解释下列名词：a. 光吸收曲线及标准曲线；光吸收曲线及标准曲线； b. 互补色

21、光及单色光；互补色光及单色光； c. 吸光度及吸光度及透射比。透射比。答：答：a、光吸收曲线：描述溶液对不同波长的光的吸收情况的关、光吸收曲线：描述溶液对不同波长的光的吸收情况的关系曲线，又称吸收光谱曲线。是测量某种物质对不同波长单色光系曲线，又称吸收光谱曲线。是测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图而得出的曲的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图而得出的曲线。线。标准曲线：在选择的实验条件下分别测量一系列不同含量的标准标准曲线：在选择的实验条件下分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度溶液的吸光度，以标准

22、溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线，又称为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线，又称工作曲线。工作曲线。b、互补光：两种光按一定的强度比例混合可成为白光，这两种、互补光：两种光按一定的强度比例混合可成为白光，这两种光称为互补光。光称为互补光。 单色光：具有单一波长的光。单色光：具有单一波长的光。c、吸光度：、吸光度：A=lgI0/I，其物理意义是有色溶液吸收单入射光的程，其物理意义是有色溶液吸收单入射光的程度。度。透射比：透过光强度与入射光强度的比值称为透射比，又称透光透射比：透过光强度与入射光强度的比值称为透射比，又称透光度，用

23、度，用T表示，表示，T=I/I0。2. 符合朗伯-比尔定律的某一吸光物质溶液，其最大吸收波长和肖光度随吸光物质浓度的增加其变化情况如何？答：最大入射光波长max不随浓度c的变化而改变，吸光度A与c成正比。即最大吸收波长不变，吸光度增大3. 吸光物质的摩尔吸收系数与下列哪些因素有关？入射光波长，被测物质的浓度，络合物的解离度，掩蔽剂。答：摩尔吸收系数与入射光波长有关，与被测物质的浓度、络合物的解离度、掩蔽剂无关。4. 试说明吸光光度法中标准曲线不通过原点的原因。答：造成这种情况的原因比较复杂，可能是由于参比溶液选择不当，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引起的。5. 在吸光光度中，影响显

24、色反应的因素有哪些？答：影响显色反应的主要因素有：溶液酸度，显色剂用量，显色时间，显色温度，溶剂及共存离子等。6. 酸度对显色反应的影响主要表现在哪些方面？答：酸度对显色反应的影响主要表现为：影响显色剂的平衡浓度的颜色；影响被测金属离子的存在状态；影响络合物的组成等。7. 在吸光光度法中，选择入射光波长的原则是什么？答：选择入射光时，若无干扰时，选择最大入射波长，提高测定的灵敏度；若有干扰时，应选择吸收最大，而干扰最小的入射波长。8. 分光光度计是由哪些部件组成的？各部件的作用如何？答：8. 分光光度计是由哪些部件组成的？各部件的作用如何？解：主要部件：光源、单色器、比色皿、检测器和显示装置。光源可以发射连续光谱，是产生入射光的基础；单色器是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置，提供单色光作为入射光；比色皿是盛放试液的容器；检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量；显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透射比T的方式显示或记录下来。9. 测量吸光度时，应如何选择参比溶液？解：（1）当试液及显色剂均无色时，