第1章蛋白质结构与功能(已看)

1、蛋白质化学蛋白质化学张张 锴锴生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系基础医学院南楼基础医学院南楼407/1生物化学生物化学：研究生命物质的化学组成、结构及生命研究生命物质的化学组成、结构及生命过程中各种化学变化的科学。过程中各种化学变化的科学。：1. 生物分子的结构与功能。生物分子的结构与功能。2. 物质代谢、能量代谢及代谢调节。物质代谢、能量代谢及代谢调节。3. 基因信息的传递及调控。基因信息的传递及调控。2生物化学生物化学：揭示生命的奥秘。：揭示生命的奥秘。新的概念和分支学科发新的概念和分支学科发展、新的技术发展、与其它学科的联系。展、新的技术发展、与其它学科的联系。3人类基因组计划

2、和基因测序技术人类基因组计划和基因测序技术n1990年美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约2.5万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的图谱。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。n1998年美国PE Biosystems公司，以其刚研制的300台最新毛细管自动测序仪为基础，宣称要在3年内，完成人类基因组测序。n2001年人类基因组草图耗资4.37亿美元，耗时13年。n2007年，第一个完整人类基因组序列图谱的诞生只花费了150万美元。n2009年美国加州的科学家将纳

3、米技术与芯片技术相结合，发明了一种新型测序方法，速度提高3万倍。n二代基因测序技术的发展，目前已经降到几万美元。4蛋白质组学蛋白质组学n1990 每次分析1个或几个蛋白n2000 每次分析几百个蛋白n2010 每次分析4000个蛋白5基因组学基因组学6Chapter 1Structure and function of protein第一章第一章蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能7 本章要求本章要求1.掌握蛋白质的分子组成、分子结构及理化性掌握蛋白质的分子组成、分子结构及理化性质。质。2.熟悉蛋白质多肽链组成，蛋白质结构与功能熟悉蛋白质多肽链组成，蛋白质结构与功能的关系，氨基酸的理化性质。的

4、关系，氨基酸的理化性质。3.了解蛋白质的分离纯化方法及一级结构测定了解蛋白质的分离纯化方法及一级结构测定原理。原理。4.掌握下列概念：氨基酸、肽键、一级结构、掌握下列概念：氨基酸、肽键、一级结构、二级结构、三级结构、四级结构、二级结构、三级结构、四级结构、螺旋、螺旋、折叠、模体、结构域、亚基、分子伴侣、分子折叠、模体、结构域、亚基、分子伴侣、分子病、蛋白质等电点。病、蛋白质等电点。8一、蛋白质的生物学意义一、蛋白质的生物学意义蛋白质是构成生物体的重要组成物质蛋白质是构成生物体的重要组成物质 2. 蛋白质是生物体生命活动的执行者蛋白质是生物体生命活动的执行者 第一节第一节 概述概述91 .按组成

5、成分按组成成分 A .单纯蛋白质单纯蛋白质 B .结合蛋白质结合蛋白质二、蛋白质的分类二、蛋白质的分类 2 .按分子的形状或空间构象按分子的形状或空间构象 A .纤维状蛋白纤维状蛋白 B .球状蛋白质球状蛋白质3 .按按“家族家族” 具有相同或类似结构的蛋白归为一个具有相同或类似结构的蛋白归为一个“家家族族”，这种分类方法既包含结构特性，又提，这种分类方法既包含结构特性，又提示功能特性。示功能特性。10三、蛋白质的功能三、蛋白质的功能 催化功能催化功能酶酶 运输与储存运输与储存血红蛋白血红蛋白 调节功能调节功能蛋白质多肽类激素蛋白质多肽类激素 机械运动与支持机械运动与支持肌肉蛋白肌肉蛋白 保护

6、与免疫保护与免疫凝血酶原和免疫球蛋白凝血酶原和免疫球蛋白 营养和储存营养和储存酪蛋白、铁蛋白酪蛋白、铁蛋白11三羧酸循环14四、蛋白质结构的组织层次四、蛋白质结构的组织层次 为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。构。 蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次一级结构一级结构空间结构空间结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构超二级结构超二级结构结构域结构域15第二节第二节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成 C

7、H O N S（ 50%） （7%） （23%） （16%） （03%）其它其它 : P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I磷磷 铜铜 铁铁 锌锌 锰锰 钴钴 硒硒 碘碘凯氏定氮法凯氏定氮法蛋白质含量蛋白质含量/g样品样品 = 含氮量含氮量/g样品样品 6.2516二、氨基酸二、氨基酸（一）氨基酸的结构（一）氨基酸的结构H2N C COOHHRL- -氨基酸氨基酸HN CCOOHHH2CCH2CH2H2NC COOHHH脯氨酸脯氨酸甘氨酸甘氨酸 -氨基酸结构通式氨基酸结构通式 17构型：根据甘油醛构型确定构型：根据甘油醛构型确定D型和型和L型型1 . 根据甘油醛原则确定构型。根据甘油醛原则

8、确定构型。2 . 自然界的氨基酸有两种构型。自然界的氨基酸有两种构型。3 . 组成蛋白质的氨基酸都是组成蛋白质的氨基酸都是L型型。18 （二）（二） 氨基酸的分类氨基酸的分类编码氨基酸编码氨基酸 ：20种种非编码氨基酸非编码氨基酸（无相应的遗传密码）（无相应的遗传密码）修饰氨基酸修饰氨基酸仅参与代谢的氨基酸仅参与代谢的氨基酸（有相应的遗传密码）（有相应的遗传密码） -丙氨酸、丙氨酸、 -氨基丁酸氨基丁酸羟赖氨酸、羟脯氨酸羟赖氨酸、羟脯氨酸19编码编码氨基酸氨基酸的分类原则：的分类原则： 侧链基团侧链基团R的结构及理化性质的结构及理化性质20氨基酸名称氨基酸名称英文缩写英文缩写简简 写写氨基酸名

9、称氨基酸名称英文缩写英文缩写简简 写写甘氨酸甘氨酸GlyG丝氨酸丝氨酸SerS丙氨酸丙氨酸AlaA苏氨酸苏氨酸ThrT缬氨酸缬氨酸ValV天冬酰胺天冬酰胺AsnN异亮氨酸异亮氨酸IleI谷酰胺谷酰胺GlnQ亮氨酸亮氨酸LeuL酪氨酸酪氨酸TyrY苯丙氨酸苯丙氨酸PheF组氨酸组氨酸HisH脯氨酸脯氨酸ProP天冬氨酸天冬氨酸AspD甲硫氨酸甲硫氨酸MetM谷氨酸谷氨酸GluE色氨酸色氨酸TrpW赖氨酸赖氨酸LysK半胱氨酸半胱氨酸CysC精氨酸精氨酸ArgR 20种基本氨基酸的英文简写种基本氨基酸的英文简写21非极性疏水性氨基酸：非极性疏水性氨基酸：Gly、Ala极性极性极性中性氨基酸：极性中

10、性氨基酸： Trp、Tyr可解离可解离酸性氨基酸：酸性氨基酸：Asp、Glu碱性氨基酸：碱性氨基酸：Lys、Arg、His242种新发现的基本氨基酸：种新发现的基本氨基酸： 硒半胱氨酸（第硒半胱氨酸（第21种）种） 吡咯赖氨酸（第吡咯赖氨酸（第22种）种）25（三）（三）氨基酸氨基酸的理化性质的理化性质 1. 两性电离和等电点（两性电离和等电点（isoelectric point, pI）不同不同pHpH时氨基酸以不同的离子化形式存在：时氨基酸以不同的离子化形式存在： H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+ H+ OH-+ H+ OH-H2NCHCOOR-正离子正离子两性离子两性离子负离子

11、负离子 氨基酸所带静电荷为氨基酸所带静电荷为“零零”时，溶液的时，溶液的pH值称为该值称为该氨基酸的等电点（氨基酸的等电点（isoelectric point），以），以pI表示。表示。26 实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。极少量的中性分子。 溶液的溶液的pH=pI时时pHpI时时H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+H2NCHCOOR-H2NCHCOOHR282. 紫外吸收性质紫外吸收性质 酪氨酸酪氨酸 max2

12、75nm 苯丙氨酸苯丙氨酸 max257nm 色氨酸色氨酸 max280nm 293. 呈色反应呈色反应氨基酸氨基酸 + 茚三酮茚三酮蓝紫色蓝紫色茚三酮反应：茚三酮反应：两个亚氨基酸两个亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物。应形成黄色化合物。加热加热30 氨基酸的氨基酸的-氨基、氨基、-羧基及侧链羧基及侧链R基基均可参加多种化学反应。均可参加多种化学反应。 4. 其他反应其他反应31三、肽键和多肽链三、肽键和多肽链（一）肽与肽键（一）肽与肽键 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为间失水形成的酰

13、胺键称为肽键肽键，所形成的化合物，所形成的化合物称为称为肽肽。H2NC COHH R1O R2HNC COOHHHH2NC CH R1O R2 NC COOHHH+-H2O氨基酸残基氨基酸残基1氨基酸残基氨基酸残基2肽键肽键32OH2NC CH R1O R2 NC CHH R3 NC CHHO R4 NC CHHO R5 NC CHHO R6 NC COHHHO寡肽寡肽 10aa 多肽多肽+H3NCOO-R1R2R3R4R5N-末端末端C-末端末端多肽链侧链多肽链侧链肽链书写方式：肽链书写方式：N端端C端端 34（二）（二） 生物活性肽生物活性肽 谷胱甘肽（谷胱甘肽（glutathione,

14、GSH） 分子中具有一个分子中具有一个 -肽键肽键 三肽（三肽（GluCysGly），含有自由的巯），含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。氧化，使其处于活性状态。第三节第三节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构 37一、一级结构（一、一级结构（primary structure） 定义定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定：规定： 蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中蛋白质的一级结构指蛋

15、白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。 2. 一级结构的意义一级结构的意义第三节第三节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构 39 最先由最先由Sanger于于1953年完成测定胰岛素一级结构年完成测定胰岛素一级结构 胰岛素是动物胰中胰岛胰岛素是动物胰中胰岛细胞分泌的一种分子量较小的细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用来激素蛋白，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用来治疗糖尿病。治疗糖尿病。40高级结构高级结构（构象）（构象）二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构 蛋白质的一级结构又称初级结构，二级

16、结构、三蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象。构、高级结构、三维结构或构象。 41构象（构象（conformation）主链构象主链构象侧链构象侧链构象：指多肽主链骨架上各原子的：指多肽主链骨架上各原子的 排列与相对关系排列与相对关系：指各氨基酸残基侧链：指各氨基酸残基侧链R基团基团 中原子的排列及相互关系中原子的排列及相互关系42二、二级结构（二、二级结构（secondary structure） 早在早在20世纪世纪30年代，年代，Pauling和和Corey就开始

17、就开始用用X射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构，他射线衍射方法研究了氨基酸和肽的结构，他们得到了们得到了重要的结论重要的结论: 肽键的键长介于肽键的键长介于C-N单键和双键之间，具有单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋转。部分双键的性质，不能自由旋转。 43（一）（一） 肽单元（肽单元（peptide unit） 参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2被约束于一个平面上，此同一平被约束于一个平面上，此同一平面上的面上的6个原子构成肽单元。个原子构成肽单元。47 指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链

18、骨架原子的相对空间位置。也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置。（二）二级结构的概念和种类（二）二级结构的概念和种类 蛋白质的二级结构指多肽链本身通过氢键沿一蛋白质的二级结构指多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。定方向盘绕、折叠而形成的构象。 48维持二级结构的化学键：氢键维持二级结构的化学键：氢键 它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键。(注注:二级结构不涉及侧链的构象二级结构不涉及侧链的构象) 主要有主要有 螺旋、螺旋、 折叠、折叠、 转角、无规卷曲。转角、无规卷曲。50 1. 螺旋螺旋 ( -helix) 1950年美

19、国年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白等人在研究纤维状蛋白质时，提出了质时，提出了螺旋，后来发现在球状蛋白质分螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在子中也存在螺旋。螺旋。 (1) 右手螺旋，每圈含右手螺旋，每圈含3.6个个aa，螺距为螺距为0.54 nm (2) 链内氢键维持螺旋稳定链内氢键维持螺旋稳定 (3) 侧链侧链R分布在螺旋外侧分布在螺旋外侧532. 片层片层/ 折叠（折叠（ -sheet） 也是也是 Pauling 等人提出来的，它是与等人提出来的，它是与螺旋螺旋完全不同的一种结构。完全不同的一种结构。 折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折

20、叠的片层。叠的片层。(2) 链间氢链维持稳定链间氢链维持稳定。(3) 折叠有平行和反平行的两种形式折叠有平行和反平行的两种形式 (4) 侧链向片层上下伸出侧链向片层上下伸出55 也称也称回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折回折180，使得氨基酸残基的，使得氨基酸残基的C=O和与第四个残基和与第四个残基的的N-H形成氢键。形成氢键。 转角都在蛋白质分子的表面。转角都在蛋白质分子的表面。3. 转角（转角（ -turn）564.无规卷曲或自由回转无规卷曲或自由回转 （non-regular coil） 肽段在空间的不规则排布称为无规卷肽段在空间的不规则排布称为

21、无规卷曲。曲。 没有一定规律的松散肽链结构，但仍没有一定规律的松散肽链结构，但仍是有序的稳定结构。是有序的稳定结构。57超二级结构超二级结构（supersecondary structure） 蛋白质中相邻的二级结构单位（蛋白质中相邻的二级结构单位（ 螺旋或螺旋或 折叠折叠或或 转角转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。够辨认的二级结构组合体。58模体模体 在许多蛋白质分子中，在许多蛋白质分子中，2个或多个具有二级个或多个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，并发挥

22、专一的功能，被称为模殊的空间构象，并发挥专一的功能，被称为模体（体（motif）59影响二级结构形成的因素影响二级结构形成的因素n 一级结构是基础一级结构是基础n 需要分子伴侣（需要分子伴侣（chaperon）一类参与蛋白质折叠的辅一类参与蛋白质折叠的辅助蛋白质的总称助蛋白质的总称60三、三级结构（三、三级结构（tertiary strucure） 指整条肽链中全部氨基酸残基的指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即整条肽链中所有原相对空间位置，即整条肽链中所有原子在三维空间的排布位置。子在三维空间的排布位置。63三级结构的特征：三级结构的特征：n 含多种二级结构单元；含多种二级结构单元；

23、n 有明显的折叠层次；有明显的折叠层次；n 是紧密的球状或椭球状实体；是紧密的球状或椭球状实体；n 分子表面有一空穴分子表面有一空穴(活性部位活性部位)；n 疏水侧链埋藏在分子内部，疏水侧链埋藏在分子内部，n 亲水侧链暴露在分子表面。亲水侧链暴露在分子表面。实例：肌红蛋白实例：肌红蛋白65结构域结构域(domain) 对于较大的蛋白质分子，多肽链往往由两个对于较大的蛋白质分子，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种相对独立的三维实体称结构域。构，这种相对独立的三维实体称结构域。66 维持三级结构的化学键维持三级结构的化学键氢

24、键氢键疏水作用疏水作用离子键离子键范德华力范德华力二硫键二硫键次级键次级键非共价键非共价键67NH3+- OO=CO OCO HSS CH CH2 CH3CH3 CH3CH3 CH2CHCH3CH3CH2OHCH2OH C-NH2NH3OC=O+- 离子键；离子键； 氢键；氢键； 疏水力；疏水力； 范德华力；范德华力； 二硫键二硫键68四、四级结构四、四级结构 （quaternary structure） 四级结构是指由两四级结构是指由两 个或两个以上具有三级结个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。其中每条多肽链称为

25、亚基。白质分子。其中每条多肽链称为亚基。n亚基单独存在时无生物学活性。亚基单独存在时无生物学活性。n一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。n维持构象的化学键：氢键、离子键、疏水作用维持构象的化学键：氢键、离子键、疏水作用69四级结构四级结构 亚基的排列方式亚基的排列方式三级结构三级结构 所有原子的排列所有原子的排列 完整的三维结构完整的三维结构二级结构二级结构 局部主链骨架的折叠局部主链骨架的折叠一级结构一级结构 氨基酸残基排列顺序氨基酸残基排列顺序70当前人们对蛋白质的认知？当前人们对蛋白质的认知？17374第四节第四节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质

26、结构与功能的关系一、一级结构与功能一、一级结构与功能（一）一级结构是空间结构的基础（一）一级结构是空间结构的基础例：牛胰核糖核酸酶例：牛胰核糖核酸酶A（RNase A）的变性与复性的变性与复性75胰岛素胰岛素 A6 B30人人 Ser Thr猪猪 Ser Ala牛牛 Gly Ala （二）相似结构表现相似功能（二）相似结构表现相似功能 不同结构具有不同功能不同结构具有不同功能76 （三）一级结构的改变与分子病（三）一级结构的改变与分子病 镰状细胞贫血：镰状细胞贫血：Hb-A（正常人）：正常人）：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHb-S（患者）：患者）： Val-H

27、is-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys -链链 1 2 3 4 5 6 7 8 由于基因突变导致其编码蛋白质的氨基酸序列由于基因突变导致其编码蛋白质的氨基酸序列异常，进而引起生物学功能改变的遗传性疾病称为异常，进而引起生物学功能改变的遗传性疾病称为分子病分子病77二、蛋白质空间结构与功能二、蛋白质空间结构与功能（一）（一） 血红蛋白与氧结合血红蛋白与氧结合（二）（二） 别构效应别构效应78别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象，它是细胞内最简单

28、的调节方式。变的现象，它是细胞内最简单的调节方式。血红蛋白的别构效应血红蛋白的别构效应n 一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变n 进而引起另三个亚基的构象改变进而引起另三个亚基的构象改变n 整个分子构象改变整个分子构象改变n 与氧的结合能力增加与氧的结合能力增加79 蛋白质的一个亚基与配体结合后构象发生改变，蛋白质的一个亚基与配体结合后构象发生改变，引起其他亚基乃至整个分子构象发生改变，影响其引起其他亚基乃至整个分子构象发生改变，影响其他亚基与配体的结合能力，这种现象称为亚基间的他亚基与配体的结合能力，这种现象称为亚基间的协同效应（协同效应（cooper

29、ativity）正协同效应正协同效应负协同效应负协同效应80肌红蛋白与血红蛋白：两者三级结构相似肌红蛋白与血红蛋白：两者三级结构相似 Po2/133Pa 0 0 1.0 . 0.5 .20406080100活动肌肉中活动肌肉中Po2肺泡中肺泡中Po2氧饱和度氧饱和度肌红蛋白肌红蛋白血红蛋白血红蛋白81（三）构象改变与疾病（三）构象改变与疾病疯牛病：疯牛病： 朊病毒蛋白朊病毒蛋白 （prion protein, PrP）82第五节第五节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 及其分离纯化及其分离纯化83一、两性解离和等电点一、两性解离和等电点PCOOHNH3+PCOO-NH3+PCOO- NH2OH

30、-H+OH-H+阳离子阳离子 两性离子两性离子阴离子阴离子（pHpI）84蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pI） 使蛋白质所带正负电荷相等时的溶液使蛋白质所带正负电荷相等时的溶液pH值。值。蛋白质为两性离子，所带净电荷为零蛋白质为两性离子，所带净电荷为零85电泳电泳 带电粒子在电场中移动的现象，是分带电粒子在电场中移动的现象，是分离蛋白质的一种方法。离蛋白质的一种方法。等电点沉淀蛋白质等电点沉淀蛋白质 在等电点时，蛋白质的溶解度最小。在等电点时，蛋白质的溶解度最小。86二、高分子性质二、高分子性质分子量大分子量大在水溶液中形成胶体在水溶液中形成胶体 不能透过半透膜不能透过半透膜 透析透析87蛋

31、白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。88三、蛋白质的变性三、蛋白质的变性(denaturation)（一）蛋白质的变性定义（一）蛋白质的变性定义 天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋天然蛋

32、白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。但一级性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。但一级结构未遭破坏，这种现象称为蛋白质的变性。结构未遭破坏，这种现象称为蛋白质的变性。89（二）引起蛋白质变性的主要因素（二）引起蛋白质变性的主要因素1 .物理因素：物理因素： 加热、高压、紫外线照射、加热、高压、紫外线照射、X射线、超声波、射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等剧烈振荡和搅拌等2 .化学因素：化学因素： 强酸、强碱、脲、去污剂强酸、强碱、脲、去污剂十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDS

33、）、重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等。重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等。（三）蛋白质的变性后的表现（三）蛋白质的变性后的表现 生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白黏生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白黏度增加；光吸收系数增大；生物化学性质改变。度增加；光吸收系数增大；生物化学性质改变。 组分和分子量不变。组分和分子量不变。90（四）蛋白质变性的本质（四）蛋白质变性的本质 分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。破坏。 变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成变性后的蛋白质在结

34、构上虽有改变，但组成成分和分子量不变。成分和分子量不变。 91四、蛋白质的沉淀四、蛋白质的沉淀 蛋白质亲水胶体稳定的因素：蛋白质亲水胶体稳定的因素： 水化膜：吸附水分子而形成水化膜：吸附水分子而形成 表面电荷：同种电荷互相排斥表面电荷：同种电荷互相排斥92蛋白蛋白 蛋白蛋白+蛋白蛋白+蛋白蛋白+水化膜水化膜表面电荷表面电荷沉淀沉淀蛋白质沉淀的原理：蛋白质沉淀的原理： 破坏水化膜破坏水化膜 中和电性中和电性93可逆沉淀可逆沉淀（不变性）（不变性）盐析：破坏蛋白质的水化膜，中和表面电荷盐析：破坏蛋白质的水化膜，中和表面电荷 常用硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等常用硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等等电点沉淀：破坏蛋

35、白质表面净电荷等电点沉淀：破坏蛋白质表面净电荷 常用乙醇、丙酮等常用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀法（低温）：破坏蛋白质的水化膜有机溶剂沉淀法（低温）：破坏蛋白质的水化膜不可逆沉淀不可逆沉淀（变性）（变性）重金属盐沉淀重金属盐沉淀(条件：条件：pH 稍大于稍大于pI)：与蛋白质：与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质或改变蛋白质的空间结构，如的空间结构，如Hg2+、Ag+、Pb+ 。生物碱试剂沉淀法（条件：生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于稍小于pI）：）：与与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐，如蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐，如苦苦味酸、钼酸、钨酸等味

36、酸、钼酸、钨酸等加热变性沉淀法：如煮鸡蛋加热变性沉淀法：如煮鸡蛋94五、紫外吸收特性五、紫外吸收特性 蛋白质在远紫外蛋白质在远紫外光区（光区（200230nm）有 较 大 的 吸 收 ， 在有 较 大 的 吸 收 ， 在280nm有一特征吸收有一特征吸收峰，可利用这一特性峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定对蛋白质进行定性定量鉴定。量鉴定。95六、蛋白质的呈色反应六、蛋白质的呈色反应n 茚三酮反应茚三酮反应n 双缩脲反应双缩脲反应n Folin-酚反应酚反应n 考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应962.根据溶解度分根据溶解度分等电点沉淀等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀有机溶

37、剂沉淀3.根据电离性质分根据电离性质分电泳电泳离子交换层析离子交换层析1.根据分子大小分根据分子大小分透析或超滤透析或超滤离心沉淀离心沉淀凝胶过滤层析凝胶过滤层析蛋白质分离纯化的常见方法蛋白质分离纯化的常见方法4.特异亲和力：特异亲和力： 亲和层析亲和层析沉降平衡离心法沉降平衡离心法沉降速度离心法沉降速度离心法97第六节第六节 蛋白质的一级结构测定蛋白质的一级结构测定98一、样品的纯度要求：一、样品的纯度要求： 杂蛋白不应超过杂蛋白不应超过5% 二、氨基酸组成分析：二、氨基酸组成分析： 分析每条肽链中氨基酸的种类和数目分析每条肽链中氨基酸的种类和数目 三、多肽链的末端分析和序列测定三、多肽链的

38、末端分析和序列测定 ： 通过末端残基的确定可估计蛋白质中的肽链数目通过末端残基的确定可估计蛋白质中的肽链数目 四、二硫键的拆开：四、二硫键的拆开： 用变性剂拆开链间和链内二硫键用变性剂拆开链间和链内二硫键 五、肽链的部分水解：五、肽链的部分水解： 将很长的肽链切割成适合于作序列分析的足够小将很长的肽链切割成适合于作序列分析的足够小的片段的片段 六、完整多肽链顺序的确定六、完整多肽链顺序的确定： 用肽段重叠法确定整个肽链的氨基酸排列顺序用肽段重叠法确定整个肽链的氨基酸排列顺序七、二硫键的定位七、二硫键的定位 ： 氨基酸序列分析完成后，还需另加确定二硫键位氨基酸序列分析完成后，还需另加确定二硫键位

39、置的实验步骤置的实验步骤 State 1State 2Proteome 1Proteome 2蛋白质组学蛋白质组学 （Proteomics）v 蛋白组的表达蛋白组的表达v 翻译后修饰翻译后修饰 pathwaypathwayv 蛋白质相互作用蛋白质相互作用v 蛋白活性蛋白活性v 生物标志物生物标志物v 药物靶标药物靶标A screening technology for analysis of proteins properties at global scale.1. 凝胶电泳凝胶电泳2.2.基于质谱技术蛋白质组学的策略基于质谱技术蛋白质组学的策略40060080010001200140016

40、00m/z680.11164.51065.41221.5994.4456.3555.2b12b11b10b9b9b8y5b132+y4-H2OMS/MS of (M + 2H)2+ 810.9 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 811.4MS of BombesinH2N - C - C - N -R1OHC - C - N -R2OHC - C - N -R3OHC - C OOH R4HHHb1y3b2y2b3y1H2N - C - C - N -R1OHC - C - N -R2OHC - C - N -R3OHC - C OOH R4HHHb1y3b2y2b

41、3y14006008001000120014001600m/z680.11164.51065.41221.5994.4456.3555.2b12b11b10b9b9b8y5b132+y4-H2OMS/MS of (M + 2H)2+ 810.9 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 811.4MS of BombesinH2N - C - C - N -R1OHC - C - N -R2OHC - C - N -R3OHC - C OOH R4HHHb1y3b2y2b3y1H2N - C - C - N -R1OHC - C - N -R2OHC - C - N -R3

42、OHC - C OOH R4HHHb1y3b2y2b3y1ProteinProteinDatabaseM/ZProteolyticPeptidesMS/MSFragment PatternsProteolyticPeptidesGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASEDLK.IsolationIdentified proteinsGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHAT

43、KHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG2.5 基于二级基于二级 MS/MS 的生物信息学分析的生物信息学分析TheoreticalManual verification*NCO*CCO*CCN*CCCCCCCCCOCOCCCCCCCH3CH3CH3CH3CH3CH3OCO1614121086421 1R RS SR RS SS SS SA novel macrolide analog F806 is a potential anticancer reagent, the therapeutic significanc

44、e and underlying mechanisms remain unknownCells grownin “L” mediumDMSO F806 for 24hCells grownin “H” mediumMaxQuent Characterization and Quantification of ProteinsMix cells 1:1 from the two populationsM F1 F2 10 bands (KDa)100624030241423546718910Lyse cells 23546718910In-gel digestion & Nano-LC/

45、MS/MS analysisPathways and protein interaction networks regulated by F806Validation Bioinformatics AnalysisSDS-PAGESILAC cell culturem/zMS/MS for peptide ID6 Dam/zMS for quantificationThe quantitative proteomics approach for profiling of the F806-regulating proteinsIdentification of 4390 proteins; quantitative analysis for 2174 proteins in ESCCCell cycleGene NameH/LFunction in mitotic cycleCCNB10.47403G1/S, G2