骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响因素

1、骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响因素#管常东，黄艳，樊瑜波*510（北京航空航天大学生物与医学工程学院，生物力学与力生物学教育部重点实验室，北京 100191）摘要：背景：目前以骨移植为基本理念的骨组织工程在骨损伤临床治疗中被广泛应用，骨髓间充质干细胞作为骨组织工程研究领域最重要的种子细胞，其向成骨细胞方向分化的诱导成为该领域的一个研究热点。研究现状：许多研究已经证实了在体外可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，当前的研究热点集中在该诱导条件的优化，以期体外获得大量性状稳定的成骨细胞。研究用途：有助于解决骨组织工程中细胞来源的问题，在骨科疾病的临床治疗领域有重要的研究意义。关键词：生

2、物医学工程；骨髓间充质干细胞；成骨细胞；分化；生物化学因素；物理因素中图分类号：r31815influence factors on osteogenic differentiation of bonemarrow-derived mesenchymal stem cellsguan changdong, huang yan, fan yubo(key laboratory for biomechanics and mechanobiology of ministry of education, school of2025303540biological science and medical

3、 engineering, beihang university, beijing 100191)abstract: background: with the basic concept of bone graft, bone tissue engineering was widelyused in the field of bone injury clinical treatment. bone marrow mesenchymal stem cells (bmscs)were shown as the most important seed cells of bone tissue eng

4、ineering, and received extensiveattention because they could be induced to differentiate into osteoblasts. research progresses:many studies have already confirmed that bmscs could be induced to differentiate intoosteoblasts in vitro, nowadays many researchers focus on the optimization of the conditi

5、ons duringthe process of induction, in order to get numerous osteoblasts. research purposes: the aim of thosestudies were to get enough cells for bone tissue engineering, which showed significance in thefield of clinical treatment for orthopedic diseases.keywords: biomedical engineering; bone marrow

6、-derived mesenchymal stem cells; osteoblasts;differentiation; biochemical factors; physical factors0 引言骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，bmscs）是源于骨髓的多能干细胞，因具有取材容易、机体损伤小、易于体外培养增殖、有多向分化潜能、组织相容性好、易于外源基因的导入等优点，成为组织工程和基因工程理想的靶细胞，在细胞生物学、临床医学等领域有着越来越重要的研究价值。体外培养条件下，bmscs 容易被多种环境因素诱导分化，不同的

7、环境因子可诱导 bmscs 向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经元细胞、心肌细胞等方向分化。随着成体干细胞研究的不断普及，bmscs 在干细胞研究领域展现了越来越重要的价值。骨组织工程需要大量的种子细胞，近年来国内外学者和临床工作者对诱导干细胞成骨向基金项目：国家自然科学基金项目资助（10925208，11120101001）；高等学校博士学科点专项科研基金资助（20091102110031）作者简介：管常东，（1987-），女，硕士研究生，力生物学。通信联系人：樊瑜波，（1965-），男，教授，生物力学及力生物学、医疗器械、康复工程、航空航天医学工程、空

8、间生命科学、医学工程管理。e-mail: yubofan-1-分化进行了大量的研究，bmscs 以其独特的优越性引起了普遍关注。定向诱导 bmscs 向成骨细胞方向分化对骨组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为临床上骨质疏松、骨损伤等骨科疾病的攻克提供了新思路。目前有大量文献报道了关于体外定向诱导 bmscs 向成4550556065707580骨细胞方向分化的研究，应用的技术手段包括以添加生物活性因子或化学试剂为主的生物化学方法以及施加应力为主的物理方法诱导其向成骨细胞方向分化。本文综述了近年来体外诱导 bmscs 向成骨细胞方向分化的研究方法及最新进展，并对该领域进一步的研究方向进行了展

9、望。1 生物化学因素对 bmscs 成骨向分化的影响通过向 bmscs 的培养体系中添加生物化学试剂来诱导细胞的成骨向分化是比较常用的研究方法，目前研究已证实可诱导 bmscs 成骨向分化的因子包括地塞米松、磷酸甘油、抗坏血酸、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、抗炎类药物、淫羊藿黄酮类化合物、辛伐他汀类药物等1,2,3,4。wen 等5利用成骨诱导培养基（含有 10nm 地塞米松，10mm-甘油磷酸，50m 抗坏血酸）诱导鼠 bmscs 的成骨向分化。chen 等6在该成骨诱导体系中加入 10-10m 的成骨生长肽，结果证明其对 bmscs 的成骨向分化有促进作用。piek

10、 等7的研究发现维生素 d 促进bmscs 的成骨向分化。chang8等在体外分离的 bmscs 培养体系中分别加入 10-8-10-7m 的地塞米松、10-5-10-4m 的 nsaids（nonsteroidal antiinflammatory drugs，主要成分包括：吲哚美辛、酮咯酸、双氯芬酸、吡罗昔康）、塞来昔布、罗非昔布的类似物，认为该培养液体系可以诱导 bmscs 的成骨向分化。mathews 等9认为细胞外基质中的 i 型胶原酶、纤连蛋白、层粘连蛋白以及玻璃体结合蛋白都具有诱导 bmscs 成骨向分化的作用。wan 等10研究发现金黄色葡萄球菌肠毒素 c 注射液与抗坏血酸共同

11、作用可促进 bmscs 的成骨向分化。yoon 等11则发现提取自枳壳、具有抗菌消炎作用的黄酮苷对 bmscs 的成骨向分化有一定的促进作用。kim 等12研究尼古丁对人 bmscs 增殖和成骨向分化的影响，结果显示 2mm的尼古丁明显抑制人 bmscs 的成骨向分化，1-2mm 的尼古丁可使骨钙素明显降低。barhanpurkar 等13研究认为具有造血调节功能的细胞因子白介素-3 具有促进人 mscs 成骨向分化的作用。platt 等14研究发现一定浓度的共轭亚油酸可以增加 bmscs 的钙含量以及碱性磷酸酶活性从而促进其成骨向分化。you 等15证实了一氧化氮合成酶可促进 mscs 的成

12、骨向分化。dubose16的研究则发现凝血栓蛋白可以通过调节转化生长因子的活性的方式来抑制 bmscs 的成骨向分化。目前已证实生物化学因素体外可以诱导 bmscs 向成骨细胞方向分化，这对在体骨组织修复有非常重要的临床意义，但对于其诱导条件的进一步优化、分子机制探讨以及体内诱导修复等问题还有待于进一步的研究。2 物理因素对 bmscs 成骨向分化的影响通过物理因素诱导 bmscs 的成骨向分化目前也有诸多的文献报道，其中对细胞施加力学刺激是该领域的研究热点。力学因素存在于一切的细胞微环境中，体外构建工程化组织时，缺乏力学刺激可导致种子细胞功能不能完全发挥，使构建组织生物活性较低，许多研究表明

13、力学因素可以影响 bmscs 的增殖、凋亡、细胞骨架形态以及细胞的分化情况。利用适当的机械力学因素结合各种化学诱导因子等使 bmscs 向成骨细胞方向分化，在骨组织工程的研究领域具有重要现实意义，同时也为临床应用机械应力刺激的治疗提供理论依据。骨细胞体内生长的微环境中受力主要包括骨髓内液流产生的剪切应力、机体运动等产生的正应力和牵-2-张应力以及重力作用，目前许多文献报道成骨细胞对上述力学刺激较为敏感，并且在干细胞向成骨细胞分化时期力学刺激的诱导作用尤为重要17,18，因此体外研究 bmscs 的分化诱导的物理因素主要从这几个方面来研究。852.1剪切应力对 bmscs 成骨向分化的影响已有诸

14、多研究表明剪切应力对在体骨细胞的生长是一个重要的环境信号，在骨细胞生长过程中起到一定的诱导、调控作用19,20。随着骨组织工程的发展，剪切应力也被逐渐应用到bmscs 成骨向诱导中来，近年来的诸多研究已证实适当大小的剪切应力可诱导 bmscs 的成骨向分化21,22。目前体外加载剪切应力的装置主要包括锥板流室、板板流室、平行平板流动腔、圆柱管流室和径向流装置等23。大量的研究显示在剪切应力促进 bmscs 成骨向分化9095100105110的过程中，wnt、erk 等信号通路都被激活并同时激活下游蛋白或基因，因此许多研究者认为 bmscs 细胞是通过响应这些信号通路来调控其成骨向分化的。ka

15、pur 等24对 bmscs 施加 20dyn/cm2 的流体剪切应力，结果表明切应力可以诱导其向成骨细胞分化。li 等25也证明剪切应力作用 bmscs 后上调了其成骨基因的表达，并认为ca2+通道可能在细胞对力学信号的响应中起到一定的作用。liu 等26研究显示 4.2dyne/cm2的剪切应力诱导了 bmscs 的成骨向分化，证实剪切应力激活了细胞外信号调节激酶 1/2，从而进一步激活了 runx2 和 1 整合素，诱导 bmscs 的成骨向分化，并且认为细胞核因子nf-b 参与了该信号通路的调控。glossop 等27对人 bmscs 分别施加 1、5 和 10 dyne/cm2的流体

16、剪切应力，并检测了丝裂原活化蛋白激酶信号通路在细胞诱导分化中的参与作用，结果显示它参与调控众多分化基因的表达。yeatts 等28,29进一步证实了他们的观点，研究利用生物反应器对 bmscs 加载流体剪切应力后，mapk、wnt、smad 等信号通路的变化。离子通道在剪切应力诱导 bmscs 成骨向分化过程中的参与作用还有待于进一步的研究。kreke等30将大鼠 bmscs 细胞培养于成骨诱导培养液（含地塞米松、抗坏血酸、-磷酸甘油），隔天分别给予重复 5、30 和 120 分钟的流体剪切力，给予细胞成骨诱导培养液后第 2 天和第4 天施加剪切力，并在第 6 天检测，结果显示细胞碱性磷酸酶的

17、活性增高。细胞在第 6、8、10、12 天受力并在第 20 天被检测时，120 分钟的力学加载能最有效地增加骨桥蛋白和骨涎蛋白的 mrna 表达水平，从而证明，重复给予流体剪切应力可以更好地促进 bmscs 的成骨向分化。剪切应力诱导 bmscs 成骨向分化的机制尚不十分清楚，可能是剪切应力促进bmscs 表达某些蛋白多糖、细胞胞外基质、细胞因子，从而诱导 bmscs 进行选择性分化。目前剪切应力对体外培养的 bmscs 成骨向分化的研究仍然存在很多问题，如何更加科学有效地对 bmscs 进行力学加载，寻找最佳的机械力学条件，以及 bmscs 响应力学信号的具体途径，尚需进一步的探索。2.2压

18、应力对 bmscs 成骨向分化的影响在体内骨细胞的生长环境中，压应力是不可缺少一个物理因素，因此体外研究 bmscs成骨向分化的过程中，很多研究者试图分析压应力在其中起到的作用。目前研究中应用到的115压应力加载装置主要是气相静压装置和液体静压装置，向密闭的细胞培养容器内通过气体或液体施加正压力或负压力。静水压对 bmscs 成骨向的诱导与压力的大小有直接的关系，研究显示 1-50kpa 大小的静水压有助于 bmscs 的成骨向分化，而施加 0.1-10mpa 的静水压力则有助于 bmscs 的软骨向分化31。kim 等32对 bmscs 加载 0.2mpa 的动态压力，施压 1 分钟、放压

19、14 分钟，证-3-120125实了动态压应力促进了细胞的成骨向分化，同时认为信号通路细胞外信号调节激酶 1/2 可能参与了该分化诱导过程的调控作用。何川等33通过静水压装置对 bmscs 施加 40kpa 的静压力连续刺激 7、14 天，每天 4 小时，组织化学和定量分析结果显示静水压力刺激作用 7 天能促进 bmscs 的成骨向分化，而作用 14 天后则促进其成脂向分化，从而认为一定强度和作用时间的静水压力刺激有助于 bmscs 的成骨向分化。胡小毅等 34对 bmscs 施加了0.098mpa，加压 15 分钟、放压 15 分钟，连续 9 天的压应力，实验结果认为间断性压力加快了细胞成骨

20、向分化的速度。以上结果证明适度的压应力会刺激 bmscs 的成骨向分化，并且诱导作用与应力大小有关。2.3牵张应变对 bmscs 成骨向分化的影响牵张应变的加载是通过细胞生长基底膜的弹性形变来实现的，常用的力学加载系统为130135140145flexer cell 加载系统。诸多研究表明，牵张应变的大小和频率的不同会对 bmscs 的成骨向分化有不同的影响。simmons 等35对 bmscs 施加 3%、0.25 赫兹的牵张应变，并未引起明显的成骨向分化，但抑制 p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路的活性后发现细胞有明显的成骨向分化，从而认为牵张应变激活了 p38 信号通路，而该通路具有抑制

21、 bmscs 成骨向分化的作用。koike 等36则采用 0.8%-15%大小的牵张应变，发现碱性磷酸酶的活性在拉伸应变大小为 0.8%和 5%时有明显的增加，而在 10%和 15%则为降低趋势，结论认为低强度的牵张有利于 bmscs 的成骨向分化。friedl 等37分离培养了 10 位捐赠者的 bmscs，其中有 5 位男性和 5 位女性，并对这些细胞施加了最大应变值为 3000um 的应变 3 天，利用反转录聚合酶链式反应检测成骨标志性基因的表达，结果显示该应变有助于 bmscs 的成骨向分化。jagodzinski 等38对 7 个捐赠者的 bmscs 进行体外分离培养，并加载了 10

22、%、0.5 赫兹的牵张应变，观察 3 周的时间，结果显示在 1、2 和 3 周中成骨标志基因 runx2 都有明显的上升，同时骨钙素的表达也明显高于对照组，结论认为该大小的牵张应变有利于 bmscs 的成骨向分化。steinmetz 等39的研究中应用的是 15%、0.3hz 的牵张应变，14 天后发现对 bmscs 的成骨向分化有明显的抑制作用。综合以上的研究可以看出牵张应变的大小对 bmscs 的成骨向分化有一定的影响，较小的牵张应变可能更有助于成骨向分化。2.4微重力对 bmscs 成骨向分化的影响无论在体内还是体外，细胞都不可避免地会受到重力的作用，因此重力因素在 bmscs成骨向诱导

23、的过程中也起到不可或缺的作用，细胞微重力模拟加载装置通常为旋转培养体系。150155早在 20 世纪 hughes-fulford 等40就研究发现小鼠成骨细胞系在空间飞行中细胞数量减少。dai 等41研究发现通过回转模拟微重力效应可以抑制 bmscs 的增殖，细胞微丝骨架对微重力敏感，微重力下使 f-肌动蛋白发生改变并阻止细胞生长。zayzafoon 等42对 bmscs进行了 7 天的模拟微重力培养，结果认为微重力培养体系抑制了 bmscs 的成骨向分化。meyers 等43也对 bmscs 微重力条件下培养 7 天，证明了同样的结果，并认为细胞外信号调节激酶参与了调控。这些实验结果表明模

24、拟微重力效应抑制 bmscs 的成骨向分化，说明模拟微重力可能作用于干细胞水平，影响成骨细胞的数量和功能，导致成骨细胞缺乏必要的机械应力刺激作用，增殖受到抑制，骨形成减少。-4-2.5诱导 bmscs 成骨向分化的其他物理因素细胞生长环境的复杂化使得干细胞的分化受多种环境因素的影响，除了力学因素，超声160165170175180185190195200205波和脉冲电场等物理因素也会影响 bmscs 的成骨向分化。超声波对 bmscs 的影响与静水压处理细胞的原理类似，它的作用会使细胞产生一定程度的形变，从而对细胞施加一定的作用力。一般认为 25-35mw/cm2 的低强度超声波处理bmsc

25、s，有助于其成骨向分化，而强度在 30-200mw/cm2 的超声波则偏向于诱导 bmscs 的软骨向分化44。moinnes 等45对 bmscs 进行低强度超声处理，每 3 周超声刺激 20 分钟，结果显示低强度超声可加速 bmscs 的成骨向分化。王宝刚等46对 bmscs 施加 8.5kv、脉冲 120 次的工作电压，结果显示 45 分钟的刺激时 c-fos 与 c-jun 基因的表达达到峰值，并且检测到细胞向成骨向分化，认为该冲击波对 bmscs 成骨向分化的诱导可能与这两个基因的表达有关。赵敏等47在实验中用 12 赫兹、1.1mt 场强的脉冲电场刺激 bmscs 6 天，每天 8

26、小时，结果显示明显诱导了 bmscs 的成骨向分化。3 结论与展望综上所述，近年来的大量研究表明生物化学因素和物理因素体外可以影响 bmscs 向成骨细胞方向分化，但尚存在许多问题。目前该项研究的热点集中在理论层面上的 bmscs 细胞响应相关信号的机制，寻找参与分化调控的信号通路及通道蛋白分子等目标分子的研究；以及实验层面上的如何选择最佳的力学参数，从而最好地促进干细胞的成骨向分化等的研究，为 bmscs 在临床上的应用提供理论依据和参考；另外由于骨组织工程中有生物材料的参与，因此生物材料对 bmscs 成骨向分化的影响也成为该领域的又一热点问题；众所周知在体内细胞的生长受到多种环境因素的影

27、响，因此联合应用多种不同影响因素也许可以进一步提高 bmscs 向成骨细胞的定向分化效率。这些问题的解决需要组织工程技术及材料学、工程学和生物化学相关学科的发展和合作，进行更加深入细致的研究，为提高临床基于bmscs 的骨缺损治疗效果提供理论基础及优化方案。参考文献1 戴白云, 吴绍华. 骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞影响因子的研究进展 j. 泸州医学院学报 ,2010(4): 459-461.2 jianzhong wang, zhihong yu, kunzheng wang, et al. an experiment study of osteogenesis of ad-vegf16

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32、 d reveals c-myc as an enhancer ofbmp2-induced osteogenesisj. bone, 2010, 46(3): 613-627.8 i. d. platt, a. el-sohemy. regulation of osteoblast and adipocyte differentiation from human mesenchymalstem cells by conjugated linoleic acidj. j nutr biochem, 2009, 20(12): 956-964.9 j. k. chang, c. j. li, s

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34、rentiation of bone marrow derived human mesenchymal stem cellsj. differentiation, 2012, 84(2): 185-192.11 x. c. wan, c. p. liu, m. li, et al. staphylococcal enterotoxin c injection in combination with ascorbic acidpromotes the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteob

35、lasts in vitroj. biochem210215220225230235240245250255260265270biophys res commun, 2008, 373(4): 488-492.12 h. y. yoon, s. i. yun, b. y. kim, et al. poncirin promotes osteoblast differentiation but inhibits adipocytedifferentiation in mesenchymal stem cellsj. eur j pharmacol, 2011, 664(1-3): 54-59.1

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37、ion and boneformation in human mesenchymal stem cellsj. biochem biophys res commun, 2012, 418(4): 669-675.15 l. you, s. temiyasathit, p. lee, et al. osteocytes as mechanosensors in the inhibition of bone resorption dueto mechanical loadingj. bone, 2008, 42(1): 172-179.16 dubose k. bailey, m. zayzafo

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