流式细胞检测技术讲座

1、流式细胞技术原理及其在临床流式细胞技术原理及其在临床&科研中的应用科研中的应用（Flow Cytometry, FCM)北京利文商贸有限责任公司李建廷主要内容主要内容z 流式细胞技术概念z 流式细胞技术原理z 流式实验的设计z 流式细胞技术在临床&科研上的应用流式细胞技术概述流式细胞技术概述z 流式细胞技术的概念z 流式细胞技术的特点z 流式细胞仪的检测范围z BD公司流式细胞仪z 流式细胞仪的结构什么是什么是 FCM ？z 流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术z 激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化

2、学技术+单克隆抗体技术FCM的特点的特点z 测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞z 可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量z 具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况z 高分辨率(CVPEPerCP-Cy5.5FITCPerCP z 4. 抗原密度 z 高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原（如细胞因子）则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。z 如血小板活化检测试剂：z PAC-1-FITC/CD62P-PE/CD61-PerCP 荧光抗体组合的选择荧光抗

3、体组合的选择z 5. 荧光光谱之间的重叠z 在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠的影响，但使用荧光探针的种类越多，补偿的复杂程度增加，因此选择光谱重叠越少的组合越好z 6. 自发荧光z 每个细胞群体的自发荧光水平都不同，自发荧光在高波长范围里（600nm）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC），可得到较好的S/N比z 7. 荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性/ 假阳性结果z 一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。尽量选择同一家公司的试剂可以减少干扰

4、。 常用荧光染料组合常用荧光染料组合z FITCPE：最常用的双色组合z FITCPEPerCP：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小，但PerCP光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上，如CD4/8/3z FITCPEPerCP+APC：最常用的四色组合，一般PE和APC用于检测表达较低的抗原上，而FITC和PerCP用于检测表达较高的抗原上，如CD3/8/45/4z PerCP-Cy5.5与PE之间的重合光谱范围很小，也可用于四色组合z PE-Cy7可与FITC、PE、APC标记的抗体一同使用，荧光补偿小z PE-Cy5可与FITC、PE同时使用，但不能与A

5、PC同时使用，二者之间荧光干扰太大z PE-Texas Red尽量不与PE同时使用，二者之间荧光补偿非常大z 临床上常见的流式检测项目，所需的试剂组合基本都有参考或推荐的抗体组合，如：z 血小板活化检测：z 造血干细胞计数：z z 但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止尚没有统一的抗体组合常用单抗组合常用单抗组合荧光抗体PEFITC或PerCP对照管IgG1CD45试验管CD34CD45荧光抗体FITCPEPerCP对照管PAC-1+RGDSIgG1CD61试验管PAC-1CD62PCD61小结小结z 单细胞悬液（组织分离过200目滤网，上机前过300-400目滤网）z 尽可能减少死细胞（比例根据实验决定，一般5%）z 染色前细胞计数每管细胞数为106，体积0.5-1mLz 根据抗原特性及实验目的选择抗体组合z 设补偿对照和