谷氨酸生产工艺

1、第一部分 实验目的一掌握谷氨酸发酵的操作原理：谷氨酸的生物合成途径、生物合成的调节机制、发酵条件对发酵过程影响的机制及其调控等。二掌握并实践利用生物发酵生产氨基酸的一般工艺流程、发酵生产过程中的基本操作。三熟悉各种实验仪器的基本原理并掌握其操作方法。四熟练掌握各项基本实验操作技能，并了解其应用原理。 第二部分 谷氨酸发酵的原理操作一、谷氨酸的生物合成途径： 谷氨酸的生物合成主要包括糖酵解途径（emp）、磷酸乙糖途径（hmp途径）、三羧酸循环（tca环）、乙醛酸循环、伍德沃克曼反应（co2的固定反应等）。 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径为：氧化还原共轭的氨基化反应co2co2谷氨酸nadphnad

2、ph-酮戊二酸葡萄糖异柠檬酸emp（为主）2丙酮酸柠檬酸乙酰coa草酰乙酸 苹果酸nh3hmp（约占26%）nadpnadphmp（约占26%） 在谷氨酸发酵时，糖酵解经过emp及hmp两个途径进行，生物素充足菌hmp所占的比例是38%，控制生物素亚适量，发酵产酸期，emp所占的比例更大，hmp所占的比例约为26%，生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰coa，一部分固定co2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰coa在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，再经氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。由于三羧酸循环中的缺陷，即丧失-酮戊二酸脱氢酶的氧化能力或氧化能力微弱，谷氨酸生产菌采用乙醛酸循环途

3、径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等，因此，对异柠檬酸的两种竞争性反应是很重要的。在发酵的菌体生长期，为了获得能量和产生生物合成反应所需的中间产物，需要异柠檬酸裂解酶反应，走乙醛酸途径；在谷氨酸生产期，最好没有异柠檬酸裂解酶反应，封闭乙醛酸循环。这就说明，再谷氨酸发酵中，菌体生长期和谷氨酸生产积累期的最适条件是不一样的。谷氨酸产生糖代谢的一个重要特征就是-酮戊二酸氧化能力微弱。在铵离子存在下，-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。谷氨酸生产菌的谷氨酸脱氢酶活性都很强，这种每以nadp为专一性辅酶，谷氨酸发酵的氨同化过程，是通过连接nadp的l-谷氨酸脱

4、氢酶催化完成的。在铵离子存在下谷氨酸脱氢酶与异柠檬酸脱氢酶紧密偶联起来，形成强的氧化还原共轭体系，使-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。若铵离子进一步过剩，发酵液偏酸性，ph在5.56.5，谷氨酸进一步生成谷氨酰胺。二发酵过程主要变化及中间代谢控制 建立发酵过程的各种监控系统，对于发现和分析过程中出现的问题，及时对发酵的方向加以控制是高产和稳定的重要条件。为此我们必须了解：（1）.在短的间隔时间内过程所处的状态，（2）.微生物怎样适应环境条件的变化。即我们需要一种控制发酵的模型。 发酵过程主要变化规律及中间代谢控制的方法如下：a适应期发酵初期，菌体长大，但没有分裂，糖等基质基本不消耗，ph稍有上升

5、是由于尿素分解放出氨气所致。b对数生长期 菌体开始繁殖，代谢逐渐旺盛。个体生长和群体繁殖交替进行，菌体形态和二级种子相同，绝大多数为e型分裂。耗糖速度逐渐加快，尿素被尿酶分解放出氨使ph上升，然后被菌体利又使ph下降，这时必须及时添加尿素来补充氮源和调整ph值，此阶段一般为3-10hc转化期 在生物素限量的情况下部分菌体体内生物素含量由丰富转向贫乏，使部分菌停止繁殖，在条件适宜时开始伸长膨胀，形成生产型细胞，开始积累谷氨酸，这是菌体有增殖型向生产型转化的时期，在此时期中菌体数量达到最大值，v字型和伸长膨大型菌同时存在。 这是代谢最旺盛阶段耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快。并接近最大值

6、.对发酵控制来说，此时期以前的控制是发酵成败的关键，此时期的变化受生物素的明显影响，当生物素过量时，没有明显的转化期，菌体形态为粗状，短胖，类似粽子培养的菌型，耗糖快，耗脲快，产酸低，若生物素太少，菌的数量不足，耗糖慢产酸低，周期长d产酸期 菌体完成又正值期向生产期转化后，菌体都伸长膨大像花生，大量累积谷氨酸，耗糖与产酸相适应，产酸大最大值，对糖转化率达50-60%，应继续流加尿素，保证有充足的氮源，ph值维持7.0-7.2。为加快产酸速率适当提高温度，一般为36-37摄氏度。根据菌体的体积耗氧速率继续供氧，在正常的发酵情况下，这一时期中发酵已定局，容易控制。随着发酵时间的延长，糖已逐渐耗尽,

7、产酸增加，菌体活力逐渐降低。流加尿素以少量为好，控制ph值6。8-7。0。当残糖降到1%，根据发酵情况，可将风量降到最低，促进中间产物转化成谷氨酸，这时就可以开始提取谷氨酸了。次倍增期间，开始出现异常形态的细胞；发酵后期，常出现类似花生状的有横膈膜的多节细胞，菌体形状基本清楚，谷氨酸高产。倘若生物素过量，就会只长菌不产酸或长菌好产酸低。三 、谷氨酸发酵过程中的检测原理（1）氨基酸检测茚三酮法茚三酮反应原理 茚三酮在弱酸溶液中，与氨基酸反应，进行脱氨氧化的脱羧反应其反应物呈蓝色，可用作比色复写，或在纸层析上显色。所生成的co2 也可用于气体分析法进行定量。步骤：混匀 样品稀释100倍取1ml +

8、 茚三酮1ml沸水浴20min定容至10ml 梯度标样配制515nm测光度（2）还原糖检测dns法dns反应原理 还原糖的测定是生化分析中常做的项目，最方便的方法是分光光度法。在碱性条件下，显色剂dns与还原糖共热后被还原成红棕色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与显色后溶液的颜色强度成比例关系，因此可用分光光度法测定样品中还原糖的含量。步骤：样品稀释1000倍取1ml + dns 1ml沸水浴5min定容至10ml梯度标样配制520nm测吸光度（3）革兰氏染色 一种传统的菌体染色方法，可更清楚的观色菌体形态及结构程序：涂片干燥加热固定冷却结晶紫初染碘液媒染酒精脱色番红复染干燥镜检1涂片 固定

9、 取干净载玻片一张放在染色架上， 滴发酵液一滴，干燥加热固定2染色 待涂片冷却后，滴结晶紫染色1分钟，水洗；碘液媒染1分钟，水洗；95%的酒精脱色，20-30秒（严格控制时间）；番红复染2-3分，水洗；干燥。第三部分 材料和仪器一、实验材料（1） 菌种：谷氨酸发酵棒杆菌（2） 试剂蛋白胨nacl琼脂粉 葡萄糖尿素 k2hpo4 mgso47h2okcl 酵母膏 牛肉膏 活性炭粉 feso4.7h2o cacl2（无水）3，5-二硝基水杨酸（dns） 酒石酸钾钠 二甲苯95%乙醇 na2hpo 茚三酮 盐酸mgso47h2o k2hpo4na2hpo4feso4 ,二、实验器材 可见分光光度计紫

10、外分光光度计恒温水浴锅恒温水箱恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅无菌超净工作台电动离心机ph计广泛试纸电炉电子天平吸尔球光学显微镜洗瓶玻璃器皿三角瓶烧杯试管具塞刻度试管培养皿移液管胶头滴管容量瓶量筒第四部分 试验过程一培养基的制备一、级种子培养基配方：（50ml）1尿素：0.54g2磷酸氢二钾：0.05g3葡萄糖：1.250g4七水合硫酸镁：0.02g5牛肉膏：0. 5g6 酵母膏：0.05g发酵培养基配方：（500ml）1尿素：4.841g2葡萄糖：50.1g3氯化钾：0.251g4七水合硫酸镁：0.302g5磷酸氢二钠：0.851g6酵母膏：0.5g7微量元素：5ml（七水合硫酸铁，硫酸镁，

11、二水合氯化钙）发酵培养基用1000ml锥形瓶装液500ml，酵母膏调节ph为3-4单独灭菌。培养基均为高温灭菌，灭菌温度为121摄氏度，30min。二谷氨酸和葡萄糖的标准曲线（一）谷氨酸标准曲线制作：。取7支10ml具塞刻度试管，编号，分别加入标准谷氨酸溶液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，再加入茚三酮各1ml，沸水浴20min，冷却以后蒸馏水稀释至10ml，在570nm下比色，以谷氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。浓度00.10.30.50.70.91比色值00.5240.7441.0611.2871.4011.423谷氨酸浓度单位：0.1m

12、g/ml标准公式y=1.724x（二）葡萄糖标准曲线制作：从三角瓶中用具塞刻度试管取发酵液1ml，注意无菌操作，以10倍比稀释100倍，另取一个具塞刻度试管（10ml）,加入1ml稀释液，1mldns，沸水浴5min，在比色仪下以520nm比色，记录吸收度值，并在标准曲线下求出葡萄糖浓度浓度00.10.30.50.70.91比色值00.0920.3090.4520.5750.6140.624葡萄糖浓度单位：0.1mg/ml标准公式y=0.769x三、发酵过程的监控发酵过程中的ph值控制在7.27.4之间。摇床的转速120r/min时间谷氨酸比色值谷氨酸浓度葡萄糖比色值葡萄糖浓度葡萄糖浓度显微镜

13、观察结果备注1.1 23：000.0660.038283060.0486666670.063285650.06328565接种一级培养基1.2 11：300.0686666670.039829850.2273333330.295622020.29562202取出一级培养基液加入发酵液培养18:000.1103333330.063998450.3793333330.493281310.49328131菌体较小密度不大22:000.1620.0939675170.3750.4876462940.487646294菌提较小密度增加1.3 8：350.3140.1821345710.230333333

14、0.299523190.29952319杆状 长度（5、4、5、5、6、6）含有少量杂菌14:550.3250.1885150810.1880.2444733420.244473342 杆状 长度（4、8、7、5、5.55、6、5.5、8.7）杂菌含量增多 杂菌较小且运动较快18:250.4663333330.2704949730.1190.1547464240.154746424长度（7、6、6.8、6、7、7、）19：15向培养液中加入15克葡萄糖22:300.4683333330.271655060.525250.68302990.68302991.4 10：350.4770.27668

15、2130.236250.307217160.3072171614:550.3420.198375870.2150.2795838750.27958387519:100.9456666670.5485305490.1490.1937581270.1937581270.5630.3265661250.0760.0988296490.09882964921:500.4363333330.2530935810.3920.5097529260.5097529260.4096666670.2376256770.4066666670.5288253140.5288253140.3670.212877030.

16、4090.5318595580.5318595581.5 10:150.4740.2749419950.2593333330.3372345040.33723450421：25菌液灭菌 121 30min0.4186666670.2428460940.2506666670.3259644560.32596445622:200.3440.1995359630.1436666670.1868227130.1868227130.3360.1948955920.1276666670.1660164720.1660164720.4696666670.2724284610.1026666670.1335067190.133506719葡萄糖浓度变化值图示如上谷氨酸浓度变化图示如上四.谷氨酸的提取（1）将500ml发酵液