免疫金标记技术(研究生讲义)

1、1免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 2免疫技术试剂标本AgAbAbAg3标记免疫技术试剂标本Ag*AbAb*Ag放射性核素荧光素酶化学发光剂胶体金标记物标记物技术技术放射性核素放射性核素放射免疫技术放射免疫技术荧光素荧光素荧光免疫技术荧光免疫技术酶酶酶免疫技术酶免疫技术化学发光剂化学发光剂化学发光免疫技术化学发光免疫技术胶体金胶体金金免疫技术金免疫技术4金免疫测定技术 金免疫组织化学染色技术 金免疫技术金免疫技术斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验金免疫层析试验金免疫层析试验金免疫光镜染色技术金免疫光镜染色技术金免疫电镜染色技术金免疫电

2、镜染色技术5简介简介 胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜显微镜下可下可见黑褐色颗粒；见黑褐色颗粒； 当这些标记物在相应的标记处大量聚集当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在时，可在载体膜上载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红呈现肉眼可见红色或粉红色斑点色斑点(线线); 从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。金免疫组织化金免疫组织化学染色技术学染色技术金免疫测定技金免疫测定技术术67制备制备胶体金胶体金制备制备免疫金免疫金建立建立金免疫测金免疫测定技术定技术8胶体金的特

3、性n胶体金（金溶胶）：是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。n胶体金的特性胶体性质胶体性质：稳定性、对电解质的敏感性光吸收性光吸收性和呈色性呈色性：胶体金的光吸收峰波长随颗粒的大小而变化。稳定性稳定性：影响因素-电解质、溶胶浓度、温度、稳定剂9呈色性不同大小的胶体金呈现不同的颜色不同大小的胶体金呈现不同的颜色 小颗粒-橙黄色 中等颗粒酒红色 较大颗粒深红色 大颗粒紫色 10胶体性质稳定性稳定性：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮于液体中111柠檬酸三钠 加 入 量（ml）*胶体金特性 max 呈色162.00 橙色518nm24.51.50 橙红522nm411.00 红色525nm71.

4、50.70 紫色535nm胶体金粒径（nm）12胶体金的制备v化学还原法:向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子,形成金颗粒悬液。v还原材料：氯金酸（HAuCl4)v还原剂：枸橼酸盐、白磷、硼氢化钠、维生素C。v最常用的制备方法：枸橼酸盐还原法 13v 操作要点 配配HAuC4水溶液水溶液 加热加热 沸沸 枸橼酸三钠枸橼酸三钠 搅动搅动 加热加热 沸（约沸（约23min*）冷却冷却 加蒸馏水至加蒸馏水至 原体积原体积 * 见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后见淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后 很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定

5、成红色。成红色。通过改变枸橼酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒通过改变枸橼酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒14v制备胶体金的注意事项（1）玻璃容器必须是 最好是经硅 化处理的。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性（3）氯金酸易潮解（4）制备胶体金应用 或者是 高质量的去离子水。 ，不应使用金属药匙称量氯金酸。，不应使用金属药匙称量氯金酸。双蒸双蒸/三蒸馏水，三蒸馏水，绝对清洁的，绝对清洁的，应干燥、避光保存。，应干燥、避光保存。15胶体金的鉴定和保存鉴定1、清亮透明2、金颗粒的大小通过观察胶体金的颜色，粗略估计金颗粒的大小；分光光度计扫描max来估计金颗粒的粒径电镜观察保存保存于洁净的玻璃器

6、皿中，室温或4C，加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利于保存。16优优 质质劣劣 质质17免疫金的特性用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物免疫金复合物，或简称免疫免疫金金（immunogold）。）。胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探金探针针。物理吸附性物理吸附性： - - - - - - - + + + + + + + +胶体金蛋白质18免疫金的制备n制备要点PH值的调整：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱 蛋白质最适标记量的确定标记过程离心纯化：超速离心

7、法 免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存 ：稳定剂-PEG，BSA19n待标记蛋白作系列稀释+定量胶体金+Nacln最适标记量：能保持红色不变而蛋白含量最低的一管蛋白量逐渐减低蛋白量逐渐减低对照管对照管20金免疫测定技术金免疫测定技术 固相膜免疫测定技术固相膜免疫测定技术固相载体固相载体：硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜标志物：胶体金标志物：胶体金斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验（ dot immunogold filtration assay,DIGFA ），又称为滴金免），又称为滴金免疫测定法疫测定法金免疫层析试验金免疫层析试验 （ goldimmunochromatographic assay

8、,GICA ） 21斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay,DIGFA)操作示意图操作示意图装置分解图装置分解图盖盖微孔膜微孔膜吸水垫料吸水垫料底底加标本 免疫金 洗涤液22技术类型：夹心法、间接法双抗体夹心法23间接法间接法24质控n双抗体夹心法：相应抗原n间接法：反应斑点质控点人IgG25反应线质控线阳性阳性阴性阴性26操作技术要点AB27金免疫层析试验金免疫层析试验（goldimmunochromatographic assay, GICA)GTC28 夹心法夹心法 竞争法竞争法(抑制法）抑制法） 间接法间接法金免疫层析试验金

9、免疫层析试验（ goldimmunochromatographic assay,GICA )双抗原夹心法双抗原夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法29双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：特异性抗体 吸水纸标本标本阳性结果阳性结果30竞争法标本标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原 吸水纸阳性结果阳性结果31标本标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原 吸水纸阴性结果阴性结果32间接法反流免疫层析法反流免疫层析法合上检测盒合上检测盒窗窗(B)吸水材料吸水材料(A)(A)金标抗人金标抗人IgG(GIgG(G0 0) )吸水材料吸水材

10、料(D)(D)吸水材料吸水材料(F)(F)标本加样区标本加样区(E)(E)包被抗原（包被抗原（T T）标记线标记线(G)(G)液体流动方向液体流动方向包被抗抗体（包被抗抗体（C C）33标本标本CTCT闭合前闭合前闭合后闭合后E阳性结果阳性结果34CT35DIGFA与GICA的比较DIGFA （穿透滤过型）（穿透滤过型）GICA （横向流动型）（横向流动型）硝酸纤维素膜的种类圆片膜圆片膜窄长型膜窄长型膜试剂形式渗滤装置及渗滤装置及2瓶液体瓶液体试剂（液相形式试剂（液相形式 ）单一试剂条单一试剂条(板板)（固相形式（固相形式 ）操作步骤31观察时间操作结束操作结束(约约3min)即即刻观察刻观察

11、操作结束后操作结束后等待等待3-20min36IFA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 横流（横流（LATERAL FLOWLATERAL FLOW）37免疫金标记技术的优势示踪剂：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记自带质控对照简便、快速：全部检测过程仅需 3-20分钟。可单份检测稳定性好38免疫金标记技术的劣势n灵敏度不如酶标技术n一般作为定性，不易定量。 金标法在临床中的应用实例实例1：HBsAg的检测的检测实例实例2：HCG的检测的检测39金免疫组织化学技术n一、免疫金（银）光镜染色技术n二、免疫金电镜染色技术40n 免疫金银染色原理示意图免疫金银染色原理示意图4142HBsAg诊断试剂诊断试剂试剂盒参考图示 43操作操作步骤步骤1：洗净双手：洗净双手 步骤步骤2：用采血针采指尖血：用采血针采指尖血 步骤步骤3：将：将1滴指尖滴指尖血滴入加样孔血滴入加样孔 ，或或者用吸管将者用吸管将1滴指尖滴指尖血滴入加样孔血滴入加样孔44步骤步骤4：立即加：立即加1-2滴缓冲液滴缓冲液 步骤步骤5：15分