生物制品的制备详解

1、一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （1 1）原料选择）原料选择v原料的选择原则原料的选择原则： 有效成分有效成分含量高含量高，新鲜；，新鲜； 原料来源原料来源丰富丰富，产地较近；，产地较近； 原料中原料中杂质含量少杂质含量少； 原料原料成本低成本低等。等。 第一节第一节 一般生物制品的制备方法一般生物制品的制备方法 植物原料生长的季节性；植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期；微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别。动物原料的年龄与性别。原料的选择注意事项：原料的选择注意事项：动物原料动物原料：采集后要立即处理，去除结：采集后要立即处理，

2、去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻冷冻贮存。贮存。植物原料植物原料：要择时采集并就地去除不用：要择时采集并就地去除不用的部分，的部分，保鲜保鲜处理；处理；微生物原料微生物原料：要及时将菌细胞与培养液：要及时将菌细胞与培养液分开，进行分开，进行保鲜保鲜处理。处理。 v（2 2）原料的预处理：）原料的预处理：冷冻法冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用。该方法适用于所有生物原料。常用-40-40速冻。速冻。有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏

3、作用的原料，如脑垂体等。性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。防腐剂保鲜防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。于液体原料，如发酵液、提取液等。 v原料的保存方法：原料的保存方法：生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。的。 二、生物制品的提取二、生物制品的提取v 定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏来破坏细胞壁细胞壁或或细胞

4、膜细胞膜v目的：目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。获得有效的提取。l细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度l动物细胞动物细胞: 多分泌到细胞外培养液多分泌到细胞外培养液l植物细胞植物细胞: 多为胞内产物多为胞内产物l微生物（细菌微生物（细菌/真菌）真菌）: 胞内、胞外胞内、胞外 v对于胞内产物需要进行细胞破碎。对于胞内产物需要进行细胞破碎。(胞外：大多数情况下，胞外：大多数情况下

5、，抗生素，胞外酶抗生素，胞外酶，一些，一些多糖，及氨基酸多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。等目标产物存在于发酵液中。(胞内：有些目标产物存在于生物体中。胞内：有些目标产物存在于生物体中。l尤其是由基因工程菌产生的大多数尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质蛋白质是是在细胞内沉积。在细胞内沉积。l脂类脂类物质和一些物质和一些抗生素抗生素包含在生物体中。包含在生物体中。细胞破碎方法细胞破碎方法机械破碎法机械破碎法物理破碎法物理破碎法化学破碎法化学破碎法酶学破碎法酶学破碎法l通过机械运动所产生的通过机械运动所产生的剪切力剪切力的作用，的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。使细胞破碎的方法称为机

6、械破碎法。常用的仪器常用的仪器高速组织捣碎机高速组织捣碎机匀浆器匀浆器研磨器研磨器l通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。方法，统称为物理破碎方法。l物理破碎方法多用于物理破碎方法多用于微生物细胞微生物细胞的破碎。的破碎。物理破碎法物理破碎法温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法l化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。l常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂常用的化学

7、试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。两大类。l十二烷基硫酸钠：十二烷基硫酸钠：SDSl酶学破碎方法：酶学破碎方法：利用利用溶解细胞壁溶解细胞壁的酶的酶( (外加的或细胞本身存在的外加的或细胞本身存在的酶酶) )处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜等方法破坏细胞膜l分为：外加酶制剂和自溶法。分为：外加酶制剂和自溶法。l 自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细在微生物代谢过程中，大多数

8、都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。以达到自溶目的。l缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。粘度增大，过滤速度下降。（2 2）提取（）提取（extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活

9、性物质的性质，时，首先要根据活性物质的性质， 选择提取试剂选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。酮等）。 考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。时间。 注意提取的温度、注意提取的温度、pHpH、变性剂等因素。、变性剂等因素。 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： 1.1.沉淀法沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体

10、颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶盐析法、有机溶剂沉淀法剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等电点沉淀法、选择性沉淀法等。等。 2. 超滤法和透析法、凝胶层析法、超速离心法超滤法和透析法、凝胶层析法、超速离心法等：等：按分子按分子大小分离的方法大小分离的方法。第二节第二节 各类生物制品的分离纯化方法各类生物制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化方法3.3.离子交换层析、电泳法、等电点聚焦法离子交换层析、电泳法、等电点聚焦法等等是按分子所带电荷进行分离的方法，是按分子所带电荷进行分离的方法，氨基酸、多肽、蛋

11、白氨基酸、多肽、蛋白质、酶均具有质、酶均具有等电点等电点，在离开等电点的，在离开等电点的pHpH时便会带正或负时便会带正或负电荷。电荷。4. 亲和层析法亲和层析法大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。分离

12、方法之一。v核酸类药物生产方法主要有核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法提取法和发酵法。提取法提取法生产生产DNADNA和和RNARNA，先提取核酸和蛋白质先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离，然后分离RNARNA与与DNADNA。发酵法发酵法主要用于生产主要用于生产单核苷酸。二、核酸类制品的分离纯化方法二、核酸类制品的分离纯化方法v基因工程产物的特点：基因工程产物的特点：1.产物大多数处于细产物大多数处于细胞内胞内，需进行细胞破碎，需进行细胞破碎2.产物产物浓度较低浓度较低，杂质多杂质多，提纯困难，提纯困难3.产物多是大分子蛋白质，通常产物多是大

13、分子蛋白质，通常不稳定不稳定，易失活，易失活第三节第三节 基因工程制品的分离纯化方法基因工程制品的分离纯化方法P79 NP981. 含目的产物的起始物料的特点含目的产物的起始物料的特点菌种类型及其代谢特性。菌种类型及其代谢特性。原材料和培养基的来源及其质量；原材料和培养基的来源及其质量；生产工艺和条件。生产工艺和条件。初始物料的物理、化学和生物学特性。初始物料的物理、化学和生物学特性。2. 目的产物的表达特性。目的产物的表达特性。3. 目的产物本身的分子特性。目的产物本身的分子特性。4. 目的产物的用途和需求量。目的产物的用途和需求量。一、影响分离纯化工艺设计的主要因素（一、影响分离纯化工艺设

14、计的主要因素（P79，NP98）分离纯化的基本过程分离纯化的基本过程分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；低，杂质含量却很高；另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。分离纯化一般不应超过分离纯化一般不应超过4 45 5个步骤个步骤，包括细胞破碎，包括细胞破碎 、固液

15、分离、浓缩与、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。及成品加工。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品一般制品分离纯化的一般流程一般制品分离纯化的一般流程1 1、根据产物表达形式来选择、根据产物表达形式来选择v 分泌型表达产物分泌型表达产物：发酵液的体积很大、但目标产物浓度较低：发酵液的体积很大、但目标产物浓度较低，必须在纯化前进行，必须在纯化前进行浓缩浓缩，可用，可用沉淀和超滤沉淀和超滤的方法浓缩。的方法浓缩。v 产物在产物在周质表达：周质表达： 为了获得为了获得周质蛋

16、白周质蛋白，E.coli经低浓度溶经低浓度溶菌酶处理后，可采用菌酶处理后，可采用渗透压裂解渗透压裂解的方法来获得，能够回收到的方法来获得，能够回收到高质量的产物。高质量的产物。v 可溶性表达产物：可溶性表达产物：破菌后的细胞上清，首选破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，一般先用离子交换色谱一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。换分离能去掉大部分的杂质。二、选择分离纯化方法的依据二、选择分离纯化方法的依据 P8

17、0 P80，9999应选择不同机制的分离单元来组成一应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手段，手段，先将含量最多的杂质分离去除，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。后阶段。2 2、根据分离单元之间的衔接选择、根据分离单元之间的衔接选择v分离单元之间的链接：分离单元之间的链接：8080，100100v先选用先选用非特异非特异、低分辨低分辨的操作单元（如的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主

18、要的杂质（包积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；括非蛋白类杂质）；v随后采用随后采用高分辨率高分辨率的操作单元（如具有的操作单元（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；v凝胶排阻色谱这类分离凝胶排阻色谱这类分离规模小规模小、分离速分离速度慢度慢的操作单元放在最后。的操作单元放在最后。 分离纯化工艺应遵循以下原则：分离纯化工艺应遵循以下原则：（1 1）工艺条件应）工艺条件应温和温和，具有良好的，具有良好的稳定性和稳定性和重复性重复性：不受或少受发酵工艺、条件及原材料：不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，在任何环境下使用都应具有重

19、复来源的影响，在任何环境下使用都应具有重复性，明确需严格控制的步骤和技术性，明确需严格控制的步骤和技术（2 2）尽可能）尽可能减少减少组成工艺的组成工艺的步骤步骤：步骤越多：步骤越多，产品的后处理收率越低，但必须保证产品的，产品的后处理收率越低，但必须保证产品的质量质量3 3、根据分离纯化工艺的要求来选择、根据分离纯化工艺的要求来选择（3 3）组成工艺的各技术或步骤之间要）组成工艺的各技术或步骤之间要相互相互适应和协调适应和协调（4 4）在工艺过程中要）在工艺过程中要尽可能少用试剂尽可能少用试剂，以，以免增加步骤，或干扰产品质量免增加步骤，或干扰产品质量（5 5）时间要尽可能短时间要尽可能短，

20、因稳定性差的产物，因稳定性差的产物随工艺时间增加，生物活性收率会降低，产品随工艺时间增加，生物活性收率会降低，产品质量会下降质量会下降（6 6）必须）必须高效、收率高、易操作高效、收率高、易操作，对设备，对设备条件要求低，能耗低条件要求低，能耗低（7 7）具有较高的）具有较高的安全性安全性：药品必须保证安：药品必须保证安全、无菌、无热原、无污染全、无菌、无热原、无污染v（一）（一） 细胞内不溶性产物细胞内不溶性产物包含体（或包涵体）包含体（或包涵体）大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形式不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物产生并聚集形成蛋白质

21、聚合物包含体包含体v以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结构，以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，因此表达蛋白不具有生物活性，因此在纯化过程中必须在纯化过程中必须溶解溶解包含包含体并对表达蛋白进行体并对表达蛋白进行复性复性。步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离v分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以前进行在纯化以前进行浓缩浓缩

22、v浓缩方法包括：浓缩方法包括：沉淀、超滤沉淀、超滤可获得高纯度、高活性的目的蛋白质可获得高纯度、高活性的目的蛋白质v周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。纯化。为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用后，一般用渗透压裂解法渗透压裂解法获取。获取。由于周质中的蛋白仅有为数

23、不多的几种分泌蛋白，同时由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白产物。白产物。 分离纯化主要依赖色谱分离方法。该法是分离纯化主要依赖色谱分离方法。该法是设备简单，便于自动化控制和分离过程中无设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。色谱、高压液相色谱等。选择纯化方法尤其重要的根据是表面性质选择纯化方法尤其重要的

24、根据是表面性质的差异。的差异。一、原材料的质量检测与控制一、原材料的质量检测与控制v原材料的质量控制是要确保编码生物制品的原材料的质量控制是要确保编码生物制品的DNADNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全保证产品质量的安全性和一致性。性和一致性。 第四节第四节 生物制品的质量检测与控制生物制品的质量检测与控制P90P90，111111 在工程菌菌种贮存中，要求在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的在培养过程中，要求工程菌所含的重组质粒稳定重组质

25、粒稳定，始终无突变；，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌在重复生产发酵中，工程菌表达稳定表达稳定；始终能排；始终能排除外源微生物污染。除外源微生物污染。二、培养过程的质量控制二、培养过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据，产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持确证提纯物分子批间保持一致性一致性；外源蛋白；外源蛋白质、质、DNADNA与热原质都控制在规定限度以下。与热原质都控制在规定限度以下。三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制1 1、产品的鉴别、产品的鉴别2 2、纯度分析、纯度分析（1）目的蛋白质含量测定：）目的蛋白质含量测定：SDS-PAGE、

26、等电点、等电点聚焦、聚焦、HPLC、毛细管电泳等。、毛细管电泳等。（2）杂质：）杂质： 蛋白类杂质蛋白类杂质 非蛋白类杂质。非蛋白类杂质。3 3、生物活性测定、生物活性测定4 4、安全性评价、安全性评价5. 5. 稳定性检测稳定性检测6 6、产品一致性的保证、产品一致性的保证四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制P93,NP114重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法电泳方法：电泳方法：SDS-PAGESDS-PAGE，等电点聚焦，免疫电泳，等电点聚焦，免疫电泳免疫学分析方法：放免法，放射性免疫扩散法免疫学分析方法：放免法，放射性免疫扩散法酶联免疫吸附法，免疫印

27、渍酶联免疫吸附法，免疫印渍受体结合试验受体结合试验各种高效液相分析法各种高效液相分析法肽图分析法肽图分析法Edman NEdman N末端序列分析法末端序列分析法圆二色谱圆二色谱核磁共振核磁共振v1 1、液态保存、液态保存v（1 1）低温保存低温保存：液态蛋白质样品在：液态蛋白质样品在-10-10-20-20以下冰冻保存比较理想。以下冰冻保存比较理想。v（2 2）超低温保存：超低温保存：液氮液氮超低温保藏超低温保藏v（3 3）在稳定在稳定pHpH条件下保存条件下保存：蛋白质较稳：蛋白质较稳定的定的pHpH一般在一般在等电点等电点，因而保存液态蛋白，因而保存液态蛋白质样品时，调到其稳定的质样品时

28、，调到其稳定的pHpH范围内。范围内。第五节第五节 生物制品的保存与运输生物制品的保存与运输 P97,NP118P97,NP118v（4 4）高浓度保存高浓度保存：一般蛋白质在高：一般蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，这是因为液态蛋浓度溶液中比较稳定，这是因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，保存时浓白质容易受水化作用的影响，保存时浓度不能太低，否则可能引起亚基解离和度不能太低，否则可能引起亚基解离和表面变性。表面变性。v（5 5）加保护剂保存加保护剂保存：加入某些稳定：加入某些稳定剂可以降低蛋白质溶液的极性，以免变剂可以降低蛋白质溶液的极性，以免变性失活。性失活。v一般蛋白质一般蛋白质含水量超过含

29、水量超过10%10%时容易失活时容易失活。含水量降到含水量降到5%5%时，在室温或冰箱中保存均时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，在比较稳定，在干燥器干燥器中在中在44以下以下可保存相可保存相当长的时间。当长的时间。2 2、固态保存、固态保存 植物原料生长的季节性；植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期；微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别。动物原料的年龄与性别。原料的选择注意事项：原料的选择注意事项：(胞外：大多数情况下，胞外：大多数情况下，抗生素，胞外酶抗生素，胞外酶，一些，一些多糖，及氨基酸多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。等目标产物存在于发酵液中。(胞内：有些目标产物存在于生物体中。胞内：有些目标产物存在于生物体中。l尤其是由基因工程菌产生的大多数尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质蛋白质是是在细胞内沉积。在细胞内沉积。l脂类脂类物质和一些物质和一些抗生素抗生素包含在生物体中。包含在生物体中。v基因工程产物的特点：基因工程产物