实验二蛋白质分子量的测定

1、实验二 蛋白质分子量的测定凝胶层析法一、原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同的进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开来一样。但是这种“过筛”与普通过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸，使充分洗液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而言凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，而使样品分子不同的分子得到分离。凝胶室又叫退溶液凝结而成的固体物质，不论是天然还是人工合成凝胶，他们的内部都具有很

2、多和微细的多孔网状机构，凝胶层析法常用天然凝胶是琼脂凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，和葡萄糖凝胶，具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，起孔隙代销与被分离物质分子的大小有相似的数量级，在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只能有相应的小分子可以通过，适用于分离小物质。相反，交联度低的孔隙大，适用于分离大分子的物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装在柱子里，柱床体积称为总体积，以Vt表示。实质上Vt是由Vo、Vi与Vg三部分组成，既Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为孔隙体积或者外体积，又称为外水体积，即存在于柱床内

3、凝胶克里外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内部流动相的体积；Vi为内部体积，济宁叫颗粒内部所含水相的体积，因此Vt-Vo=Vi+Vg脱洗体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式子中的Ve为脱水体积，自加入样品时算起，到祖坟最大浓度出现时候流出的体积，Kd为样品组分在二相间的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，与柱的长短粗细无关，也就是说他对每一个物质为常数。与柱的物理条件无关。Kd可以通过实验室求得。上式子可改写成： Kd=（Ve-Vo)/Vi，Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd

4、可以有下列几种情况：1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和 。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、当0<Kd<1时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化。4、有时Kd&

5、gt;1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在Sephadx G-25中德Kd值分别为1.2，1.4和2.2。在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g·WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一

6、个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：已知 Kd= Ve-VoVi， Vt-Vo代替Vi，则：Kav=Ve-Vo/Vt-Vo 即 Va=Vo+Kav(Vt-Vo)在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流动Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，只一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱是，按

7、分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示： Ve=K1-K2logM K1与K2为常数，M为分子数，Ve也可用Ve-Vo（分离体积）,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt（简化的洗脱体积,它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定与溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的的分子量，测定时以便用曲

8、线的直线部分为宜。用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定脱洗液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常，用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其他方法的

9、测定相对照，由此才可作出可靠的结论。凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前以得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的分子量。下面实验是利用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子量。二、试剂和器材【试剂】1、标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清血蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），CytC(13.7KD)等，均为分析纯。2、洗脱液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5取0.5M KCl 20ml，0.2M Tris 25ml，0.1M HCl 40.3ml，再加H2O定容至100ml3、Se

10、phadex G-75（或G-100）。【器材】1、层析柱：柱管1.2×50cm。2、核酸蛋白检测仪（或紫外分光光度计）。3、部分收集器。4、刻度试管。三、操作方法与结果（一）凝胶柱的准备1、凝胶的选择和处理1凝胶的选择：凝胶型号很多。型号不同，筛分范围亦不同。市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。如果用于分离核糖时，则限于其空间结构和所带基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和Sephacryl。在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex G-25.当溶液通过G-25柱时，蛋白质

11、被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就使蛋白质得到纯化。一般说来，在规定的筛分范围内，混合物之间量差别越大，分离效果越好。2凝胶的处理：葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要做洗脱剂的相同液体中，充分溶胀，然后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积，计算所需凝胶干粉的重量，将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，一般为水、盐溶或缓冲液，放置在室温，使之充分吸水溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而异。为了缩短溶胀时间，可以在沸水浴上加热至将近100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可杀死细菌和霉菌和排除凝

12、胶内部包藏着的气泡。但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去。装柱前最好将处理好的凝胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。2、凝胶柱的制备1柱的选择：层析柱是所有层析方法的主要组成部分。因此，对层析柱（包括体积和长度等）选择的合理与否，将直接影响分离效果。当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上物质时，仍时层析柱长的比短的分辨率高。一般理想的层析柱之直

13、径和长度之比是1：25100。层析柱最好有架套，这样温度可以控制，得到的结果可以重复。2装柱：层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般柱直径（半径）为1cm，如果样品样比较多，最好用直径2-3cm柱。但若直径太小时会发生“壁管效应”，即在柱管中心部分组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。一般说来，柱越长，分离效果愈好，但柱过长，实验时间长，而且样品稀释度大，易扩散，分离效果反而不好。一般来说，用于脱盐时，柱高50cm比较合适；在进行分级分离时，100cm高就已足够。 装柱方法与一般柱层析法相似，柱管可用一般柱层析管，柱的下端缩口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。底

14、下用棉花或玻璃纤维填弃。如用烧结玻璃砂板做底，尽管用细孔的（3号），粗孔的则要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布。先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱内，待其自然沉降至柱高的1/41/3时，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流入，使柱上端悬浮液面缓慢下降至需要的高度。要注意颗粒间没有夹杂气泡，最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，再通过2-3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防在加样时凝胶被冲起来。要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干，分离效果变坏，并有可能混有气泡，

15、影响液体在柱内的流动。3、加样：加样量与测定方法和层析柱大小有关。测定样品含量的方法灵敏或床柱体积小时，加样量可少。否则反之。例如，一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法。当采用280nm观察消光读数时，加样量需5mg左右（柱体积2×60cm）；当采用220nm观察消光读数时，加样量只需要1.2mg左右。加样量掌握得当，可提高分离效果。一般来说，加样量越少，或加样体积越小（样品浓度高），分辨率越高。但用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。此外，样品的粘度也影响层析的分辨率，样品的粘度大比小分辨率低。因此，一般使用的样品粘度应小于2，或者与洗脱液的粘度相当为宜。加

16、样的方法与一般柱层析法相同，将柱中多余的液体放出后，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开管夹，使样品溶液流入柱内。然后加入溶剂或盐溶液洗脱。4、洗脱：所有洗脱液均以能溶解洗脱物质和不使其变性或失活为原则。洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积发生变化而影响分离效果。洗脱所用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作为洗脱剂，可以减低吸附，将组分分洗下。洗脱时的流速要严格控制。否则收集的每一部分洗脱体积就不会

17、恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。事实上，大多数实验室是采用后一种方法进行控制流速的。流速在洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关。凝胶层析与一般离子交换树脂不同，加压超过一个极限值，不仅不能增加速度，反而使流速急剧下降。流速对交联度不同的凝胶是不同的。对交联度大的凝胶（G-10至G-50型），流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。对交联度小的凝胶（G-75至G-200型），流速与柱的直径有关，并在一定的适宜操作压差下有最大的流速。流速亦受颗粒大小影响，颗粒大

18、时流速较大，但流速大时洗脱峰形状较宽，颗粒小时流速较慢，分离情况较好。在操作时应根据实际需要，在不影响分离效果的情况下，尽可能使流速不致太慢，以免时间过长。5、柱的重新填装：由于在洗脱过程中，所有组分一般可全部自柱上洗下，所以装好一次柱管之后，可以反复使用，无须特殊的“再生”处理。但由于在使用过程中，颗粒可能渐渐沉积压紧，因此在使用一段时间后，流速可能渐渐减低，使一次分析时间拖长很久，这时需要将凝胶倒出，重新填装，或者用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行降沉。有时流速改变是由于柱顶上有灰尘集聚，则需将表面层除去。由于葡萄糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。

19、一般可用0.02%的叠氮钠（NaN3）溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反应，也不改变他们的层析效果。也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%（0.01-0.02%）三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60度以上时就要分解。在弱碱性溶液中也有用0.01%乙醇尔溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂，因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。6、凝胶的保存方法：凝胶用完后可用以下方法保存：（1）、膨胀状态：即在水相中保存，可加入上述防腐剂，或加热灭菌后于低温保存。（2）、半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用60-70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。（3）、干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽虑至干，于60-8