二甲双胍对糖尿病大鼠心肌病变的抗氧化保护作用

1、二甲双胍对糖尿病大鼠心肌病变的抗氧化保护作用【摘要】 目的 探讨二甲双胍(MT)对2型糖尿病大鼠心肌病变的抗氧化保护作用。方法 雄性SD大鼠45只，高脂高糖喂养6周后，予以链脲佐菌素(STZ)35mg/kg腹腔注射制备2型糖尿病动物模型，随机分为对照组(CG)、单纯糖尿病组(DG)、小剂量MT干预组(SM，100mg/kg·d灌胃)及大剂量MT干预组(LM，300mg/kg.d灌胃)，灌胃12周后，血清检测胰岛素(INS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CH)及游离脂肪酸(FFA)，心肌匀浆检测超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平，应用免疫组织化学方法测定核因子(NF-B

2、 p65)及环氧化酶-2(COX-2)在心肌中的表达，并观察各组心肌细胞超微结构变化。结果 1)与对照组比较，DG组体重明显减轻，血糖、心脏质量指数、INS、TG、T-CH及FFA明显升高(P0.01)；应用MT治疗后体重无明显增加，INS有所下降，心脏质量指数、血糖、TG及FFA明显降低(P0.01)；DG组心肌组织MDA明显升高，SOD明显降低(P0.01)，MT治疗后上述指标明显改善；2)超微结构观察单纯糖尿病组肌丝结构明显紊乱，典型肌小节结构消失，线粒体肿胀、间质纤维增生，微血管内皮细胞肿胀等表现，而SM及LM组可见组织结构有所改善；3)对照组心肌NF-B p65及COX-2只有少量表

3、达，单纯糖尿病组表达量明显增多(P0.01)，MT治疗后表达量明显减少(P0.01)。结论 MT对糖尿病心肌病变具有保护作用，可能与其减弱脂质的过氧化反应，减少NF-B及COX-2的表达有关。 【关键词】 二甲双胍；糖尿病大鼠；心肌；抗氧化Obstract： Objective To explore the protective effect and investigate anti-oxidative stress mechanism of metformin on diabetic myocardial damage in rats. Methods The model of diabet

4、es in 45 male SD rats was establised through intraperitoneal injection streptozotoch(STZ) 35mg/kg after six weeks by feeding high fat and high glucose food. 45 rats were randomly divided into control group group(CG)、Diabetic group(DG)、small dose metformin group(SM,intragastric administration with me

5、tformin 100mg/kg·d）and large dose metformin group(LM, intragastric administration with metformin 300mg/kg.d ).All groups was taken blood sample to detecte insulin 、blood fat and free fatty acids and prepared myocardium homogenate to detecte activity of superoxide dismutate (SOD) and malondialde

6、hyde(MDA) and analyze the express of NF-B p65 and COX-2 in myocardium by immunohistochemical analysis,observe myocardial ultrastructure at the end of 12 weeks. Results 1)compared with the control group,body weight decreased significantly and blood glucose 、heart index 、insulin、cholesterol、triglyerid

7、e and free fatty acids in DG group increased significantly（P0.01）. Compared with DG group, the level of insulin , heart index 、blood glucose、triglyeride and free fatty acids were cut down significantly after treatment with large or small dose metformin（P0.01）.MDA increased and SOD deceased in myocar

8、dium tissues of diabetic group and the difference had significant difference compared with the control group（P0.01）. 2)Myocardial ultrastructure was normal in the control group,myoneme arranged disordered,the structure of typical sarcomere disappeared, mitochondrium intumesced,interstitial substance

9、 fiber hyperplasy,capillary vessel endothelial cell swelled in DG group.Myocardial ultrastructure improved slightly in rats of SM and LM groups. 3)NF-B p65 and COX-2 had a small quantity to present in the myocardium tissue of control group,while the quantity increased obviously in the diabetic group

10、.The level of it in the group of treatment was significant lower than that in the diabetic group.There was significant difference between the two groups. Conclusion Metformin can protect against the heart injury in diabetic.The mechanisms may be associated with inhibition of lipid peroxidation which

11、 can decreased the secretion of NF-B and COX-2 evoked by oxidative stress.Key words： metformin；diabetes mellitus；myocardium；anti-oxidative stress 在糖尿病(DM)的诸多慢性并发症中，糖尿病性心肌病的危害最大，但由于其病因复杂，临床诊断及治疗困难，目前尚无治疗该病的特效药物。二甲双胍(Metformin，MT)是较传统的降糖药，近年由于其在心血管方面的突出作用，对此药的研究日趋深入，特别是对其潜在非降糖机制的研究颇多1-2。本研究以高脂高糖喂养加小剂量

12、链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病动物模型为研究对象，观察MT对心肌在抗氧化方面的作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 清洁级近交系Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠45只(由宁夏医学院实验动物中心提供)，8周龄，体重为(220±20)g，实验动物许可证号：SCXK(宁)2005-0001。1.1.2 主要试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司；二甲双胍为天津中新药业股份公司生产；兔抗鼠NF-B p65及COX-2多克隆抗体购自武汉博士德公司；MDA、SOD、FFA试剂盒为南京建成生物工程研究所的产品；血浆胰岛素ElASA试剂盒购自大连

13、泛邦试剂公司；微量血糖仪由罗氏公司提供；透射电镜型号为HITACHI H-600。1.2 方法1.2.1 动物模型建立及分组 对照组10只大鼠饲以常规饲料，实验组35只饲以高脂高糖饲料(10%猪油、20%蔗糖、2%蛋黄粉、1%胆盐、67%常规饲料)。喂养6周后，实验组大鼠隔夜空腹腹腔注射链脲佐菌素35mg/kg(以pH4.5、0.1mmol/L枸橼酸缓冲液配制成20g/L溶液)；对照组仅注射等容积的枸橼酸缓冲液，注射1周后，监测大鼠尾尖血糖，以血糖11.1mmol/L作为糖尿病成模标准，按以上标准剔除未成模鼠4只，成模率为88.6%，将成模糖尿病大鼠随机分为三组：单纯糖尿病组10只、小剂量MT

14、干预组11只(SM组)及大剂量MT干预组10只(LM组)。SM及LM组分别予二甲双胍100mg/(kg·d)及300mg/(kg·d)溶于1mL生理盐水灌胃治疗，对照组及单纯糖尿病组予以等容积生理盐水灌胃，每日1次；所有大鼠分笼喂养，充分供给食水，每周测1次尿糖和体重，每月测1次血糖，成模后共观察12周。1.2.2 观察指标 于灌胃后12周时进行标本收集，先测尾尖空腹微量血糖，然后用20%乌拉坦溶液按5mL/kg腹腔注射麻醉，剖开胸腹，心内采血，迅速取出心脏，冰盐水冲洗，滤纸吸干，称量心脏重量，计算心脏质量指数(心重mg/体重g)。(1)分离血清按试剂盒说明分别检测INS、

15、TG、T-CH及FFA；(2)制备心肌匀浆检测：心肌组织SOD、 MDA(按说明书严格操作)，计算抗氧化比值AOR=SOD/MDA；(3)心肌电镜观察：于左心室前壁取1mm3心肌组织经戊二醛及锇酸双固定，梯度乙醇系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片观察超微结构变化；(4)NF-B p65及COX-2的免疫组化染色(SABC法)：严格按说明书操作，NF-B p65为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色片状或颗粒状染色为阳性结果，COX-2为细胞胞浆或间质着色为阳性，在image pro-plus 6.0病理图像分析系统下，测定阳性区域的面积及平均光密度，计算累积光密度(IOD)=阳性面积×平均光密度

16、。1.3 统计学方法 计量数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较采用方差分析，所有数据用SPSS 11.5统计软件处理。2 结果2.1 各组大鼠一般情况比较 对照组组大鼠精神状态良好，毛色白有光泽，无死亡；单纯糖尿病组大鼠均出现多饮、多食和消瘦等症状，且精神萎靡，毛色干枯；实验结束时，单纯糖尿病组死亡2只，血糖恢复正常1只；SM组死亡2只，LM组死亡1只。2.2 各组大鼠检测指标的比较(表1)表1 各组大鼠检测指标的比较(略) 与对照组比较，单纯糖尿病组及SM、LM组体重均明显减轻，差异有统计学意义(P0.01)；单纯糖尿病组心脏质量指数明显增加，应用MT治疗后显

17、著减少(P0.01)；单纯糖尿病组TG、T-CH明显升高(P0.01)，治疗后可见TG明显降低，LM较SM组减低更明显，与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)，而TCH变化不明显；单纯糖尿病组血糖、INS明显升高(P0.01)，治疗后有明显下降，但与对照组比较仍偏高(P0.01)；单纯糖尿病组可见血FFA及心肌MDA明显升高，SOD、AOR明显降低(P0.01)，SM组上述指标有所改善，而LM组改善更显著。 2.3 心肌细胞电镜表现(图1) 对照组(图1a)心肌肌丝结构清晰，肌小节及其Z线、M线结构清晰，肌丝间线粒体排列整齐，嵴结构清晰，排列密集；单纯糖尿病组(图1b)心肌肌丝结构明显紊乱

18、，典型肌小节结构消失，线粒体肿胀，内有断嵴、空泡样变性现象，粗面内质网扩张，间质纤维增生，偶见闰盘断裂，微血管内皮细胞肿胀，凸入管腔，管腔狭窄，基底膜呈节段性增厚；而SM组(图1c)与单纯糖尿病组比较，肌丝结构有所改善，但走行仍欠规整，可见肌小节和Z线，线粒体肿胀明显减轻，心肌间质纤维减少，微血管基底膜增厚减轻；LM组(图1d)肌丝结构较清晰，闰盘完整，但线粒体仍轻度肿胀，内有少许空泡变性。2.4 免疫组化结果 对照组心肌NF-B p65微量表达，多为胞浆黄染；而糖尿病组NF-B p65表达明显增多，阳性细胞呈棕黄色，定位于细胞核，两组差异有统计学意义(P0.01)，治疗12周后可见SM、LM

19、组IOD值降低，P0.01(表2、图2 AD，见封3)。 COX-2在 对照组中只有少量表达，糖尿病组表达量明显增多，多为胞浆及间质黄染，MT干预后表达量较DG组显著减少(P0.01)，详见表2、图2 EH。表2 各组大鼠心肌NF-B p65及COX-2免疫组化IOD值比较(略)3 讨论 糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起广泛的结构异常，最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态3。其发病涉及的因素较多，近年来主要集中于心肌细胞的代谢、钙转运以及自由基的异常等，其中氧化应激为一重要的始动因素，并贯穿疾病的全过程4-5。本实验研究结果亦表明，2型糖尿病由于胰岛素

20、抵抗(IR)的存在以及由此引起的循环FFA水平增高，可以造成活性氧产生增多，心肌能量底物的代谢改变，表现为糖尿病大鼠心肌MDA升高、SOD水平降低，AOR比值较对照组降低(P0.01)，提示心肌脂质过氧化作用的增强及抗氧化酶活性的降低从而导致心肌细胞受损，至病程12周时已能明显的观察到心肌结构的紊乱、线粒体损伤、粗面内质网扩张及心肌间质纤维增生、微血管内皮细胞肿胀、管腔狭窄、基底膜节段性增厚等表现。 双胍类药物自从应用于临床40年来，几经起伏，1998年公布的英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)结果表明6，磺脲类和胰岛素强化治疗心血管事件减少了6.4%，而MT则可减少心血管事件43%，因此MT在

21、治疗2型糖尿病的一线用药地位迅速得以确立。本实验成功建立2型糖尿病动物模型，应用MT干预12周，观察到大剂量MT有降低血糖的作用，但与对照组比较仍有统计学意义(P0.01)，而降TG及FFA的作用明显(P0.05)，且这种作用不刺激胰岛素的过度分泌，不引起体重的增加，最终使MDA降低，SOD有所提高，考虑MT具有不依赖于降糖的降低TG及FFA的作用，可调节糖尿病脂质代谢紊乱，降低脂质过氧化产物并提高机体抗氧化酶活力，纠正全身过氧化状态，与Bailey等的研究结果一致7-8，且干预12周后，电镜观察可发现肌丝结构较糖尿病组明显清晰，线粒体肿胀及内质网的扩张明显减轻，心肌间质纤维减少，微血管基底膜

22、增厚程度减轻，提示MT的抗氧化作用可能参与了其对糖尿病心肌损害的保护机制，且本实验结果显示MT的这种作用与剂量有关。 关于二甲双胍抗氧化方面的作用机制，目前尚不清楚。Pickup等9提出，在2型糖尿病患者中炎症是IR起源的触发因素。在炎症-IR-DM这一病理生理过程中，脂肪细胞的内分泌调节功能障碍具有重要作用，其致病机制复杂，但中心环节可能是通过氧化应激产生活性氧，活化NF-B、蛋白激酶C(PKC)等。越来越多的证据表明10-11，对氧化应激敏感的NF- B的激活可调控其下游COX-2的表达增高和前列腺素PGE2合成增加，在糖尿病心血管并发症中的作用日益受到重视。本研究发现，DG组心肌NF-B

23、 p65及COX-2表达较对照组组明显增加(P0.01)，而应用二甲双胍干预治疗12周后可见表达量明显减少；COX作为前列腺素(PG)合成过程中的一个重要限速酶，在炎症反应中起了重要作用，COX-2可以刺激ROS合成增加，且与自由基形成正反馈；自由基可诱导膜发生脂质过氧化反应，通透性增加，还可攻击膜蛋白及胞内的酶系统和核酸，促使细胞凋亡，加重心肌细胞的损害12，本研究结果提示：二甲双胍对糖尿病心肌病变具有保护作用，其机制可能与减弱脂质的过氧化反应，减少NF-B及COX-2的表达，从而对氧化应激有直接和(或)间接的抑制作用有关。 但是，糖尿病心肌病的形成是多种病理生理机制综合作用的结果，二甲双胍

24、通过抑制氧化应激反应而减弱ROS-NF-B-COX-2的表达只是其中一方面，其他相关机制还需进一步探索研究。【参考文献】 1Jenny E.Gunton，Patric J.D.Metformin Rapidly Increases Insulin Receptor Activation in Human Liver and Signals Preferentially through Insulin-Receptor Substrate-2J.Clin Endocrinol Metab，2003，88(3)：1323-1332.2Matthaei S，Reibold JP，Haann A，et

25、 al.In vivo metformin treatment ameliorated insulin resistance：evidence for potentiation of insulin-induced tranlocation and increased functional activity of glucose transponters in obese(Fa/Fa)Zncker rat adipocytesJ.Endocrinology，1993，133(7)：304-311.3SA Hayat，B Patel，RS Khattar，et al.Diabetic cardi

26、amyopathy：mechanisms，diagnosis and treatmentJ.Clin Sci，2004，107(6)；539-557.4Wohaieb SA，Godin DV.Alterations in free radical issue-defense mechanisms in streptozocin-induced diabetes in rat.Effects of insulin treatmentJ.Diabetes，1987，36(9)：1014-10185金朝阳，邹大进.游离脂肪酸致胰岛素抵抗的机制J.中华内分泌代谢杂志，1999，15(4)：247-249.6The Diabetes Controland Complications Trials(DCCT)Research Group. The effect of intensive diabetes therapy on measures of autonomic nervous system function in the Diabetes Cont