基于ISSR标记的浙江主要茶花品种亲缘关系及DNA指纹图谱研究

1、基于issr标记的浙江主要茶花品种亲缘关系及dna指纹图谱研究正文报告一、项目研究意义1、浙江省茶花产业的发展状况及在产业发展中面临的主要问题茶花（camellia japonica）是世界名优花卉之一，是我国的十大名贵花卉之一，也是我省金华、宁波、温州三市的市花。我省在茶花品种的收集、培育及产业化示范方面已处于全国领先水平。1997年，金华被农业部命名为全国唯一的中国茶花之乡；2003年第十八届国际茶花大会在金华召开，使我省茶花在国内外都获得了很高的知名度。2005年，全省茶花种植面积达10万多亩，有10多万花农种植茶花，年产茶花800多万盆，培植种苗3000多万株，年产值达25亿元。目前，

2、我国的茶花品种约300余个（庄瑞林，1989），其中我省茶花除原种外，在金华、宁波、温州等地经过长期的人工栽培、杂交和选种，培育出200余个有地方特色的传统茶花品种；另有国外引进的400余个品种(高继银，1999)。我省近年茶花产业蓬勃发展，但在发展中也出现了以下几个问题：（1）品种混杂、谱系不明，亲缘关系不清，导致新品种选育亲本选配的盲目性大，育种效率比较低，育成品种遗传背景趋于单一，不利于保持品种的遗传多样性。（2）茶花多为无性繁殖，新品种进入市场后，由于缺乏有效的品种鉴别手段，难以开展技术监督和管理，知识产权得不到有效的保护，大大损害了品种选育单位及育种家的积极性。（3）在种苗销售过程中

3、，由于仅靠苗期的形态性状难以辨别品种的真伪，容易出现种苗假冒现象，严重损害花农利益。为了尽快解决这些问题，提高浙江茶花的质量和市场竞争力，应对我省主要茶花品种间的亲缘关系进行系统的研究，以减少育种过程中亲本选配的盲目性，提高育种效率；同时找出一种操作简单、成本低廉、结果可靠的方法和技术，对山茶品种进行快速、准确的鉴别，为新品种保护或假冒品种鉴别提供技术证据。 2、山茶品种间亲缘关系及品种鉴别方面的研究现状及issr分子标记技术长期以来国内有关茶花品种的研究，多集中在对茶花野生资源调查（李宝华，2003；李纪元等，2002）、资源的收集、整理、栽培技术、杂交育种（陈新年，1999）、组织培养、嫁

4、接繁殖等方面的研究上，对茶花品种间的亲缘关系、品种鉴别一直以来都是依据其花的形态结构和生理性状(陈清炮，1992)，而在分子水平上对茶花品种间的亲缘关系、遗传分析与鉴别等方面的研究至今未见报道。目前在植物亲缘关系和dna指纹图谱研究中可以利用的有rapd、aflp、rflp和issr等多种分子标记。但前三种标记均存在一定的局限性，rapd的扩增结果稳定性和重演性较低，aflp、rflp的技术要求高，成本高，难以在一般的实验室普及与应用。而issr分子标记即简单重复间序列(inter-simple sequence repeat，issr)，是在ssr标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是

5、在ssr的5或3端加锚l-4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列ssr的一段基因组dna序列进行扩增。重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比rapd方法更多的扩增片段。因此，issr不仅结合了rapd的通用性，而且具有aflp、rflp的大部分优点，是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的dna指纹技术。利用issr分子标记可以在亲缘关系较近的品种间检测遗传差异，评估不同品种间的异质性，计算亲本之间的遗传距离，从而确定亲本之间的遗传关系和亲缘关系，并进而划分杂交优势群，提高杂种优势潜力；同时issr分子标记可以用来建

6、立dna指纹图谱，因在同一物种的各个品种间存在大量的多态性标记，某一品种具有区别于其它品种的独特标记即一些特异性dna片段的组合就称为该品种的“指纹”，各品种的独特的指纹片段构成该物种的dna指纹图谱，它具有类似于人的指纹那般的高度个体特异性和稳定性。dna指纹图谱在植物育种中有广泛应用，因为（1）每个品种dna指纹差异可直接提供与目标性状有关的dna水平的信息，避免了环境的干扰，从而能大大提高杂交育种中对亲本及后代理想单株的选择效率，（2）通过检测品种是否只具有该品种特有的标记指纹片段，可以很有效地鉴定品种纯度与真伪，以及用于新品种登记和品种知识产权保护等（邹喻苹等，2001）。issr标记

7、目前已广泛用于植物品种鉴定、亲缘关系的确定（何予卿等，2001；乔玉山等，2003）、dna指纹图谱构建（王心宇等，2001；宣继薛等，2002；姚明哲等，2005）、遗传育种（张立荣等，2002）等研究中。3、利用issr分子标记开展我省茶花主要品种的亲缘关系和dna指纹图谱研究针对我省茶花良种选育、推广和产业化中存在的这些实际问题，可以采用issr分子标记技术开展我省茶花主要品种的亲缘关系研究，以明确我省茶花主要品种间的遗传距离，为新品种选育过程中的亲本选配提供理论依据和实际指导；建立dna指纹图谱为茶花品种鉴别提供一种操作简单、成本低廉、结果可靠的方法和技术，并对我省主要的茶花品种进行分

8、子鉴别和新品种的保护，促进我省茶花产业的发展。二、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系1、项目研究目标 本研究以浙江省主要茶花品种为对象，利用issr分子标记技术，进行遗传分析，研究其亲缘关系，建立dna指纹图谱。旨在估算茶花品种的遗传距离，建立遗传关系树状图；同时筛选可揭示品种间差异的特异谱带及相应的引物和引物组合，构建茶花品种dna的issr指纹图谱，为我省茶花新品种选育过程中的亲本选配提供理论依据和实际指导，为茶花品种分子鉴别提供一种简便、可靠的技术。2、申请者研究工作长期目标的关系申请者目前主要从事山茶属植物遗传多样性和分子系统分类的研究，博士论文就是基于its红山茶组植物的系

9、统分类研究。今后长期工作目标主要是在分子水平上研究山茶的种质资源、品种鉴定和遗传多样性，了解和发掘山茶花不同品种中蕴藏的有利基因，并加以有效利用。尤其是利用issr结合其他的分子标记开展山茶群体遗传多样性、基因定位、分子遗传图构建的研究。因此，本项目是申请者长期工作目标的一部分，是今后工作深入开展的基础。三、项目研究内容，研究方案和进度安排（一）研究内容1、不同茶花品种的亲缘关系研究对不同品种的茶花进行issr-pcr扩增，对扩增结果进行分析，估算品种间的遗传一致度和遗传距离，构建遗传关系树状图。2、不同茶花品种dna指纹图谱研究筛选可揭示品种间差异的特异谱带及相应的issr引物及引物组合，构

10、建我省茶花不同品种dna指纹图谱。 （二）研究方案研究方法和手段：1、取样：样本数大于30个，依据以下原则选择供试样品：（1）代表不同生态类型，（2）代表不同茶花类别，（3）代表不同异质性类型，（4）具有一定的栽培面积。2、dna的提取与纯化：采集新梢叶片，液氮速冻，-80保存，用改良ctab法（doyle,1987）提取样品的基因组dna，通过凝胶回收进行纯化。3、issr引物设计与合成：根据茶树等近缘物种的issr引物序列信息设计与合成引物，用于issr扩增。4、issr-pcr扩增：根据每个issr引物的特性，设计不同的温度梯度，根据pcr扩增的结果筛选各引物适宜的退火温度，优化扩增条件

11、。然后选择少数（8-10个）遗传差异较大的品种对设计合成的100条引物扩增产物的多态性进行初步分析，筛选扩增产物多态性高，扩增效果好的引物，进而对的所有供试样品进行pcr扩增。5、pcr产物检验：issr-pcr扩增产物采用8聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后用银染法检测，凝胶成像仪拍照记录。6、数据统计：对issr扩增条带进行统计。7、谱带分析：计算遗传距离，用upgma发构建品种间遗传关系树状图。8、构建dna指纹图谱：筛选可揭示品种间遗传差异的特异谱带及相应的issr引物和引物组合，建立不同品种的dna指纹图谱。技术路线：供试材料选择和取样基因组dna提取与纯化issr引物的筛选issrpcr反应

12、条件优化供试品种的issrpcr扩增issr扩增谱带统计与分析dna指纹库的构建品种亲缘关系分析指导茶花新品选育茶花新品种分子鉴别与保护（三）拟解决的关键技术1、适用于茶花的issr-pcr技术的建立；2、利用issr-pcr标记鉴别茶花不同品种的技术。（四）进度安排1、2007年1月2007年5月：(1)确定采样点，供试样品嫩叶采集；(2)issr引物的设计与合成。2、2007年6月2007年12月：(1)基因组dna提取和纯化；(2)issr-pcr反应条件的优化；(3)多态性issr引物的初选。3、2008年1月2008年8月：(1)供试样品的issr-pcr扩增；(2)谱带记录、统计和

13、分析。4、2008年9月2008年12月：(1)构建品种间的遗传关系树状图，分析品种间的亲缘关系；(2)构建dna的issr指纹图谱；(3)撰写论文，结题。四、项目创新之处1、应用issr分子标记对茶花进行品种鉴别和亲缘关系研究，引入并建立茶花品种鉴别的新技术和新方法实践证明，分子标记是进行植物品种鉴别和亲缘关系研究的有效工具。rapd（lee et al，1995; wachira et al，1997; 陈亮等，2002；姚明哲等，2005）、aflp（paul et al，1997; wachira et al，2001；唐绍清等，2004）和rflp（matsumoto et al,

14、2002）等分子标记技术已应用在和茶花同一属的茶树和金花茶等的遗传关系分析上，但这些标记均存在一定的局限性。而issr具有多态性高，重复性好，开发成本低等优点，已成功用于水稻、小麦、玉米、马铃薯、柑橘、李和茶树等的种质鉴定和遗传、亲缘关系和指纹图谱研究上（zietkiewica et al，1994；fang et al，1998；blair et al，1999；aggarwal et al,1999；rrddy et al,2002；宣继薛等，2002；freeman et al, 2004；姚明哲，2004），显示了广阔的应用前景，但该技术在茶花上的应用研究还未见报道。因此，引入issr

15、技术到茶花品种的亲缘关系分析及品种鉴别的研究中并加以利用是本研究的创新点，这可为茶花品种鉴别建立一种可靠、简单、低廉的新方法和新技术。2、在我省主要的茶花品种间开展较为系统的亲缘关系的研究，并且首次对茶花的主要品种进行dna指纹图谱的研究，从分子水平上阐释现有品种的亲缘关系先前对茶花品种的研究主要在茶花的资源调查（李宝华，2003；李纪元等，2002）、栽培技术、杂交育种（陈新年，1999）上。为了深入、系统地了解我省茶花品种间的亲缘关系，减少育种过程中亲本选配的盲目性，提高育种效率，保护新品种，本研究供试品种的选择具有广泛性和代表性，重点选择代表不同生态类型、异质性、具有一定应用规模的茶花品

16、种。对茶花品种间亲缘关系进行较为系统的研究，并对我省茶花的主要品种进行dna的issr指纹图谱的研究，在基因组水平上鉴别不同品种资源，了解和发掘蕴藏的有利基因，并在新品种的选育和保护上加以利用。主要参考文献：陈清炮. 浙江省山茶花品种分类的探讨j. 园艺学报, 1992，19(1)：71-75陈新年. 山茶花品种间杂交育种研究j. 湖南农业大学学报,1999, 25(3):200-204高继银. 世界名贵茶花m. 杭州：浙江科技出版社. 1999何予卿，张宇，孙梅利用issr分子标记研究栽培稻和野生稻亲缘关系j农业生物技术学报，2001，9(2)：123-127李宝华. 青岛唠山地区山茶资源调

17、查报告j. 青岛职业技术学院学报, 2003,16（4）：68-69李纪元，谢明初，王新海. 大花红山茶种质资源及其多用途利用潜力j.浙江林业科技,2002,22(6): 56-58乔玉山，章镇，房经贵，沈志军，赵密珍. 李种质资源issr反应体系的建立j. 果树学报,2003，20(4)：270-274唐绍清，杜林方，王燕. 山茶属金花茶组金花茶系的aflp分析j. 武汉植物学研究2004,22(l):44-48王心宇，陈佩度，乔增军issr标记在小麦指纹图谱分析中的应用研究初探j农业生物技术学报，2001，9(3)：261-263宣继薛，章镇，房经费苹果品种issr指纹图谱构建j果树学报，

18、2002，19(6)：421-423姚明哲，王新超，陈亮，杨亚军. 茶树issrpcr反应体系的建立j. 茶叶科学2004，24(3)：172-176姚明哲，王海涛，余继忠，陈亮. issr在茶树品种分子鉴别和亲缘关系研究中的适用性分析. 茶叶科学, 2005, 25(2)153-157张立荣，徐大庆，刘大群. ssr和issr分子标记及其在植物遗传育种研究中的应用j.河北农业大学学报,2002,25(1)：90-94庄瑞林. 中国山茶m. 海南：海南人民出版社. 1989.邹喻苹，葛颂，王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记m. 北京：科学出版社，2001aggarwal ak, brar

19、ds, khush gs. phylogenetic relationships among oryza species revealed by aflp markersj. thor appl genet, 1999, 98:1320-1328blair mw，panaud o，mccouch srinter-simple sequence repeat (issr) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (oryza sativa l.)jtheor a

20、ppl genet，1999，98：780-792doyle jj, doyle jl. a rapid dna isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissuej. phytoche bull, 1987, 19:11-15fang dq，krueger rr，roose ml. phylogenetica relationships among selected citrus germplasm accessions revealed by inter simple sequence repeat (issr) ma

21、rkersjj amer soc hort sci，1998，123：612-617freeman s, west j, james c, lea v, mayes s. isolation and characterization of highly polymorphic microsatellites in tea (camellia sinensis)j. molecular ecology notes, 2004, 4: 324-326lee sh，choi sh, kim rh, lee hy, nou is. identification of korean wild tea p

22、lants and japanese green tea cultivars using rapd markersj. j. kor. tea soc, 1995,1(1):129-148matsumoto s, kiriiwa h, takeda y. differentiation of japanese green tea cultivars as revealed by rflp analysis of phenylalanine ammonia-lyase dnaj. theor appl genet, 2002, 104:998-1002paul s, wachira fn, po

23、well w, waugh r, diversity and genetic differentiation among populations of india and kenyan tea revealed by aflp markersj. theor appl genet, 1997, 94:255-263reddy mp，sarla n，siddiq eainter-simple sequence repeat (issr) po1ymorphism and its application in plant breedingjeuphytica，2002，128：9-17wachir

24、a fn, powell w, waugh r. an assessment of genetic diversity among camellia sinensis l.( cultivated tea) and its wild relatives based on randomly amplified polymorphic dna and organelle specific stsj.heredity, 1997,78:603-611zietkiewica e, rafalski a, labuda d. genome fingerprinting by simple sequenc

25、e repeat (ssr)-anchored po1ymerase chain reaction amplificationjgenomics，1994，20：176-183五、工作基础与工作条件1、工作基础申请人目前主要从事茶花的分子生物学及资源方面的研究工作。博士论文研究的是国家基金项目红山茶组植物基于its序列及杂交亲和性的系统分类研究(编号30471420)。现主持宁波市科技攻关项目四季茶花新品种的引种与商品盆花生产关键技术研究。课题组的主要成员长期致力于山茶属植物的研究，承担并完成了国家林业局指南项目国外茶花种源收集及利用方法研究，国际合作项目山茶属植物的系统调查与栽培，浙江省科技厅重点项目特异茶花新品种选育及其标准化栽培技术研究；国家科技部农业成果转化资金项目名优茶花品种产业化示范等项目；出版了中国山茶、世界名贵茶花、中国名优茶花三部专著；主要成员于2004年开始将issr分子标记技术对茶树无性系品种进行研究，建立了适用于茶树的issr反应体系，前期工作表明issr标记具有较高水平的多态性