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文档简介
1、微滴式数字PCR操作程序操作方法1. 先打开电脑,再打开QX200 Droplet Reader电源,在使用前需预热至少30分钟; 2. 配制探针法定量反应体系,振荡混匀,离心除气泡,注意20ul体系中所加样本核酸含量不要超过规定检测范围(1100000拷贝片段化核酸或者120000拷贝较完整基因组DNA),如完整的人类基因组DNA不要超过66ng/20ul,可提前用限制性内切酶处理样本可提高检测浓度; 3. 将一个新的DG8 cartridge放入holder中,注意缺口方向; 4. 将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内,不足8个样品时用20ul 1
2、15;buffer control补足,建议使用Rainin的8通道20ul排枪和20ul枪头(不能用200ul枪头),加样时枪头接近孔一侧底部,与侧壁呈大约15°角,缓慢打出液体,打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体,不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡; 5. 在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DG Oil),同样不能有空着的孔; 6. 盖上胶垫(gasket),注意两边的小孔都要钩牢; 7. 将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中,开始生成微滴,注意仪器上指示灯状态,一般2分钟之内完成; 8. 微滴生成于cartridge最
3、上面一排孔内,建议使用Rainin的8通道P50排枪和200ul枪头小心缓慢吸取,调整吸取体积为40ul,将holder放平,枪头以与孔壁呈3045°角放入,轻触孔底,约5秒吸取40ul,再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒),枪头贴近孔壁接近孔底,注意封上盖以防油挥发,每次弃去已使用过的cartridge和胶垫; 9. 转移油滴进入96孔板内完成后,用预热好的PX1热封仪对其进行封膜(膜亮面朝上,暗面向下),推荐的运行程序为:180,10s,无需颠倒方向二次封膜; 10. 封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应,或者放于4冰箱4小时之内进行PCR,可在任意一台96孔PCR
4、仪上完成,注意升降温速度2.5/s。推荐反应条件: 1. 95,10min; 2. 94,30s 40循环Tm(退火温度按优化摸索得来的条件设置),60s; 3. 98,10min; 11. 查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常(不同说明书上稍有不同); 12. 将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好,注意板斜角方位,如下图所示: 13. 组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中,如图: 14. 打开QuantaSoft软件,建议每次实验之前做一次Flush System,若一周以上未使用建议先做一次Prime再做Flush System。之后对96孔板中样品信息进行Setup,主要是提供实验名称、实验类型(ABS、CNV、RED)、assay以
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