第九章 转基因动物与生物反应器

1、第九章 转基因动物与 生物反应器 第九章 随着随着DNADNA内部结构和遗传机制的揭示，生物学家不内部结构和遗传机制的揭示，生物学家不再仅仅满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是设想再仅仅满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是设想在在分子水平上去改造生物的遗传特性。分子水平上去改造生物的遗传特性。9.1 转基因技术转基因技术 如果将一种生物如果将一种生物DNADNA中的中的某个遗传密码片段某个遗传密码片段连接到连接到另外一种生物的另外一种生物的DNADNA链上去，将链上去，将DNADNA重新组织一下，就重新组织一下，就可以按照人类的愿望设计出新的遗传物质，从而创造可以按照人类的愿望设计出新的遗传物

2、质，从而创造出新的生物。出新的生物。 这种按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生这种按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物技术，就称为基因工程技术。的生物技术，就称为基因工程技术。 基因工程技术的特点：基因工程技术的特点： 基因体外重组、基因体外重组、即在离体条件下对即在离体条件下对DNADNA分子切割并将分子切割并将其与载体其与载体DNADNA分子连接，得到重组分子连接，得到重组DNADNA。 世界上第一批重组世界上第一批重组DNADNA分子诞生于分子诞生于19721972年，次年几种年，次年几种不同来源的不同来源的DNADNA分子装入载体后被分子装入载体后被转入到大肠杆菌转入到大

3、肠杆菌中表中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。达，标志着基因工程正式登上历史舞台。 发展：发展：1 1、外来基因能在生物体内表达、外来基因能在生物体内表达 19741974年，美国斯坦福大学教授年，美国斯坦福大学教授科恩科恩把把金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌的抗药性基因片段菌的抗药性基因片段和大肠杆菌的质粒和大肠杆菌的质粒“组装组装”成杂成杂合质粒，送入大肠杆菌体内，使这种合质粒，送入大肠杆菌体内，使这种大肠杆菌获得了大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性对青霉素的抗药性。 这说明金黄色菌萄球菌质粒上的抗青霉素基因由杂这说明金黄色菌萄球菌质粒上的抗青霉素基因由杂合质粒带到大肠杆菌体内，更重要的是合质粒

4、带到大肠杆菌体内，更重要的是表明外来基因表明外来基因在大肠杆菌体内同样也发生作用。在大肠杆菌体内同样也发生作用。 2 2、 基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意愿去拼接基因，创造新的生物。人类的意愿去拼接基因，创造新的生物。 19741974年，科恩又将年，科恩又将非洲爪蟾的非洲爪蟾的DNADNA与大肠杆菌的质与大肠杆菌的质粒粒“拼接拼接”，获得成功，拼接后的杂合质粒进入，获得成功，拼接后的杂合质粒进入大肠大肠杆菌杆菌，产生了非洲爪蟾的核糖体核糠核酸，产生了非洲爪蟾的核糖体核糠核酸(rRNA)(rRNA)；两两栖动物的基因能在细菌里发挥作

5、用栖动物的基因能在细菌里发挥作用 科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人的身份向英国专利重组技术发明人的身份向英国专利局申报专利、因此局申报专利、因此成为世界上第一个基因工程的技术成为世界上第一个基因工程的技术专利拥有人。专利拥有人。 科恩的实验首次打破了不同物种在亿万年中形成的科恩的实验首次打破了不同物种在亿万年中形成的天然屏障，他的成功天然屏障，他的成功标志着任何不同种类生物学基因标志着任何不同种类生物学基因都能通过基因工程技术重组到一起，人类可以根据自都能通过基因工程技术重组到一起，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至

6、创造新的生命类型。生命类型。 人类历史上第一次具备了精确、细致地控制生物生人类历史上第一次具备了精确、细致地控制生物生长过程的能力。比如：我们可以从在极地生活的鱼类长过程的能力。比如：我们可以从在极地生活的鱼类中提取抵御严寒的基因，再把它们插入到草莓中去，中提取抵御严寒的基因，再把它们插入到草莓中去，让草莓也能在极寒的地区生存。如今，基因重组技术让草莓也能在极寒的地区生存。如今，基因重组技术在在生产医药生产医药上重要的药物以及在上重要的药物以及在农牧业育种农牧业育种等领域中等领域中取得了很多成果。取得了很多成果。 对于基因工程，范围是相当广泛的。如对于基因工对于基因工程，范围是相当广泛的。如对

7、于基因工程动物而言，就有程动物而言，就有转基因转基因、基因替换基因替换、内源基因敲除内源基因敲除等等类型的基因工程动物。类型的基因工程动物。 本章仅重点介绍基因工程中的本章仅重点介绍基因工程中的转基因技术，即：转基因技术，即： 将通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基将通过人工操作的方式将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代因组内，使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的实验技术。的实验技术。 基因转移的方法基因转移的方法 物理方法物理方法 化学方法化学方法 生物学方法生物学方法9 91 11 1 细胞转染外源基因的方法细胞转染外源基因的方法 向细胞中导

8、入外源基因是定向改变细胞遗传性状的常用手段。向细胞中导入外源基因是定向改变细胞遗传性状的常用手段。 要使外源基因有效地转入受体细胞要使外源基因有效地转入受体细胞首先首先 要选择合适的受体细胞要选择合适的受体细胞其次其次 要有可靠的转化后筛选方法要有可靠的转化后筛选方法 常用的哺乳动物细胞转染常用的哺乳动物细胞转染( (接受外源基因接受外源基因) )的方法有两种：的方法有两种：(1)(1)暂时转染：暂时转染：质粒在宿主细胞中不必停留很长时间，质粒在宿主细胞中不必停留很长时间，DNADNA被转录被转录成成mRNAmRNA，随后翻译成蛋白，并不进入细胞基因组。，随后翻译成蛋白，并不进入细胞基因组。磷

9、酸钙沉淀法、磷酸钙沉淀法、DEAEDEAE葡聚糖法均为暂时转染。葡聚糖法均为暂时转染。 (2)(2)永久性转染：永久性转染：反转录病毒载体法可以产生永久有效的转染。反转录病毒载体法可以产生永久有效的转染。 ( (一一) )电穿孔法电穿孔法 这种方法这种方法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔，从而使外源胞膜上形成纳米级的微孔，从而使外源DNADNA转移至细胞转移至细胞中。中。 这种方法简单、效率较高，因而广泛应用于培养细这种方法简单、效率较高，因而广泛应用于培养细胞的基因转移。胞的基因转移。 将受体细胞悬浮于含有待转化将受体细胞悬浮于含

10、有待转化DNADNA的溶液中，在盛有的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细上述悬浮液的电击池两端施加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小的空洞达到增加通透性的效果；此时，胞膜产生细小的空洞达到增加通透性的效果；此时，外源外源DNADNA片段能片段能不经过胞饮作用不经过胞饮作用就能直接进入细胞质。就能直接进入细胞质。物理方法物理方法 （二（二) )微注射法微注射法 显微注射法主要用于制备转基因动物。基本操作显微注射法主要用于制备转基因动物。基本操作方法如下方法如下9-29-2。 通过通过激素疗法激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，然后处死雌鼠，

11、取出受精卵。然后借助于显微镜将纯然后处死雌鼠，取出受精卵。然后借助于显微镜将纯化的化的DNADNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内。将该受溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内。将该受精卵移植到另外一只假受孕母鼠的输卵管内，正常发精卵移植到另外一只假受孕母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。育、繁殖出转基因鼠。 拥有长寿基因的鼠拥有长寿基因的鼠 优点：优点：这种方法转入的基因长度可达数百这种方法转入的基因长度可达数百kbkb，并能随机地整合在受体细胞染色体，并能随机地整合在受体细胞染色体DNADNA上，上，因此应用范围广。因此应用范围广。 缺点：缺点：但是这种整合有时会导致转基因动但是这种整合有

12、时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。 ( (三三) )裸露裸露DNADNA直接注射法直接注射法 将裸露将裸露DNADNA直接注射到组织中，直接注射到组织中，DNADNA有可能直接被细有可能直接被细胞所摄入。胞所摄入。 这是最简单的基因转移方法。但是转移效率较低这是最简单的基因转移方法。但是转移效率较低 基因转移的化学方法主要包括：基因转移的化学方法主要包括：DEAEDEAE葡聚糖法葡聚糖法、磷酸钙磷酸钙DNADNA共沉淀法、脂质体载体包埋法等。共沉淀法、脂质体载体包埋法等。 主要原理：主要原理：通过改变细胞膜的通透性或者增加通过改变细胞膜

13、的通透性或者增加DNADNA与与细胞的吸附而实现基因的转移。细胞的吸附而实现基因的转移。 化学方法化学方法 ( (一一)DEAE)DEAE葡聚糖法葡聚糖法 最早的动物细胞转染方法最早的动物细胞转染方法； 主要是将主要是将外源外源DNADNA片段片段与与DEAEDEAE葡聚糖葡聚糖等高分子碳等高分子碳水化合物水化合物混合混合，这样，这样DNADNA链上带负电的磷酸骨架便被吸链上带负电的磷酸骨架便被吸附于附于DEAEDEAE正电荷基团上，从而形成正电荷基团上，从而形成DNADNA大颗粒。后者黏大颗粒。后者黏附于受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。附于受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。 该

14、方法的转化率较低。该方法的转化率较低。 （二）磷酸钙（二）磷酸钙-DNA-DNA共沉淀法共沉淀法 二价金属离子能促进细菌吸收外源二价金属离子能促进细菌吸收外源DNADNA 当核酸以当核酸以磷酸钙磷酸钙-DNA-DNA共沉淀物共沉淀物的形式存在时，细胞的形式存在时，细胞摄取摄取DNADNA的能力显著加强。的能力显著加强。 将将待转化的待转化的DNADNA溶解在溶解在磷酸根离子的缓冲液磷酸根离子的缓冲液中，此中，此时磷酸钙与时磷酸钙与DNADNA共沉淀形成大颗粒。加入受体细胞培养共沉淀形成大颗粒。加入受体细胞培养一段时间后，一段时间后，DNADNA就通过就通过脂相收缩时裂开的空隙脂相收缩时裂开的空

15、隙进入细进入细胞，或者在钙、磷的诱导作用下被细胞吞噬而进入细胞，或者在钙、磷的诱导作用下被细胞吞噬而进入细胞内，从而使外源胞内，从而使外源DNADNA整合到受体细胞中得到表达。整合到受体细胞中得到表达。 该方法的转染效率虽比该方法的转染效率虽比DEAEDEAE葡聚糖法高出约葡聚糖法高出约100100倍，但还是比较低，倍，但还是比较低，仅有仅有1 15 5的外源的外源DNADNA可以进入可以进入受体细胞核中，受体细胞核中，大约仅有大约仅有1 1的的DNADNA可以在细胞中稳定可以在细胞中稳定表达。表达。 （三）脂质体载体包埋法（三）脂质体载体包埋法 脂质体为人工膜泡，可作为体内外物质传送的裁脂质

16、体为人工膜泡，可作为体内外物质传送的裁体。体。 将将需转移的外源需转移的外源DNADNA或或RNARNA包裹于脂质体内，由于脂包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源受体细胞膜融合，从而将外源DNADNA转入宿主细胞。转入宿主细胞。 这种方法转基因效率高。这种方法转基因效率高。 将待转移的将待转移的DNADNA溶液与天然或人工合成的磷脂混合，溶液与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂存在的条件下形成后者在表面活性剂存在的条件下形成包埋水相包埋水相DNADNA的脂的脂质体结构。质体结构。 当

17、这种当这种脂质体脂质体悬浮液中加入到细胞培养皿中便悬浮液中加入到细胞培养皿中便会与会与受体细胞膜发生融合受体细胞膜发生融合，DNADNA片段随即进入细胞质和细胞片段随即进入细胞质和细胞核内核内， 基因转移的生物学方法主要是基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转病毒介导的基因转移移。根据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不。根据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转化载体。同感染途径的病毒基因组作为转化载体。 目前常用的病毒载体包括目前常用的病毒载体包括DNADNA病毒载体病毒载体( (腺病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体等牛痘病毒载体等) )、逆转录病毒载体逆

18、转录病毒载体等。等。生物学方法生物学方法 对于对于DNADNA病毒载体，以腺病毒载体为例。腺病毒基病毒载体，以腺病毒载体为例。腺病毒基因组因组DNADNA全长全长36kb36kb，其包装上限为原基因组的，其包装上限为原基因组的105105、即即37.8kb37.8kb。 优点优点 安全性好、不整合人染色体、不导致肿瘤发安全性好、不整合人染色体、不导致肿瘤发生、宿主范围广、对受体细胞分裂周期要求不严、外生、宿主范围广、对受体细胞分裂周期要求不严、外源基因在载体上容易高效表达。源基因在载体上容易高效表达。 逆转录病毒载体逆转录病毒载体是一种传染性病毒，含有是一种传染性病毒，含有RNARNA遗传遗传

19、物质，可将非病毒基因转移至分裂细胞。感染进细胞物质，可将非病毒基因转移至分裂细胞。感染进细胞的的RNARNA反转录产生反转录产生DNADNA互补链，该互补链，该DNADNA又可以作为合成第又可以作为合成第二条二条DNADNA链的模板。这两条链的模板。这两条DNADNA链可渗入受体细胞的基链可渗入受体细胞的基因组因组DNADNA中。之后，病毒利用宿主细胞的酶体系自行转中。之后，病毒利用宿主细胞的酶体系自行转录与复制、从而可以使病毒单拷贝基因组稳定地进宿录与复制、从而可以使病毒单拷贝基因组稳定地进宿主细胞。主细胞。 逆转录病毒载体可以获得稳定、有效的转染，可用逆转录病毒载体可以获得稳定、有效的转染

20、，可用于于不易转化的细胞或原代培养细胞。不易转化的细胞或原代培养细胞。 但是病毒载体也具有一些但是病毒载体也具有一些缺陷缺陷 如：如： 1 1、所有病毒载体都会诱导产生一定程度的、所有病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应免疫反应 2 2、或多或少存在一定的、或多或少存在一定的安全隐患安全隐患 3 3、转导能力有限转导能力有限，不适合大规模生产。，不适合大规模生产。 1 1、可以设计、可以设计含有抗药性基因的外源含有抗药性基因的外源DNADNA载体载体，然然后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。 2 2、可以通过提取转染细胞的、可以通过提取转染细胞的DNA

21、DNA，以适当限制性内切，以适当限制性内切酶酶切后进行酶酶切后进行SouthernSouthern转移分析，检验细胞中是否有转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源基因。被转移的外源基因。9.1.2 9.1.2 转染细胞的鉴定转染细胞的鉴定 9.2.1 9.2.1 定义与发展历史定义与发展历史 转基因动物转基因动物是指在基因组内稳定地整合以实验方是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。后代的遗传工程动物。9.2 9.2 转基因动物转基因动物 1974 1974年，年， JaenishJaeni

22、sh和和MintzMintz应用显微注射法，在世应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了界上首次成功地获得了AV40 DNAAV40 DNA转基因小鼠。转基因小鼠。 19801980年，年，GordonGordon等人首先育成带有等人首先育成带有人胸苷激酶基因人胸苷激酶基因的转基因小鼠。的转基因小鼠。 PalmiterPalmiter等人于等人于19821982年将年将大鼠的生长激素基因大鼠的生长激素基因导入导入小鼠受精卵的雄原核中，获得了比普通对照小鼠生长小鼠受精卵的雄原核中，获得了比普通对照小鼠生长速度快速度快2-42-4倍、体形大一倍的转基因倍、体形大一倍的转基因“硕鼠硕鼠”，从此转从此

23、转基因动物技术轰动了整个生命科学界。基因动物技术轰动了整个生命科学界。 它使人们看到了利用此技术在它使人们看到了利用此技术在建立人类疾病动物模建立人类疾病动物模型型、加速动物育种加速动物育种、研究真核生物基因表达调控机制研究真核生物基因表达调控机制，以及在哺乳动物特异组织系统内生产人的药用蛋白等以及在哺乳动物特异组织系统内生产人的药用蛋白等方面令人鼓舞的前景。方面令人鼓舞的前景。 在随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，在随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因牛和转基因基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因牛和转基因山羊山羊陆续育成陆续育成 除哺乳动物

24、外，科学家还分别合成了除哺乳动物外，科学家还分别合成了转基因鱼、转转基因鱼、转基因鸡基因鸡，这些开创性的工作使人们可以从分子、细胞，这些开创性的工作使人们可以从分子、细胞和个体多水平层次，从发育时间和组织生理空间多角和个体多水平层次，从发育时间和组织生理空间多角度、立体地研究基因的功能，使人类按照自己的意愿度、立体地研究基因的功能，使人类按照自己的意愿修正和改造物种。修正和改造物种。 9 92 22 21 1 原理与方法原理与方法 随着分子生物学与哺乳动物胚胎操作技术的不断随着分子生物学与哺乳动物胚胎操作技术的不断发展，将发展，将外源目的基因导入早期胚胎培育转基因动物外源目的基因导入早期胚胎培

25、育转基因动物已经由可能变成了现实已经由可能变成了现实。 以动物个体为受体的转基因技术首先是从小鼠开始以动物个体为受体的转基因技术首先是从小鼠开始的，的，转基因小鼠转基因小鼠为研究特定基因及其表达调控机制提为研究特定基因及其表达调控机制提供了独特的供了独特的实验模型实验模型。 但就经济效益而言，大型家畜动物的转基因动物更但就经济效益而言，大型家畜动物的转基因动物更具有开发价值。具有开发价值。9 92 22 2 转基因动物的制备转基因动物的制备 基于基因工程的基本原理与技术方法，生产转基因基于基因工程的基本原理与技术方法，生产转基因动物的关键技术包括：动物的关键技术包括： 外源目的基因的制备；外源

26、目的基因的制备； 外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞；外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞； 选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物；选择合适的体外培养系统和宿主动物； 转基因细胞胚胎发育及鉴定；转基因细胞胚胎发育及鉴定； 筛选所得的转基因动物品系。筛选所得的转基因动物品系。 转基因动物研究的核心技术是转基因动物研究的核心技术是如何成功地把目的如何成功地把目的基因转入动物早期胚胎细胞中。基因转入动物早期胚胎细胞中。 主要方法：主要方法： 基因显微注射法基因显微注射法 胚胎干细胞移植法胚胎干细胞移植法 反转录病毒感染法反转录病毒感染法

27、 精子载体导入法精子载体导入法 （一）原核期胚胎显微注射法（一）原核期胚胎显微注射法 基因显微注射法是由美国人基因显微注射法是由美国人GordonGordon发明的发明的, ,也是一也是一种比较经典、应用比较广泛、效果比较稳定的转基因种比较经典、应用比较广泛、效果比较稳定的转基因导入方法。导入方法。 首例表达首例表达人胸苷激酶基因人胸苷激酶基因、人生长激素基因的转基、人生长激素基因的转基因小鼠都是利用这种方法获得成功的。因小鼠都是利用这种方法获得成功的。 目前采用这种方法已成功培育出转基因小鼠、猪、目前采用这种方法已成功培育出转基因小鼠、猪、绵羊、免和牛。绵羊、免和牛。 基本原理是：基本原理是

28、： 通过显微操作仪将外源基因直接用注射器通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注注入受精卵入受精卵( (雄原核内雄原核内) )，利用受精卵繁殖中，利用受精卵繁殖中DNADNA的复制过程，将外源基因整合到的复制过程，将外源基因整合到DNADNA中，再发中，再发育成转基因动物。育成转基因动物。 具体而言，基因显微注射法主要包括以下几具体而言，基因显微注射法主要包括以下几个步骤：个步骤： (1)DNA(1)DNA的制备与纯化的制备与纯化 (2) (2)动物的挑选、超排卵与取卵动物的挑选、超排卵与取卵 (3)DNA (3)DNA的显微注射的显微注射 (4) (4)卵的转移卵的转移 (5) (5)转基因动

29、物的获得转基因动物的获得 （二）反转录病毒感染法（二）反转录病毒感染法 反转录病毒的核酸为一条反转录病毒的核酸为一条单链单链RNARNA分子分子。病毒进入细胞后，。病毒进入细胞后，RNARNA首先编码出反转录酶，在酶作用下，病毒首先编码出反转录酶，在酶作用下，病毒RNARNA反转录为双链分反转录为双链分子，子，DNADNA通过一种尚未明确的机制整合列宿主细胞通过一种尚未明确的机制整合列宿主细胞DNADNA中。中。方法方法: : 1) 1)将目的基因重组到反转录病毒载体上，人为感染着床前或着将目的基因重组到反转录病毒载体上，人为感染着床前或着床后的胚胎，床后的胚胎， 2) 2)直接将胚胎与能释放

30、反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染目的，就可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因到感染目的，就可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组组DNADNA中。中。 由于反转录病毒的由于反转录病毒的高效率感染高效率感染和在宿主细胞和在宿主细胞DNADNA上上的的高度整合特性高度整合特性，借此可以大大提高基因转移的效率。，借此可以大大提高基因转移的效率。 应用该方法已成功培育出转基因鸡和牛。应用该方法已成功培育出转基因鸡和牛。 胚胎干细胞胚胎干细胞(ES)(ES)是从是从早期胚胎内细胞团早期胚胎内细胞团(1cM)(1cM)中分中分离出来的

31、，能在体外培养的一种高度离出来的，能在体外培养的一种高度未分化未分化的多能细的多能细胞。在某种意义上也可以说，它是一种含正常二倍染胞。在某种意义上也可以说，它是一种含正常二倍染色体的具有色体的具有发育全能性发育全能性的细胞，能分化为成体动物的的细胞，能分化为成体动物的所有组织所有组织( (包括生殖细胞包括生殖细胞) )。 在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞、当被注在发育上类似于早期胚胎的内细胞团细胞、当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。体的形成。 因此只要将外源因此只要将外源DNADNA导入胚胎干细胞就可以实现基因导入胚

32、胎干细胞就可以实现基因的转移。的转移。( (三三) )胚胎干细胞方法胚胎干细胞方法 以胚胎干细胞作为外源基因引入的载体有以胚胎干细胞作为外源基因引入的载体有许多方法，包括：脂质体转染、原生质体融合许多方法，包括：脂质体转染、原生质体融合等。还可以如图等。还可以如图9-69-6所示的那样，所示的那样， 外源外源DNADNA转化转化ESES细胞后再通过核移植产生转细胞后再通过核移植产生转基因动物基因动物， 也可以也可以通过聚合法或注射法产生嵌合体通过聚合法或注射法产生嵌合体，经，经过嵌合体的繁育获得转基因动物。过嵌合体的繁育获得转基因动物。 利用利用ESES细胞途径获得转基因动物的关键之处是细胞途

33、径获得转基因动物的关键之处是ESES细胞的分离和获得细胞的分离和获得。 当外源基因移入到当外源基因移入到ESES细胞基因组后，既能高效稳定细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响表达，又不影响ESES细胞的各种功能。细胞的各种功能。ESES细胞不仅使转细胞不仅使转基因的成功率大大提高，而且使基因剔除、基因诱捕基因的成功率大大提高，而且使基因剔除、基因诱捕等技术成为可能。等技术成为可能。 采用胚胎干细胞方法和胚胎移植技术实现采用胚胎干细胞方法和胚胎移植技术实现转基因动转基因动物制备的基本具体步骤物制备的基本具体步骤 1 1、从胚胎分离出胚胎干细胞，通过转录将外源基因、从胚胎分离出胚胎干细胞，通过

34、转录将外源基因导入细胞内，再将其转入到植入前胚胎的胚泡腔。导入细胞内，再将其转入到植入前胚胎的胚泡腔。 2 2、这些带有外源基因的胚胎干细胞可嵌入宿主囊胚、这些带有外源基因的胚胎干细胞可嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育、出生的动物其生殖系统的内细胞团中参与胚胎发育、出生的动物其生殖系统就有可能整合上外源基因就有可能整合上外源基因 3 3、 通过杂交繁育就可得到具有纯合目的基因的个通过杂交繁育就可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。体，即转基因动物。 ( (四四) )精子载体法精子载体法 由于显微注射技术的效率很低，加之设备昂贵，由于显微注射技术的效率很低，加之设备昂贵，因此人们一直在

35、试图寻找一种简单、有效和广泛适用因此人们一直在试图寻找一种简单、有效和广泛适用的方法将外源基因导入到任意种类动物的方法将外源基因导入到任意种类动物( (如哺乳类、禽如哺乳类、禽类及鱼类类及鱼类) )的基因组内。的基因组内。 精子载体法精子载体法是一种直接用精子作为外源是一种直接用精子作为外源DNADNA载体的转载体的转移方法。移方法。 基本原理和方法是：精子直接与外源基本原理和方法是：精子直接与外源DNADNA混合培养，混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。转基因动物。 后来罗特曼后来罗特曼(Rottman)(Rott

36、man)对此方法进行了改进，将外对此方法进行了改进，将外源源DNADNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNADNA相互作用形成脂质体相互作用形成脂质体DNADNA复合物。这种复合体比复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。 我国学者使用我国学者使用阳离子脂质体介导技术阳离子脂质体介导技术进行操作，方进行操作，方便、重复性好、转染率高。尽管该方法的可靠性尚有便、重复性好、转染率高。尽管该方法的可靠性尚有争论，但是由于它的经济性与方便性，许多研究者在争论，但是由于它的经济性与方便性，许多研

37、究者在进行该方法的改进工作。进行该方法的改进工作。 （五）人工酵母染色体法（五）人工酵母染色体法 人工酵母染色体是近年来才发展起来的一种新型人工酵母染色体是近年来才发展起来的一种新型载体，具有克隆百万碱基对级的大片段载体，具有克隆百万碱基对级的大片段DNADNA的能力。的能力。 19921992年人们采用该方法获得了具有百万碱基对外源年人们采用该方法获得了具有百万碱基对外源DNADNA的转基因小鼠。的转基因小鼠。 这种方法最明显的优点是可以保证巨大基因的完整这种方法最明显的优点是可以保证巨大基因的完整性及较长外源基因片段在转基因动物中的较高的整合性及较长外源基因片段在转基因动物中的较高的整合率

38、。率。 ( (六六) )受精前卵细胞显微注射法受精前卵细胞显微注射法 受精前卵细胞显微注射法是将外源基因克隆至反受精前卵细胞显微注射法是将外源基因克隆至反转录病毒载体，然后将这一携带外源目的基因的缺陷转录病毒载体，然后将这一携带外源目的基因的缺陷型反转录病毒通过显微注射技术，注入到受精前卵细型反转录病毒通过显微注射技术，注入到受精前卵细胞的卵周腔，然后再体外受精，培养至囊胚期，移入胞的卵周腔，然后再体外受精，培养至囊胚期，移入假孕的雌性动物子宫内发育。假孕的雌性动物子宫内发育。 这种方法的优点主要体现在以下两个方面：这种方法的优点主要体现在以下两个方面： (1)(1)目前大型动物转基因普遍采用

39、原核显微注射法，目前大型动物转基因普遍采用原核显微注射法，但是大型动物受精卵的原核不如小鼠等的清晰可见，但是大型动物受精卵的原核不如小鼠等的清晰可见，因此给显微注射带来极大不便。目前采用离心等方法因此给显微注射带来极大不便。目前采用离心等方法显现原核，效果也不理想。而采用受精前卵细胞显微显现原核，效果也不理想。而采用受精前卵细胞显微注射法就可能避免这一难题。注射法就可能避免这一难题。 能使首代转基因动物阳性率显著提高。而且，由能使首代转基因动物阳性率显著提高。而且，由于仅需将外源基因注射进卵细胞周腔即可，不需刺于仅需将外源基因注射进卵细胞周腔即可，不需刺破细胞质膜及原核膜，所以对卵造成的机械损

40、伤极破细胞质膜及原核膜，所以对卵造成的机械损伤极小，因此注射后的卵细胞成活率显著提高。小，因此注射后的卵细胞成活率显著提高。 (2)(2)与传统的反转录病毒法相比，这种方法也有了明与传统的反转录病毒法相比，这种方法也有了明显改进：显改进： 首先，选用受精前卵细胞作为外源基因的转入点，首先，选用受精前卵细胞作为外源基因的转入点，让让外源基因比精子染色质先进入卵细胞外源基因比精子染色质先进入卵细胞，这样，只要，这样，只要发生外源基因的整合，每一个细胞都会携带外源基发生外源基因的整合，每一个细胞都会携带外源基因从而避免了嵌合体动物的产生。因从而避免了嵌合体动物的产生。 其次，由于在体外培养的卵细胞在

41、其次，由于在体外培养的卵细胞在MM期包裹染色期包裹染色体的核膜会暂时消失，因此在这个时候进行外源基因体的核膜会暂时消失，因此在这个时候进行外源基因转入，可大大提高外源基因进入核内与核染色体接触转入，可大大提高外源基因进入核内与核染色体接触的机会。的机会。 第三，受精前卵细胞比受精卵和早期胚胎更易转染第三，受精前卵细胞比受精卵和早期胚胎更易转染反转录病毒，因此可以提高外源基因的整合率。反转录病毒，因此可以提高外源基因的整合率。 （七）其他方法（七）其他方法 除了以上方法之外，动物的转基因技术还有电除了以上方法之外，动物的转基因技术还有电脉脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰冲法、染色

42、体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、原生质细胞介导的转基因技术、基因剔除和基击法、原生质细胞介导的转基因技术、基因剔除和基因嵌入因嵌入等。这些方法大多具有一些特殊的优势。等。这些方法大多具有一些特殊的优势。 9 92 22 22 2转基因动物鉴定技术转基因动物鉴定技术 早期采用的、也是目前具有权威性的转基因动物早期采用的、也是目前具有权威性的转基因动物鉴定技术是鉴定技术是southern blottingsouthern blotting。 具体步骤是：提取待检动物组织的染色体具体步骤是：提取待检动物组织的染色体( (一般选一般选择导入基因中的单一限制酶位点择导入基因中的单一限制酶位点)

43、 )，消化后电泳，转膜，消化后电泳，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。果。 该方法的优点是结果可靠，但缺点是工作量大、操该方法的优点是结果可靠，但缺点是工作量大、操作繁琐。作繁琐。 另外一种比较常见的方法是另外一种比较常见的方法是斑点杂交；斑点杂交；主要步骤主要步骤包括：动物包括：动物DNADNA的提取、点于硝酸纤维素膜、探针杂交、的提取、点于硝酸纤维素膜、探针杂交、放射自显影。放射自显影。 优点：操作简便，优点：操作简便， 缺点：当动物体内整合的外源基因与内源基因有同缺点：当动物体内整合的外源基因与内源基因有同源时，往往出现假

44、阳性。另外由于提取的染色体源时，往往出现假阳性。另外由于提取的染色体DNADNA浓浓度较高，杂交效果往往不十分理想。因此这种方法用度较高，杂交效果往往不十分理想。因此这种方法用于转基因动物的筛选并不多。于转基因动物的筛选并不多。 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)技术技术在分子生物学领域中的应在分子生物学领域中的应用使转基因动物的筛选工作大大简化。用使转基因动物的筛选工作大大简化。 只需设计一对特异性引物，以组织提取的只需设计一对特异性引物，以组织提取的DNADNA为模为模板进行板进行PCRPCR扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以扩增，通过对扩增产物进行序列分析就可以实现转基

45、因动物的鉴定。实现转基因动物的鉴定。 缺点：有时也会存在假阳性，对筛选工作影响较大，缺点：有时也会存在假阳性，对筛选工作影响较大，必须加以克服。必须加以克服。 除了以上方法，近年来不断出现一些新技术。例如，除了以上方法，近年来不断出现一些新技术。例如，可用可用染色体原位杂交的方法染色体原位杂交的方法鉴定转基因猪，虽然操作鉴定转基因猪，虽然操作比较繁琐、但其独到之处是可确定出外源基因在染色比较繁琐、但其独到之处是可确定出外源基因在染色体上的整合位点以及整合状态。体上的整合位点以及整合状态。 转基因动物技术是在转基因动物技术是在2020世纪世纪8080年代初发展起来的。年代初发展起来的。从这项技术

46、诞生的那天起，它就在从这项技术诞生的那天起，它就在改良畜禽生产性状改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品产品( (如人类药用蛋白如人类药用蛋白) )等方面显示出了广阔的应用前等方面显示出了广阔的应用前景。景。 9.2.2 9.2.2 转基因动物技术的意义与最新进展转基因动物技术的意义与最新进展 转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰。状的可遗传修饰。 转基因动物就是

47、基因组中含有外源基因的动物。通转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。通过过生长素基因、多产基因、高泌乳量基因、瘦肉型基生长素基因、多产基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因等基因转移，可能育成转移，可能育成生长周期短生长周期短、产仔、生蛋多、泌乳量、产仔、生蛋多、泌乳量高或抗病性强的动物高或抗病性强的动物 目前转基因技术已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动目前转基因技术已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果物中取得一定成果9.2.2 9.2.2 转基因动物技术的意义与最新进展转基因动物技术的意义与最新进展荧光鼠荧

48、光鼠20072007年末，荧光鼠脑细胞的图年末，荧光鼠脑细胞的图片传遍世界各地，从片传遍世界各地，从“福利客福利客”超超市的宣传海报到市的宣传海报到“自然自然”杂志的封杂志的封面。这些五彩斑斓的脑细胞是单个面。这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。英国将它们区分开来。英国哈佛大学哈佛大学的的杰夫杰夫- -里奇曼里奇曼为首的科研小组在实为首的科研小组在实验鼠的基因组中验鼠的基因组中导入水母的绿色荧导入水母的绿色荧光蛋白基因光蛋白基因，使其在紫色光线的照，使其在紫色光线的照射下呈现出绿色荧光。这种绿色荧射下呈现出绿色荧光。这种绿色荧光

49、基因对小鼠无害，只起到标记作光基因对小鼠无害，只起到标记作用。用。十大神奇转基因动物十大神奇转基因动物这种转基因山羊是独一无二的，因为它们能产生普通的这种转基因山羊是独一无二的，因为它们能产生普通的蜘蛛丝。这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。蜘蛛丝。这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。很多科学家把蜘蛛丝叫做很多科学家把蜘蛛丝叫做“生物钢生物钢”，有着超强的，有着超强的抗张强度。研究人员称，如果把很多蜘蛛丝拧成一股绳抗张强度。研究人员称，如果把很多蜘蛛丝拧成一股绳的话，它足够强韧，可制成的话，它足够强韧，可制成防弹背心、降落伞绳防弹背心、降落伞绳，或者，或者从飞机到航母等设备。从飞机

50、到航母等设备。 蜘蛛丝还可被制成蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造韧带和人造腱人造腱，支撑组织、骨骼和神经细胞，让它们在生长期，支撑组织、骨骼和神经细胞，让它们在生长期间保持稳定。随着细胞的逐渐生长，这些人造丝部分会间保持稳定。随着细胞的逐渐生长，这些人造丝部分会逐渐分解。逐渐分解。帮助帮助“生产生产”这些山羊的怀俄明大学分子生物学家这些山羊的怀俄明大学分子生物学家兰迪兰迪- -刘易斯说：刘易斯说：“从概念上讲，这个过程非常简单。从概念上讲，这个过程非常简单。用于用于丝蛋白的蜘蛛丝基因丝蛋白的蜘蛛丝基因与控制蛋白质构成组织的山羊与控制蛋白质构成组织的山羊的的DNADNA有关。在这种情况下，它是乳腺

51、，只形成于哺乳有关。在这种情况下，它是乳腺，只形成于哺乳期。然后，细胞与卵结合生成胚胎，胚胎有着合成其期。然后，细胞与卵结合生成胚胎，胚胎有着合成其DNADNA的基因。当母羊开始分泌乳汁时丝蛋白就产生了的基因。当母羊开始分泌乳汁时丝蛋白就产生了十大神奇转基因动物十大神奇转基因动物蜘蛛羊蜘蛛羊 美国研究人员通过一项新技术，使得老鼠具有了美国研究人员通过一项新技术，使得老鼠具有了抵抗各种癌症的能力，而这个科学突破将使癌症患者抵抗各种癌症的能力，而这个科学突破将使癌症患者有望接受无副作用的治疗。有望接受无副作用的治疗。这些老鼠内这些老鼠内产生的一种蛋白质产生的一种蛋白质是未来疗法的关键，是未来疗法的

52、关键，它能消灭肿瘤细胞，却不会伤害体内的健康组织。通它能消灭肿瘤细胞，却不会伤害体内的健康组织。通常情况下，一般的癌症治疗会使患者出现疼痛、恶心常情况下，一般的癌症治疗会使患者出现疼痛、恶心和掉头发等情况。科学家们希望有朝一日把这种蛋白和掉头发等情况。科学家们希望有朝一日把这种蛋白质用于癌症患者身上，使他们摆脱这些痛苦。质用于癌症患者身上，使他们摆脱这些痛苦。这个突破取决于一种叫这个突破取决于一种叫Par-4Par-4的老鼠基因的老鼠基因，它生，它生产这种蛋白质。研究人员让一组老鼠拥有比正常情况产这种蛋白质。研究人员让一组老鼠拥有比正常情况下更多的蛋白质。后来他们发现，这些老鼠对许多癌下更多的

53、蛋白质。后来他们发现，这些老鼠对许多癌症类型产生免疫力，像症类型产生免疫力，像肝癌和前列腺癌等。测试显示，肝癌和前列腺癌等。测试显示，这种蛋白质还能抵抗乳腺癌、胰腺癌和头颈癌这种蛋白质还能抵抗乳腺癌、胰腺癌和头颈癌等。美等。美国的这些科学家们表示，至关紧要的一点是这些老鼠国的这些科学家们表示，至关紧要的一点是这些老鼠没有出现任何明显的副作用。没有出现任何明显的副作用。十大神奇转基因动物十大神奇转基因动物抗癌老鼠抗癌老鼠翡翠海参看起来更像一片树叶，而不是黏翡翠海参看起来更像一片树叶，而不是黏滑的腹足软体动物，但它却是已知第一种在自滑的腹足软体动物，但它却是已知第一种在自然演化过程中发生转基因现象

54、的物种。能够利然演化过程中发生转基因现象的物种。能够利用用水藻食物中的叶绿体进行光合作用水藻食物中的叶绿体进行光合作用以产生能以产生能量。没有任何其他动物能够这样利用叶绿体。量。没有任何其他动物能够这样利用叶绿体。朗波研究发现朗波研究发现海参中的一种基因海参中的一种基因与水藻中与水藻中具有光合作用的基因类似，这表明在过去的漫具有光合作用的基因类似，这表明在过去的漫长岁月中，长岁月中，该基因或许通过自然进化的方式从该基因或许通过自然进化的方式从水藻转移到海参的水藻转移到海参的DNADNA中中。虽然目前还很难证实。虽然目前还很难证实海参身上的这种基因转移，但朗波仍表示海参身上的这种基因转移，但朗波

55、仍表示“我我们正致力于探究这种转移是如何发生的们正致力于探究这种转移是如何发生的”，这，这将有利于科学家探索动植物间的基因转移是否将有利于科学家探索动植物间的基因转移是否会发生在其他的物种上会发生在其他的物种上十大神奇转基因动物十大神奇转基因动物翡翠海参翡翠海参20032003年，美国得克萨斯的一家公司宣布，经年，美国得克萨斯的一家公司宣布，经过转基因技术他们已经研制出能发荧光的小型过转基因技术他们已经研制出能发荧光的小型热带鱼热带鱼“荧光鱼荧光鱼”。这种。这种“光芒四射光芒四射”的的红色荧光鱼，是利用转基因技术得到红色荧光鱼，是利用转基因技术得到商标注册商标注册的第一种商业性荧光宠物鱼的第一

56、种商业性荧光宠物鱼。改基因后的斑马。改基因后的斑马鱼散发出粉红色荧光，远看像金鱼一样。目前，鱼散发出粉红色荧光，远看像金鱼一样。目前，公司以公司以GloFishGloFish的商标对的商标对红色荧光鱼红色荧光鱼进行了注册，进行了注册，这标志着转基因荧光鱼可以被当作家庭宠物出这标志着转基因荧光鱼可以被当作家庭宠物出售。售。斑马鱼是一种常见的观赏鱼，身上有黑白斑马鱼是一种常见的观赏鱼，身上有黑白相间的条纹。荧光斑马鱼被分别转入了相间的条纹。荧光斑马鱼被分别转入了水母绿水母绿色荧光蛋白色荧光蛋白或者或者珊瑚虫红色荧光蛋白珊瑚虫红色荧光蛋白的基因，的基因，在紫外线的照射下，能够发出绿光或红光。荧在紫外

57、线的照射下，能够发出绿光或红光。荧光鱼作为观赏鱼在市场上销售，是第一种上市光鱼作为观赏鱼在市场上销售，是第一种上市的转基因动物。的转基因动物。十大神奇转基因动物十大神奇转基因动物荧光鱼荧光鱼一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重长、拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重美国科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引美国科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于起人们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，改善人类的能力？人类，改善人类的能力？研究者将高

58、度活跃的研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量乳酸。乳酸。科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也能跑能跑4 4到到5 5个小时。这种老鼠最多能以每分钟个小时。这种老鼠最多能以每分钟2020米的速米的速度奔跑度奔跑6 6公里，也就是说，公里，也

59、就是说，它能连续不间断奔跑它能连续不间断奔跑5 5个小个小时甚至更多。时甚至更多。科学家说，这相当于一个人不间断地高科学家说，这相当于一个人不间断地高速骑自行车翻越阿尔卑斯山，只有人类顶级运动员可速骑自行车翻越阿尔卑斯山，只有人类顶级运动员可以做到，比如环法自行车赛七冠王兰斯以做到，比如环法自行车赛七冠王兰斯- -阿姆斯特朗。阿姆斯特朗。十大神奇转基因动物十大神奇转基因动物超级老鼠超级老鼠近年来，全世界科学家都在努力研究转基因蚊子，近年来，全世界科学家都在努力研究转基因蚊子，以降低其对人类的危害。以降低其对人类的危害。伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，伦敦帝国学院的科研小组培育了一种

60、转基因蚊子，其中的雄性具有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其其中的雄性具有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。不育。研究者称，可以将大量这样的转基因蚊子放到研究者称，可以将大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的产卵量，从而慢野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能力，慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。所以不会将基因遗传给野生蚊子。美国科学家通过基因改造，在实验室中培育出了美国科学家通过基因改造，在实验室中培育出了一种蚊子，它具备了不再感染疟疾的能力，将这些蚊一种蚊子，它具备了不再感染疟疾