分子克隆工具酶及其应用PPT课件

1、分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用 限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。第1页/共74页第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第2页/共74页 一一 . 限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现 1. 细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现 Werner A

2、rber于于1962-1968年发现，年发现，1968年分离年分离到到I型限制酶。型限制酶。 2. 限制酶限制酶HindII的发现的发现 HOSmith 和和Wilox 于于1970年首次从流感嗜血年首次从流感嗜血杆菌（杆菌（H. influenzae）中发现并分离到）中发现并分离到HindII限制限制酶。酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用年）用HindII绘制绘制SV40的限制的限制酶谱。酶谱。 第3页/共74页二二 . 限制修饰系统的种类限制修饰系统的种类1. I型型：由三个基因构成，由三个基因构成，hsdR；hsd

3、M；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。腺苷甲硫氨酸）。2. II型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在. coli中这两种基因位于质粒上。中这两种基因位于质粒上。3. III型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，hsd与与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。

4、 上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。基因工程中。 第4页/共74页 三三. 限制性内切酶的定义、命名限制性内切酶的定义、命名 1. 定义定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指狭义指II型限制酶。型限制酶。 2. 命名命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。菌系编号、分离顺序。例如：例如：Hind前三个字母来自于菌种前三个字母来自于菌种名称名称H. influenzae，

5、“”表示菌系为表示菌系为型血清型；型血清型；“”表示分离到的第三个限表示分离到的第三个限制酶。制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I ()第5页/共74页四限制酶的特点四限制酶的特点 1. 识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点 ）识别）识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N

6、N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外侧，产生外侧，产生-端端突起突起 ）富含）富含第6页/共74页 ）对称性）对称性双对称双对称 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 ）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和- 2. 末端种类末端种类 ）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACG

7、TC-5 ）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5第7页/共74页 ） 平齐末端平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端 ）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaI A

8、vaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG 第8页/共74页）相容性末端）相容性末端如：如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和和Sau3AI识别和酶切，但识别和酶切，但BamHI和和BglII的识别机率只有的识别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容

9、性末端，相连后不能为两种酶所识别两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 不同末端的连接特性不同末端的连接特性: 除第除第4 4种末端不能进行不同种末端不能进行不同DNA分分子或同种子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余分子不同切点产生的末端相连外，其余4 4种种末端可以相互连接。末端可以相互连接。第9页/共74页五五. 异源同序酶（异源同序酶（isoschizomer，同裂，同裂酶）酶） 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制种限制 酶酶 2. 特点：特

10、点：1）识别相同顺序）识别相同顺序 2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 限制酶的星反应（限制酶的星反应（star activity） 1. 特点特点: 限制酶识别序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低 2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）发生星反应的限制酶和条件（见下页） 3. 星反应的利用和避免星反应的利用和避免第10页/共74页表表1 1 具有星反应的限制性内切酶与条件具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件限制酶诱发星活性的条件a a识别序列识别序列AvaAvaI

11、1, 2, 4I 1, 2, 4BamBamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCCHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCCBstBstI 2, 4I 2, 4BsuBsuI 2, 4, 6I 2, 4, 6EcoEcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTNRI 1, 2, 4 - 6 N AATTNHaeHae 2, 4 2, 4HhaHhaI 2, 4, 7I 2, 4, 7HinHind 6d 6HpaHpaI 1, 2, 4I 1, 2, 4PstPstI 1, 2, 4, 7I 1, 2, 4, 7PvuPvu 2, 4 2, 4SalSal

12、I 1, 2, 4, 7I 1, 2, 4, 7ScaScaI 4 - 6, 8 I 4 - 6, 8 SstSst 2, 4 2, 4XbaXbaI 2, 4, 7I 2, 4, 7a.1a.1：亚乙二醇：亚乙二醇(45%)(45%)；2:2:甘油甘油(12%)(12%)；3 3：乙醇：乙醇(12%)(12%)；4 4：高酶：高酶/DNA/DNA比比(25U/g)(25U/g)； 5：Mn+代替代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜二甲基亚砜(8%); 8:无无NaCl。 第11页/共74页七七. 其它特异性的内切酶及其用途其它特异性的内切酶及其用途 1. 末端酶（末端酶（ termi

13、nase）：）： 5-GGGCGGCGACCTN-3 N-5，出现的频率约，出现的频率约412 分子量为分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000） 2. Omega核酸酶（核酸酶（I-SceI）：）： 由内含子编码，用于由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为其识别顺序为 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 3. I-PpoI：来自于来自于Physarum polycephalum 识别序列：识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT 4. 用途

14、用途 遗传标记，遗传标记， 构建载体构建载体第12页/共74页八八. 限制酶的用途限制酶的用途 1. DNA重组重组 2. 限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（突变分析（RFLP分析）分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切附：附：IIS型限制酶的特点型限制酶的特点 1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。具有对称结构。 2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，点的一侧，1- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反

15、应。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4. 产生粘性末端可以是产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。个核苷酸。 5. 均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108 kD。第13页/共74页 第二节第二节 DNA 甲甲 基基 化化 酶酶 第14页/共74页一一. 甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序 1. 限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：甲基腺嘌呤： 在在DNA重

16、组实验中，常用的甲基化酶属于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同相同第15页/共74页 2. Ecoli 的的dam、dcm甲基化酶甲基化酶 这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。饰系统。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG 3. 哺乳动物

17、的甲基化酶哺乳动物的甲基化酶 该酶可使该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。复制、基因转录等过程有关。 4. Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）第16页/共74页二二. 甲基化酶活性对限制酶活性的影响甲基化酶活性对限制酶活性的影响 1. dcm 和和dam甲基化酶对限制酶的影响甲基化酶对限制酶的影响 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还

18、是边界重叠重叠 如：完全重叠如：完全重叠 BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG) 边界重叠边界重叠 ClaI-dam； Sau96I-dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 如：如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm-BstNI第17页/共74页表表2 2 对甲基化敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列* * 甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG (A/T)GG dcmdcmBclB

19、cl T TGATCGATCA A dam dam ClaCla G GATCATCGATGAT dam dam EcoEcoR R CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmHphHph GGTGGTGAGATCTC dam damMboMbo GATCGATC dam damNruNru GAGATCTCGCGAGCGA dam damSauSau96 96 GGNGGNCCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmSauSauF F CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmStuStu AGGAGGCCTCCTGGGG dcmdcmTagTag GATCGATCGA

20、 damGA damXbaXba TCTATCTAGAGATCTC dam dam * *下横线字母表示限制酶识别序列下横线字母表示限制酶识别序列, , 绿色字母表示绿色字母表示damdam甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列, ,红色红色字母表示字母表示dcmdcm甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列第18页/共74页 2. II型甲基化酶对限制酶活性的影响型甲基化酶对限制酶活性的影响 ） 抑制同种限制酶的活性抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCCBamHI(G GATCC)M.EcoRI GAmATTCEcoRI(G AATTC) ） 抑制不同种限制酶的活性抑制不同种限制酶的活性 a

21、. 顺序完全重叠顺序完全重叠 如：如：M. ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA） b. 顺序边界重叠顺序边界重叠 如：如：M. BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG） ） 抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的部分活性 MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3. 甲基化酶的用途甲基化酶的用途 ） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ） 在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制

22、酶切分子部分甲基化，然后再用限制酶切第19页/共74页表表3 3 甲基化酶与识别序列甲基化酶与识别序列甲基化酶甲基化酶 识别序列识别序列a a 受甲基化影响的限制酶受甲基化影响的限制酶b b M.Alu AG M.Alu AGmCT CT Alu Alu, , BamBamH, H, BspBsp12861286 DdeDde,HgiHgiA, A, NheNhe, Pst Pst M.BamH GGAT M.BamH GGATmCC CC BamBamH, H, MspMsp M.Cla ATCG M.Cla ATCGmAT AT Cla Cla, , MboMbo, , TaqTaq da

23、m G dam GmATCATC c c dcm CCA/TGG dcm CCA/TGG c c M.EcoR GA M.EcoR GAmATTC ATTC EcoEcoRR M.HI M.HId d GCNGC GG GCNGC GGmCC CC MstMst, , PstPst, , PvuPvu M.Hae GG M.Hae GGmCC CC BanBan,BglBgl,BspBsp1286,1286,BstBstX,X,HaeHae, , MspMsp,NaeNae,NcoNco,SacSac, , SauSau9696 M.Hha G M.Hha GmCGC CGC AhaAha,

24、, FnuFnuD, D, HhaHha M.Hpa C M.Hpa CmCGG CGG AhaAha,AvaAva,AvaAva,HpaHpa,ScrScrFF M.Hph T M.Hph TmCACC CACC HinHinf, f, HphHph, , SauSau3A3A M.Msp M.Msp mCCGG CCGG BamBamH,H, Msp Msp M.Pst CTGC M.Pst CTGCmAG AG AluAlu, , PstPst M.Taq TCG M.Taq TCGmA A AluAluI, I, AvaAva, , EcoEcoRV, RV, HinHinC, C,

25、HinHinf,f, MboMbo, , TaqTaq, , XmnXmna.a.标在碱基的左上角的标在碱基的左上角的m m表示该碱基被甲基化表示该碱基被甲基化; b.; b.所列出的限制酶均已商品化所列出的限制酶均已商品化; c.; c.参见表参见表2; 2; 分离分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGCGCNGC的甲基化位点尚未确定。的甲基化位点尚未确定。第20页/共74页M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建

26、立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE第21页/共74页第三节第三节核核 酸酸 酶酶 第22页/共74页ds-DNA结构结构: 切口切口, 缺口缺口, 断口断口缺口缺口(gap) 切口切口(nick) 断口断口(cut)3HO P53HO P5第23页/共74页一一. 外切酶外切酶III（ExoIII） 1. 一般特点：一般特点： 来自于来自于E.coli，分子量，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型催化反应类型 1) 外切酶活性：外切酶活性：3 5，产生，产生5-单磷酸核苷酸和单磷酸核苷酸和具各种结构的具各种结构的 ds 2) 核酸酶核酸酶H活性：除去活性：除

27、去DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA分子，分子， 3) 3-磷酸酶活性：除去磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成磷酸基后形成3-OH端，端，有利于有利于DNA聚合酶反应，聚合酶反应， 4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键键切开，切开，pH 7.6-8.5 第24页/共74页 3. 外切酶活性特点外切酶活性特点 1) 反应底物：互补反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：碱基释放速度：CA-TG 3) 反应产物：反应产物：5-单磷酸核苷和具缺口或单磷酸核苷和具缺口或5-端突起端突起的的ds-DNA，过度反应将导致，过度反应将导致DNA降解降

28、解 4. 用途用途 1) 核酸（核酸（DNA）标记）标记 2) 基因突变基因突变-缺失缺失 3) DNA序列测定时作顺序缺失序列测定时作顺序缺失 5. 使用注意事项使用注意事项 1) 正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2) 在一定条件下，在一定条件下，ExoIII不能作用不能作用GC富集区富集区(来来自于自于cDNA加尾加尾)第25页/共74页5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和的外切酶和RNaseH的作用的作

29、用第26页/共74页1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b cExoIII用于顺序缺失用于顺序缺失 ExoIII ExoIII -32P -32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于用于DNA标记标记第27页/共74页二二. 外切酶外切酶 1. 反应特点反应特点 1) 作用底物作用底物: 要求要求5-PO4基基; 不作用含切口的不作用含切口的DNA分子分子 2) 作用方向与产物：作用方向与产物：

30、5 3; 产生产生5-P核苷和核苷和3-突起突起的的ds-DNA 2. 用途：用途：DNA定序测定定序测定; 除去除去5-端突起，产生端突起，产生3-端突端突起，便于加尾起，便于加尾3 HO 3 HO 3 HO OH 3 OH 3 OH 3 5 P 5 P 5 P P 5 P 5 P 5 AAAAAAAAAAAATdT+dATP 第28页/共74页三三. 核酸酶核酸酶Bal31 1. 一般特点：一般特点：胞外酶；具胞外酶；具DNase和和 RNase 活性；由活性；由“快快”和和“慢慢”两种成分构成两种成分构成 2. 催化反应特点催化反应特点 1) 底物：底物：ss-DNA，ds-DNA，RN

31、A(外切与内切活性外切与内切活性) 2) 作用方向与产物：作用方向与产物：5 3和和3 5同时进行，但同时进行，但反应速度不同；反应速度不同； 产生产生5-单磷酸核苷和缩短的单磷酸核苷和缩短的ds-DNA 3. 用途：用途： 基因突变基因突变-缺失缺失; 绘制限制酶谱绘制限制酶谱; DNA定序定序(与与ExoIII相同相同)，其优点是，其优点是Bal31酶活依赖于酶活依赖于Ca+和和Mg+，Ca+在反应完毕后可用在反应完毕后可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不（乙二醇四乙酸）灭活而不影响影响Mg+浓度，后者是限制酶活性必需的浓度，后者是限制酶活性必需的 4. 使用注意事项：使用注意事项： 1)

32、 应作预备实验，因每批酶制品的应作预备实验，因每批酶制品的“快快”“”“慢慢”酶含量不酶含量不同同 2) DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平突起，需要补平第29页/共74页5PP53HOOH3核酸酶核酸酶Bal31的活性的活性第30页/共74页四四. 核酸酶核酸酶S1 1. 一般特点：一般特点：糖蛋白糖蛋白(含糖量含糖量8%)，最佳，最佳pH 4.5， 对热对热稳定，抗变性剂稳定，抗变性剂 2. 催化反应类型催化反应类型: ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性双螺旋变性区区 3. 用途用途 1) 基因突变基因突变-缺失，常与外

33、切酶，如缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、外切酶、Bal31连用连用 2) DNA定序分析定序分析 3) S1作图法作图法 4) 基因结构分析基因结构分析 5) tRNA结构分析结构分析 4. 使用注意事项使用注意事项 1) 避免长时间反应，因最适酸性避免长时间反应，因最适酸性pH将导致将导致DNA断裂或断裂或降解降解 2) 避免使用高浓度酶量，以免避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解被降解(因产生切口因产生切口)第31页/共74页ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶核酸酶S1活性活性 第32页/共74页 五五. 绿豆核酸酶绿豆核酸酶 1.

34、 与与S1酶相同点：酶相同点：作用于作用于ss-DNA和和RNA，对，对5-端的突起核苷酸作用速度为端的突起核苷酸作用速度为GCAT 2. 与与S1酶的不同点酶的不同点 最适最适pH接近中性，不会产生切口接近中性，不会产生切口; 不使具切口的不使具切口的ds-DNA断裂断裂 3. 用途：用途：与与S1酶相同酶相同 六六. 外切酶外切酶 作用于作用于ss-DNA的的3- 与与5-端，产物为低聚核苷酸端，产物为低聚核苷酸 除去单链除去单链DNA形成平整末端形成平整末端 七七. 牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶 作用含作用含5-羟基端的羟基端的ss-DNA和和RNA，产生，产生3-单磷酸核单磷酸核苷苷

35、用于短链用于短链RNA和和 DNA的定序分析的定序分析第33页/共74页 八八. 蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶 作用作用3-羟基单、双链羟基单、双链DNA和和RNA，产生，产生5-单磷酸核苷单磷酸核苷 用于用于RNA和和DNA的定序分析的定序分析表表4 几种常用外切酶的特点几种常用外切酶的特点 外切酶外切酶 作用方向作用方向 作用底物作用底物 反应产物反应产物 ExoIII 35 dsDNA 单核苷酸单核苷酸 外切酶外切酶 53 ss和和dsDNA 同同上上 Bal31 35和和53 ss和和dsDNA, RNA 同上同上 S1 35和和53 ssRNA和和ss DNA 低、低、核苷酸核苷酸

36、绿豆核酸酶绿豆核酸酶 35和和53 ssRNA和和ss DNA 同上同上 Exo VII 35和和53 ssDNA 低聚核苷低聚核苷酸酸 牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶 53 ssRNA，ss DNA 同上同上 蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶 35 ss，ds RNA和和DNA 同上同上第34页/共74页 九九. RNase 大部分用于大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNA样样品或蛋白质合成系统中的品或蛋白质合成系统中的RNA分子。分子。RNase的识的识别序列和特点见别序列和特点见表表5。 1. RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂分离自牛胰脏，对热稳定，抗

37、去污剂（100加热加热15min仍具活性）仍具活性）, 用于除去用于除去DNA样品中样品中的的RNA分子分子 2. 核酸酶核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 十十. RNase H 作用于作用于DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，用于链，用于cDNA文库建立时除去文库建立时除去DNA链以便第二条链链以便第二条链cDNA链的链的合成。合成。 第35页/共74页 表表5 核糖核酸酶反应特点核糖核酸酶反应特点 核酸酶核酸酶 特异性反应特异性反应 核酸酶核酸酶 特异性反应特异性反应 A

38、Pyp/N PhyM Ap/N或或 Up/N CL3 Cp/N, Ap/N和和Cp/N B.cereus Cp/N, Up/N T1 Gp/N P1 无特异性反应无特异性反应 T2 无特异性反应无特异性反应 S7 Np/A和和 Np/U U2 Pup/N或或Ap/N Phy1 Ap/N,Gp/N和和Up/N第36页/共74页 十一十一. DNase I 1. 特点：特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核，但无核苷酸序列特异型，产生苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值可使酶活达最大值

39、当酶浓度很低时，当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 2. 用途用途 1) 切口移位，制备切口移位，制备DNA探针探针 2) 制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子 3) 基因突变时产生切口基因突变时产生切口 第37页/共74页 Mn+存在时存在时 Mg+存在时存在时 DNaseI作用特点作用特点DNas

40、eI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I第38页/共74页第四节第四节 DNA 聚聚 合合 酶酶 第39页/共74页 一一 . E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI） 1. E.coli 的的DNA聚合酶系统聚合酶系统 Pol I 参与参与DNA修复修复, 具具35和和53外切酶活性外切酶活性 pol II 同上同上 具具35外切酶活性外切酶活性 pol III 参与参与DNA复制复制, 具具35和和53外切酶活性外切酶活性 2. E.coli polI的特点的特点 1）具两种外切酶活性和）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作

41、用聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶活性外切酶活性(大大片段亦称为片段亦称为Klenow片段片段, polIK) 2） 聚合酶活性，聚合酶活性，53, 要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表其延续性受反应条件的影响（表6） 3） 外切酶活性外切酶活性 第40页/共74页 3. 用途用途 1） 除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时） 2） 补齐补齐5-突起端突起端 3） 合成第二条合成第二条cDN

42、A 4） 切口移位制备探针切口移位制备探针 其中用途其中用途2) 和和3)常用大片段常用大片段表表6 E.coli DNA PolI 的延续性的延续性 DNA模板模板-引物类型引物类型 反应条件反应条件 延续性延续性(碱基数碱基数) 切口切口 ColE1 37C, 低盐低盐 8 缺口缺口 ColE1 37C, 低盐低盐 47 切口切口/缺口胸腺缺口胸腺DNA 37C, 低盐低盐 24 poly d(AT) 37C, 低盐低盐 188 poly d(AT) 5C, 低盐低盐 14 poly d(AT) 5C, 高盐高盐 3第41页/共74页 二二. T4 DNA聚合酶聚合酶 1. 特点：特点：

43、53聚合酶活性，聚合酶活性，1500 nt/min, 为为pol I的两的两倍倍 35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA, 其切除速度分别为其切除速度分别为40和和 4000nt/min 2. 用途：用途： 制备高比活性探针制备高比活性探针(1010 cpm/gDNA); DNA末端末端修饰修饰-缺失缺失5CAGCAACGT 3 dATP CAGCAACGT 3 S1 T 33GTCGTTGCA 5T4聚合酶聚合酶 A 5 A 5 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 无无dNTP dNTP第42页/共74页三三. 反转录酶反转录酶 1. AMV反转录酶反

44、转录酶 1） 结构与酶活性结构与酶活性 反转录酶以反转录酶以，形式存在，形式存在，其中其中（无活性）（无活性）P32（内切酶活性）（内切酶活性）+聚合聚合酶酶 + P24（RNase H活性），各步反应由蛋白酶活性），各步反应由蛋白酶催化催化 2）聚合酶活性）聚合酶活性 a. RNA，DNA引物（大于引物（大于8 nt）cDNA链链 bDNA-RNA引物引物互补互补DNA链链 c(rA)1100(dT)12-18(dT)n or (rc)n.dG n(dG) n第43页/共74页反转录酶的结构和活性反转录酶的结构和活性 P24 P24 190 kD 160 kD 65 kD 24 kD P32

45、 RNaseH 聚合酶聚合酶 5 AAAAA3 引物引物 5 AAAAA 3 TTTTT 5 反转录反应反转录反应 5 3 5 3 3 5 3 5 全长全长cDNA 提前终止反应提前终止反应 第44页/共74页 2. M-MLV反转录酶反转录酶 1) 特点：特点： 不具内切酶活性不具内切酶活性; RNase H活性低活性低; 稳定性差稳定性差 2) 与与AMV反转录酶比较反转录酶比较 a合成短链合成短链cDNA(0.6 kb)时，两者相同，但时，两者相同，但M- MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关 b合成长链合成长链cDNA(4.5-7.5 kb

46、)时，它比时，它比AMV反转反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。 3) 用途用途 a. cDNA合成用于文库建立合成用于文库建立; b. 制备制备cDNA探针探针; c. DNA序列分析序列分析; d. 填补填补5-突起末端以获平端突起末端以获平端第45页/共74页四四. Taq DNA聚合酶聚合酶 1. 特点：特点： 分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适，最适反应温度反应温度75， 对对95高温具良好稳定性，该酶不高温具良好稳定性，该酶不存在存在35外切酶活性外切酶活性 2. 用途：用途： 主要用于主要用于DNA的

47、体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才次循环后才进入酶的反应稳定期，一个进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增分子因而可被扩增4106倍倍 DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，它包括，它包括以下三个步骤：以下三个步骤： DNA模板变性模板变性(95) ) 与与DNA引物退火引物退火(45) 引物延伸引物延伸(75) 第46页/共74页Taq Pol 和和PCR 5 3 变性变性 3 5 5 3 引物引物 3 5 复性复性 5 3 5 3 3 5 引物引物 3 5 5 3 延伸延伸 5 3 3 5 3 5 第47页/共74页 五五. DNA定序酶定序酶 用

48、基因工程方法去除用基因工程方法去除35外切酶活性的外切酶活性的Taq DNA聚合酶聚合酶 六六. Tth DNA聚合酶聚合酶 93kD，75，含有二级结构，含有二级结构DNA分子的定序分子的定序 七七. Tli DNA聚合酶聚合酶 100仍具酶活，仍具酶活，35外切酶活性，外切酶活性，85 kD DNA的切平反应和补平反应的切平反应和补平反应 DNA聚合酶和核酸酶聚合酶和核酸酶S1或绿豆核酸酶连用或绿豆核酸酶连用, 可用于可用于 DNA末端结构的修饰末端结构的修饰第48页/共74页 5AAGCTT3 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+ k

49、lenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5切平反应和补平反应切平反应和补平反应 第49页/共74页四种不同补平反应四种不同补平反应5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG G

50、ATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 第50页/共74页第第 五五 节节 RNA 聚聚 合合 酶酶 第51页/共74页 一一. SP6 RNA聚合酶聚合酶 1、特点：、特点： 依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶，具聚合酶，具SP6启动子特异型启动子特异型 2、用途：、用途： 主要用于主要用于RNA分子的体外合成，分子的体外合成，RNA分子可用

51、于：分子可用于： 1） RNA分子的拼接研究分子的拼接研究 2） 标记的标记的RNA常用于杂交，常用于杂交，RNA-DNA比比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生分子更稳定，两条链均可标记，产生的的RNA具高放射比活性具高放射比活性 3） DNA的定序分析的定序分析 4） 基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置和位置 5） 还可以用于蛋白质的合成研究还可以用于蛋白质的合成研究第52页/共74页ApOriLacZSp6T3ApOriSp6T3MCSATTTAGGTGACACTATAGAATATTTATTAACCCTCACTAAAGGGAA

52、GTAATACGACTCACTATAGGGCGAT7RNA聚聚合合酶酶活活性性 第53页/共74页 二二. T7 RNA聚合酶聚合酶 特异性识别特异性识别T7噬菌体基因启动子噬菌体基因启动子 三三. T3 RNA聚合酶聚合酶 特异性识别特异性识别T3噬菌体基因启动子噬菌体基因启动子 基因启动子识别的特异性比较：基因启动子识别的特异性比较：SP6T7T3 四四. E.coli RNA聚合酶聚合酶五五. 多聚核苷酸磷酸化酶多聚核苷酸磷酸化酶 第54页/共74页第第 六六 节节连连 接接 酶酶 第55页/共74页一一. T4 DNA连接酶连接酶 1. 特点：特点： 只连接只连接ds -DNA分子，要

53、求分子，要求3-羟基和羟基和5-磷酸基磷酸基 2. 用途：用途： 1) 相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的连接 2) 平整末端的相连平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它限制酶与其它酶共同作用结果酶共同作用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多困难得多，所需的酶量也多 3. 抑制剂：抑制剂： PO43-5mM , NaCl25mM, Ca+第56页/共74页5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA

54、 TTCGAP 退火退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA连接酶连接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 T4 DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应(两种插入方向两种插入方向) +第57页/共74页二二. E.coli DNA连接酶连接酶 只能连接具粘性末端只能连接具粘性末端DNA分子，

55、以分子，以NAD作辅助因子作辅助因子三三. T4 RNA连接酶连接酶参与单链参与单链RNA分子的连接。分子的连接。主要用于提高主要用于提高T4 DNA连接连接酶在连接反应中的连接效率（酶在连接反应中的连接效率（20倍）倍） HO P HO P HO P 5 3 5 3 5 3 RNA连接酶活性连接酶活性 第58页/共74页第七节第七节 核核 酸酸 末末 端端 修修 饰饰 酶酶第59页/共74页 一一. 细菌碱性磷酸酶（细菌碱性磷酸酶（BAP） 1. 特点特点 1) 除去除去ss-DNA，ds-DNA 和和RNA分子两端的分子两端的3-和和5-磷酸基磷酸基 2) 对热稳定对热稳定 2. 用途用途

56、 1) 载体载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率组频率 2) 核酸末端标记核酸末端标记 二二. 牛小肠碱性磷酸酶（牛小肠碱性磷酸酶（CIP） 与与BAP相同，只是相同，只是CIP对热敏感对热敏感第60页/共74页 -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 磷酸酶磷酸酶(I)与磷酸激酶与磷酸激酶(II)活性活性 磷酸激酶的交换反应磷酸激酶的交换反应第61页/共74页三三. T4 多聚核

57、苷酸激酶多聚核苷酸激酶 1. 催化反应类型催化反应类型 1) 激酶活性（激酶活性（5-磷酸化酶）：可将磷酸化酶）：可将ATP中的中的位位的磷酸基转移到的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和和RNA分分子的子的5-羟基端，在这反应过程中可有两种方式羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行（进行（pH7.5-8） .转移反应；转移反应； .交换反应交换反应 2) 3-磷酸酶活性（磷酸酶活性（pH 5-6） 2. 用途用途 1) 5-端末端标记端末端标记 2) 分子克隆过程中以获得分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连磷酸基末端，便于连接酶反应接酶反应第62页/共74页 四四. 末端转移酶（末

58、端转移酶（TdT） 1. 反应特点反应特点 底物：底物：dNTP及衍生物，及衍生物，3个核苷酸，要求个核苷酸，要求3-OH端，端，需要需要ss-DNA作为引物，以作为引物，以3-突起端的突起端的ds-DNA 为为最高，亦可用于最高，亦可用于ds-DNA加尾加尾 2. 核苷酸掺入速度核苷酸掺入速度 二甲基砷酸盐缓冲液和二甲基砷酸盐缓冲液和Mg2+可提高嘌呤核苷酸可提高嘌呤核苷酸的掺入速度，而的掺入速度，而Ca2+可提高嘧啶掺入速度可提高嘧啶掺入速度 3. 用途用途 3-加尾，便于两加尾，便于两DNA分子重组分子重组; 3-末端标记末端标记 第63页/共74页五五. 多聚腺嘌呤聚合酶多聚腺嘌呤聚合

59、酶 该酶是在该酶是在RNA分子的分子的3-端（端（OH）加上一个多聚）加上一个多聚A的的尾巴，其用途可标记尾巴，其用途可标记RNA和和 加尾的加尾的RNA，可用于，可用于cDNA的合成的合成六六. 烟草酸性焦磷酸酶烟草酸性焦磷酸酶 可除去可除去mRNA帽子结构中的焦磷酸帽子结构中的焦磷酸: m7Gp-p-p-Xp-Yp-mRNA p-Xp-Yp-mRNA七七. 鸟苷酸转移酶鸟苷酸转移酶 1. 催化类型催化类型 RNA三磷酸酶三磷酸酶: pppN(pN)n ppN(pN)n + Pi 鸟苷酸转移酶鸟苷酸转移酶: -32PGTP + ppN(pN)n G32pppN(pN)n + PPi RNA甲

60、基转移酶甲基转移酶: AdoMet + G(5)pppN(pN)n m7G(5)pppN(pN)n + AdoHCy 2. 用途：标记用途：标记DNA第64页/共74页第八节第八节 其其 它它 酶酶 类类 第65页/共74页 1. 原生质体的制备酶类原生质体的制备酶类 制备原生质体目的：外源制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸导入；核酸和蛋白质的提取和蛋白质的提取 溶菌酶，溶菌酶， zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶，溶壁酶，纤维素酶 2. 蛋白质降解酶类蛋白质降解酶类 蛋白酶蛋白酶K 3. 检测酶类检测酶类 抗生蛋白链素抗生蛋白链素-半乳糖苷酶半乳糖