基因诊断与基因治疗

1、 基因诊断与基因治疗 (Gene Diagnosis and Therapy) 1主要内容2 基因诊断（基因诊断（4-184-18） 基因治疗（基因治疗（4-254-25） 2013年，H7N9禽流感来袭，快速而准确地对疑似患者作出诊断，能有效的增大患者的生机。 通过什么方法作出快速诊断？如何来进行治疗？3 基因诊断能够快速检测出疑似患者的送检样品中是否含有H7N9病毒的特定基因。4548小时内使用最有效 利用分子生物学方法，直接检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断,为治疗提供依据。 特点： 针对性强，特异性高 实用性强，诊断范围广 预见性，适应性6基因诊断基因诊断常用技术方法

2、（一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链反应 (PCR)（三）基因测序（四）基因芯片7核酸分子杂交技术原理8 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sandwich hybridization） 原位杂交（ hybridization in situ）常用固相核酸杂交方法910 (1) Southern 印迹杂交法 限制性内切酶酶切 检测杂交信号检测

3、杂交信号 提取提取DNADNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。（2）Northern 印迹杂交法 （其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 11（6）原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交、组织切片原位杂交 DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确

4、地反映组织细胞的功能状态。12（二）聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize 13PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n n为循环数14（三）基因测序技术他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。Fred Sanger

5、 发明的末端合成终止法 (sanger法)Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法15（四）基因芯片技术n快速、高通量、平行化、自动化16基因诊断方法经典基因诊断.限制性内切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法优点缺点特异基因诊断未知基因诊断直接，过程简单过程繁杂准确性低，过程繁条件严格基因诊断进展.PCR方法.PCR-序列分析法.DNA芯片技术简单、经济、敏感操作直接、准确集成度高、快速、并行假阳性高价格高尚无成熟产品问世17 四. 基因诊断的临床应用18遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定镰状红

6、细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析Mst酶切位点(CCTNAGG)5 3 正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb0.2kb正常珠蛋白基因： 5CCTGAGG3镰刀型贫血： 5CCTGTGG30.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着 患者19 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术 (Real time Quantitative PCR)实时监测 荧光 起始模板20Real Time vs. Traditional PCRPCR21PCR分四个阶段22TheoreticalReal LifeLog Target DNACt valueBaselineThreshold

7、2324理想的PCR反应XnX0 2n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应XnX0 （1En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）整理方程

8、式（2）：Log2X0 Log 2M Ct Log2（1En）荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理28SYBR Green I TaqMan Probe Molecular Beacon TaqMan30SYBR Green I GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA3132Dissociation curveTaqMan33Probes and Primers (Primer Express 3.0 software)34Primer Length: 15-30bpPCR Product: 100-200bpG+C%: 4060Tm of primers: 55-60 Tm of probes: 65 (10 )No G at 5探针中GC含量的差异对定量PCR反应效率的影响36Methods of Quantification3738Absolute Quant