蛋白质组学在水果品质控制方面的应用进展

1、蛋白质组学技术在水果品质控制方面的应用进展摘要：蛋白质组学旨在阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。其对生命现象的诠释直接、准确，已逐渐成为现代生物技术发展的支撑技术。近年来，蛋白质组学在食品科学方面的应用逐渐涉及各个方面，包括果实保鲜研究、食品功能研究、食品营养分析、食品品质评价、安全检测及真伪鉴别等。这为与食品科学相关的研究提供新思路和新技术。本文概述了蛋白质组学的概念及相关主要研究技术，分析了蛋白质组学在食品科学研究中的应用，尤其水果品质控制方面，并对其在食品加工检测方向的发展前景进行了展望。关键词：蛋白质组学；电泳技术；质谱技术；水果；品质控制The ap

2、plication progress of proteomics technology in fruit quality controlAbstract: Proteomics seeks to clarify the genome expression really perform life activities protein expression pattern and biological functions. Direct interpretation of the phenomenon of life, accurate, and has gradually become the

3、support of the development of modern biotechnology techniques. In recent years, the application of proteomics in food science gradually involve all aspects, including fresh fruit research, functional food, food nutrition analysis, evaluation of food quality, safety testing, and the authenticity of i

4、dentification. This is to provide new ideas and new technology research and Food Science. This article provides an overview of the concept of proteomics and related research, analysis and application of proteomics in food science, especially fruit quality control aspects and prospects of its develop

5、ment in the direction of food processing detection prospect.Keywords: proteomics; electrophoresis; mass spectrometry; fruit; quality control前言1994年澳大利亚科学家Marc Wilkins提出蛋白质组概念，并在1995年7月在Electrophoresis生命科学领域从那开始取得了许多突破性的进展。特别是2003年人类基因组计划完成，功能基因组时代到来，蛋白质组学的研究被提升到新的高度1。全基因组测序工程为世界各物种基因组学的研究奠定了重要的信息基础，

6、也为蛋白质组学的研究提供分析基础。植物基因组尤其是水果类基因组相对庞大，测序工作进展缓慢。目前，已测序完成的水果物种有：番木瓜 Carica papaya (Papaya)，西瓜 Citrullus lanatus (Thunb.) (Watermelon)，甜橙 Citrus sinensis (Sweet orange)，甜瓜 Cucumis melo (Melon)，黄瓜 Cucumis sativus (Cucumber)，草莓 Woodland strawberry (Fragaria vesca)，苹果 Malus domestica (Domesticated apple)，木薯

7、 Manihot esculenta (Cassava)，香蕉 Musa acuminata (Banana)，桃 Prunus persica (Peach)，番茄 Solanum lycopersicum (Tomato)，葡萄Vitis vinifera (Wine Grape)。蛋白质组学作为一项较为新兴的技术，以蛋白质组为研究对象，在蛋白质水平上，整体，定量，动态地去研究和分析正在工作的基因组，是后基因组时代的一个重要组成部分2, 3。蛋白质组学主要对蛋白质表达进行研究分析，研究工具以分离技术和生物质谱技术为支撑平台，生物信息学为桥梁。蛋白质赋予食品功能性及营养性等特性，是食品重要组

8、成成分之一。蛋白质是生物体细胞的重要组成成分，在细胞的结构和功能中发挥重要作用。为了保证食品蛋白组分的生化活性达到最高期待值，对食品的生产，包括原料养殖（种植）、收获、加工、保藏等环节的控制都需有严格的要求。因此，在食品生产及最终产品质量控制上，需进行必要的蛋白质检验。蛋白质组学技术在食品蛋白质研究中应用越来越广泛。在功能性食品或者高附加值食品的真伪鉴别和品质控制中，蛋白质组学相关技术对蛋白质组分进行分析，获得本质的产品信息。与传统的检测方法相比优势明显，且为食品功能研究、营养分析、安全监测、品质控制与评价、新型食品开发等研究领域提供新方法。本文综述了蛋白质组学的主要研究技术及在食品方面的应用

9、进展，重点论述其在水果品质控制与分析，并对其在食品安全监测方面的应用进行展望。1 蛋白质组学蛋白质组(proteomics)是一个基因组所表达的全部蛋白质4，即生物物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液等在特定的环境条件、特定的时刻全部蛋白质表达的图谱。概括来讲，蛋白质组学是基于蛋白质组的对大量蛋白质的整体研究，包括在生长发育中和各种外界因素下的蛋白质结构、功能和丰度的变化等5。同时，蛋白质组学是基因组学与代谢组学之间联系的桥梁，蛋白质组学的研究旨在阐明组织、器官或生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，揭示特定生命现象和过程的机理。蛋白质组学技术具有的高通量、高精确度等特点，为植物的生长发育、成

10、花机理、胁迫反应、生理处理等内在机理的研究在蛋白质水平上提供了新的研究途径1。蛋白质组学研究的主要技术有：蛋白质组分分离技术，蛋白质组分鉴别技术及利用蛋白质信息学对蛋白质结构、功能进行分析和预测。目前蛋白质分离分析技术主要有四种较为常用，分别为：电泳技术、质谱技术、色谱技术及蛋白质芯片技术。蛋白质组学的三大核心技术分别是双向电泳技术、质谱技术和生物信息学6。其中，双向电泳技术和质谱相结合的方法是目前较为经典且应用广泛的技术7。2 蛋白质组学关键技术2.1 蛋白质样品的提取制备蛋白质样品的提取及制备技术是蛋白质组学研究的基础和关键。理想的蛋白质提取方法能够获得大量蛋白、最大程度降低蛋白污染和防止

11、蛋白变性和降解并具有可重复性，有助于获得高质量2-DE图谱和蛋白质相关信息后续研究8。蛋白样品制备是获得高质量且重复性好的2-DE凝胶图像的关键步骤。蛋白样品的提取的传统常用方法是TCA/丙酮法和酚抽法。但是，在大量的实验研究中，科学研究人员根据原材料的特殊组成常对着两种方法进行改良以获得最为适合自身研究材料的提取方法。不管采用哪种方法，在蛋白质样品制备过程中，应尽可能提高样品蛋白溶解度，抽提最大量总蛋白，减少蛋白损失，减少对蛋白的人为修饰，破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。TCA/丙酮沉淀法9和酚抽法10是植物蛋白质提取的基本且常见的方法。Isaacson等1

12、1对上述两种方法做了简要的说明及对比，认为TCA/丙酮法虽已成功运用于植物幼嫩组织蛋白的提取。但对复杂的顽拗植物组织，如：成熟葡萄果粒、马铃薯叶片、香蕉果实等，使用酚抽法比TCA/丙酮法获得更好的实验结果。采用酚抽法可以抑制蛋白酶的活性，避免蛋白质的降解，还可较好地避免酚类、多糖和色素等物质的干扰，得到的蛋白质干粉中杂质少。Vincent等12在进行葡萄果实蛋白质提取时也表明，酚抽提法虽操作复杂、耗时长，但能获得更多的蛋白点和高质量的双向电泳图谱。Vincent等还发现利用酚抽提法用尿素、硫脲素两种裂解剂再悬浮相结合的方法更适合葡萄蛋白的提取。同时，Wang等13在提取葡萄果实蛋白质组时采用了

13、PVPP/TCA法，即将酚类化合物用酸化的PVPP（增加PVPP聚合能力和消除PVP的污染）多次洗脱后，再用TCA、丙酮沉淀蛋白，此方法耗时少、毒性小且2-DE图谱的质量会随PVPP洗脱次数的增加而提高，同时还适于葡萄果实中-1,3-葡聚糖酶(-1,3-glucanase)的检测与分析。然而，植物细胞中包含多种次生代谢物质，可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化14，从而在果实组织中提取蛋白质难度增加。由于果实中蛋白质含量相对较低，并且含有大量干扰性物质，如色素、淀粉、多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等，对高纯度蛋白质的提取也有一定的难度15。水果果实蛋白质的提取分离与鉴定研究技术需要进一步探讨与优化。

14、2.2 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定用于衡量蛋白样品的提取量是否满足双向电泳及后续实验的需要。蛋白质浓度的测定常采用Gornall双缩脲16、Lowry酚试剂17、Bradford法18等比色定量的方法测定,其中Bradford法是应用最广的，很多试剂盒就是在它的基础上优化得来。Levashov等19发现Goa法不仅能够测定全蛋白浓度，还能对较难测定的寡肽、膜蛋白质等的浓度进行测定。并且Goa方法所获得校准曲线较稳定，灵敏度高，能够适合含量在0.11.2mg范围内蛋白质的测定，并且不用繁琐的稀释，较为方便。另外，Goa法还可检测1g/ml的多肽溶液。2.3 电泳技术蛋白质组学研究中，主要的

15、电泳技术是双向凝胶电泳(2-DE)，其他还有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细吸管电泳(CE)等。SDS-PAGE曾是蛋白质分析较为常用的方法，此法具有特异性强、操作简单及干扰因素少等优点，可用于检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子质量等。但是这种方法只能将不同分子质量的蛋白分离，对于分子质量相同的蛋白则无法分离20。毛细管电泳(CE)是一种新兴的色谱分离技术，这种技术是将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合21。目前，该技术已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，毛细血管电泳由于其侧面积/截面积大、能克服由于焦耳热引起的谱带展宽、散

16、热快、可承受高电压，其分离效率较高22。此外毛细血管电泳还具有灵敏度高、样品需求少、速度快、种类多、分离范围广、成本低等诸多优点。但是其对于复杂样品的分离尚且不完全。2.3.1 双向电泳技术 双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)由OFarrell于1975年创立的，作为蛋白质组研究的核心技术之一，是目前常用的唯一能连续在一块胶上分离某一物种的数千种蛋白质的方法，同时是当前分辨率较高的工具，已在生物学研究方面得到广泛的23。双向电泳根据蛋白质两个相互独立的特性等电点和分子量对蛋白质组分进行两次电泳：第一向等电聚焦(Isoelectrofocusi

17、ng, IEF)，IEF是基于蛋白质等电点不同而将其分离；第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，是基于蛋白质亚基分子质量不同而分离，从而达到在二维空间上先后将蛋白质分离的目的，并能得到蛋白质等电点和分子量的信息。两次电泳后会在二维胶上出现浓度不等的点，一个点通常代表一种蛋白质。电泳之后的染色主要有考马斯亮蓝染色法和银染法、负染、荧光染色法等。但二维电泳技术对低拷贝、强疏水性、低溶解度、极酸或极碱的蛋白质不易分离，同时也存在繁琐、灵敏度低、不稳定等缺点24。实验过程中，影响双向电泳图谱效果的因素有多方面。在进行苜蓿、水稻及一些盐生植物25-27等的生物学研究中，不同的蛋白提取方法

18、、不同分离胶浓度、不同等电聚焦(IEF)电泳上样量、不同pH范围的固相pH梯度(immobilized pH gradients, IPG)胶条进行的蛋白质双向电泳图比较，并选取图谱较为满意的双向电泳条件。另外，实验中双向电泳图谱重复性的优劣关系到实验数据的可比性和平行试验间数据的参考。保证双向电泳实验良好的重复性也是研究后续差异表达蛋白的基础。电泳过程中，保证参数和操作一致，如等电聚焦的电压、时间控制，蛋白质转移时胶条的位置、SDS-PAGE的电流电压、染色用水、试剂过滤等操作，从而可保证蛋白质斑点数目、等电点、分子质量以及蛋白质量等在多次不同试验中具有较好的重复性。水果果实中含大量多糖、色

19、素、酚、醌等次生代谢产物，给蛋白质双向电泳研究增加了难度。曾有人使用管状载体两性电解质凝胶电泳研究果实蛋白质组学28，该实验对研究水果果实蛋白质组有一定的推动作用，但由于方法的局限性较难满足对果实蛋白质组学研究需要。近年来，应用IPG-IEF与SDS-PAGE系统双向电泳研究水果果实蛋白质组方法逐渐变得普遍并成熟。2.3.2 蛋白质裂解液的选择 植物果实中富含的酚类、多糖以及色素等次生代谢物质对蛋白质等电聚焦干扰很大，容易在2-DE凝胶图谱中产生水平条纹。在双向电泳过程中，为获得较好的等电聚焦效果，蛋白质样品必须完全溶解。因此，样品裂解缓冲液需达到蛋白样品的最大溶解度。样品裂解液通常包含离液剂

20、，如尿素和硫脲；表面活性剂，如CHAPS和Triton X-100；还原剂，如DTT、二硫赤藓糖醇(DET)以及磷酸三丁酯(TBP)；也可以选择性的加入Tris-base、蛋白酶抑制剂以及核酸酶等组分29。卢丞文6在番茄果实的实验研究中发现，缓冲液中尿素浓度的升高和表面活性剂Triton X-100的加入，对蛋白样品溶解度的增加有促进作用。2.3.3 蛋白质上样量的选择 水果果实的蛋白质表达丰度因品种而差别较大，增加或减少蛋白质的上样量会影响样品溶液中盐离子的含量进一步影响等电聚焦效果。因此，蛋白质样品上样量直接影响双向电泳图谱的效果。不同水果果实的实验应比较不同蛋白上样量的图谱，选择最为合适

21、的上样量使得双向电泳图谱中蛋白点数目多，各点分离清晰，并能满足双向电泳及后续的质谱分析的需要。王一鸣等30以发育中期的桃果实为试材，探索适用于全细胞蛋白质组分离的双向电泳技术。为使得双向电泳图谱背景清晰并蛋白点分离效果好，实验采用TCA丙酮沉降蛋白11，所用上样缓冲液含有硫脲和SB3-10效果较好，含有碘乙酰胺的平衡缓冲液其产生背景纹理少、蛋白点清晰，合适的上样量，较窄pH范围的胶条及染色方法最佳选择会使得背景清晰，蛋白点清楚突出。杨爱珍等31为了探究桃果实发育过程后期中、内果皮不同的代谢进程，以“大久保”桃(Prunus persica L.cv.Okubao)盛花后56天的果实为试材，TC

22、A/丙酮沉淀法提取蛋白质，采用固相pH梯度(immobilized pHgradients，IPG)双向电泳系统分离蛋白质，凝胶银染显色后用图像分析软件比较分析差异表达的蛋白点，初步了解中果皮和内果皮蛋白质组表达的差异点。采用pH 5-8 IPG胶条进行等电聚焦得到的双向电泳图谱在中果皮与内果皮中检测到蛋白质点的数量分别为（1273101）和（1292115）个，所有匹配的蛋白点中有65个在中果皮与内果皮的图谱中均存在，其中30个为内果皮相对于中果皮2倍（P0.05）上调的点，35个为内果皮相对于中果皮2倍（P0.05）下调的点。有10个蛋白点仅在中果皮表达，18个蛋白点只在内果皮表达而中果皮

23、未显示。表明桃果实发育硬核期中果皮与内果皮的蛋白质组存在一定差异，这些差异初步解释为内果皮主要是进行木质素的沉积，而中果皮主要是进行碳水化合物的代谢过程并为后期糖分的积累和芳香味的形成奠定基础。2.4 色谱技术 在蛋白组学研究技术中，分离纯化技术除电泳技术外，色谱技术(chromatography)又称层析技术也是当前物质分离纯化、分析鉴定的重要方法之一。目前，蛋白质组学方面常用的色谱技术是高效液相色谱(high performance liquid chro-matography，HPLC)。按照不同的分离模式，其可以分为一维(one-dimensiona，l 1D)、二维(two-di-m

24、ensiona，l 2D)和多维(multidimensiona，l MD)。因具有分离效率高、检测灵敏度高、分析速度快和应用范围广等特点，高效液相色谱在生产实践中得到了广泛应用。二维或多维液相色谱，是一种将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。待分析样品经过第一维的色谱柱进入接口中，通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物（如肽）分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、亲水性、电荷、特殊分子间作用（亲和）、等电点等。一维分离系统中不能完全分离的组分，可能会在二维系统中得到更好的分离

25、，分辨率、分离能力得到极大的提高。多维液相色谱和串联质谱联机可以用来分离鉴定双向凝胶电泳技术容易丢失的低丰度蛋白和膜蛋白32。2.5 质谱技术质谱技术(mass spectrometry)是一种鉴定生物大分子的技术。近年来，质谱技术得到迅速发展，其在蛋白质组研究中主要用于蛋白质的鉴定。质谱技术的发展是近年来蛋白质组学研究得到迅速发展和应用的关键因素之一33。质谱技术的基本原理是：样品分子离子化后，根据不同离子的质荷比(m/z)差异对离子进行分离并确定其分子质量。由于单一地依靠蛋白质相对分子质量并不能对目的蛋白进行理想的鉴定，因此需要事先用蛋白酶（如胰蛋白酶）将检测样品酶解成不同长度的肽段再进行

26、分析。质谱仪根据离子源的不同，质谱可分为电喷雾离子化质谱(electrospray ionization mass spec-trometry，ESI-MS)和基质辅助的激光解吸质谱(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS)，后者常与飞行时间(time of flight，TOF)质谱联用，称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。质谱技术中无需将蛋白纯化，可同时鉴定多个蛋白质，具有灵敏度高、易自动化、准确度高的特点，这点是蛋白质组学研究的一个重大突破。MALDI-TO

27、F-MS与四极杆质谱联合，具有更高的准确度、高分辨率和fmol级的敏感度，可用于鉴定蛋白质修饰从而对阐明蛋白质结构进行说明。同时将2个质谱连接在一起构成的串联质谱，可以更灵敏、更精确地分析蛋白样品34, 35。2.6 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片技术SELDI(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SEL-DI-TOF-MS)作为新发展起来的蛋白质组学主要技术之一，为蛋白质的检测和研究提供了新的技术平台36。蛋白质芯片技术主要应用于差异显示蛋白质组学和蛋白质间相互作用的研究。蛋白

28、质芯片技术就是将一系列“诱饵”蛋白（如抗体），以阵列的方式固定在经过特殊处理的底板上，然后将其与待分析的样品杂交，只有那些与“诱饵”结合的蛋白才被保留在芯片上。这种方法实质上是大规模化的酶联免疫吸附测定37。蛋白质芯片技术，全称是表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱，是将蛋白质芯片与飞行质谱相结合，使它既具备芯片的高通量、高效率的特点，又具备飞行质谱的高灵敏度飞级（fg，110-15）水平检测的功能38。可用于对血清及组织粗样品中的各种蛋白质直接进行检测，特别适于以往蛋白质分析的盲区，即低分子质量、低丰度和疏水的蛋白质进行研究39。因此，在蛋白质组学的研究中蛋白质芯片技术与目前常规方法比较具有显

29、著的优势。2.7 蛋白质信息学蛋白质信息学(Protein Bioinformatics)在蛋白质组的分析中起重要作用，一是通过与数据库中的已知蛋白质相比较来判断未知蛋白质的功能；二是预测蛋白质的结构，并判断蛋白质是否发生修饰40, 41。蛋白质鉴定的方法主要是利用蛋白质的各种属性参数进行，如：相对等电点、分子质量、氨基酸组成、序列等信息在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。如果在数据库中找不到，则有可能是发现了新蛋白，此时可进行新蛋白的鉴定。近年来，一些处理数据的先进算法和软件相继出现，并且还存在着许多开放性资源和商业化的数据库平台42，使得蛋白质的鉴定更快捷、更方便，而且随着基

30、因组学的深入研究，及基因测序工程的范围扩大，从而能为蛋白质组学的研究提供更全面的数据库43。3 蛋白质组学在水果品质控制方面的应用蛋白质组学技术作为一项新兴的科技能力将其应用到食品领域，对食品的成分、营养、生物性能等，或是对食品的品质进行评估并采取有效的控制措施，为食品科学领域的发展注入了新能量。当前，人们已经将蛋白质组学技术逐渐应用与食品品质分析及控制，功能性研究，真伪鉴别和安全性检测等方面44-46。近年来，蛋白质组学在水果品质控制方面的应用取得了很大的进展。通常评判果实采收成熟度的依据主要有：果色、硬度和可溶性固形物等，但这些指标容易受品种、生长条件和季节的影响，因此寻找不受外界环境因素

31、影响的指标用其判断果实的成熟度变得十分必要。这样也为水果果实的保鲜贮藏提供工具。在果实成熟衰老的研究中将蛋白质组学与上游的基因组学、转录组学和下游的代谢组学、表型组学相结合，可以更加系统地阐述果实的生理代谢过程15。这样可以为水果果实贮藏保鲜过程中提供有效的检测工具并为选择合适的保藏方法提供合理的方向。研究发现，在日本李、欧洲李、桃和油桃4种核果类果实的最佳采收期均有4个特异蛋白合成（Z1、Z2、Y和X），它们属于一系列参与防御的抗原物质，可以作为判断桃、李和油桃果实最佳成熟度的一种新方法46。3.1 蛋白质组学在水果果实生长发育研究中的应用果实在发育的过程中，蛋白质含量变化较快，并相较于成熟

32、阶段，发育阶段的果实蛋白含量相对较高。Faurobert M等47在研究番茄发育和成熟过程中的蛋白质组变化中，发现7种蛋白参与果实发育，分别为碳水化合物代谢相关蛋白，氨基酸代谢相关蛋白，蛋白质命运相关蛋白，光合作用、呼吸作用相关蛋白，信号传导相关蛋白，胁迫反应相关蛋白，次生代谢相关蛋白。果实在发育过程中，高表达的蛋白主要存在于细胞质和叶绿体中，参与光合作用，糖、蛋白质代谢，细胞壁代谢等；在果实成熟过程中，高表达的蛋白主要是与胁迫反应相关的蛋白。Giribaldi M等48研究了内比奥罗葡萄成熟过程中果实蛋白质组的动态变化，从花后1个月到完全成熟，共得到了730个蛋白点，其中118个为差异蛋白点

33、，93种蛋白成功得到鉴定，它们大多数与新陈代谢、能量、蛋白质合成与降解相关。在转色期前后，与果实表面蜡质和萜类化合物合成相关的柠檬酸裂解酶、乙酰COA转乙酰酶，与氨基酸代谢有关的甲硫氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶等大量表达。在果实成熟过程中，糖酵解能力下降，细胞骨架进行了重新排列。果实发育成熟是果实生命周期的重要组成阶段，这期间经历着一系列复杂的代谢变化，包括叶绿素、呼吸作用的改变、多糖的降解，芳香物质、类胡萝卜素和各类植物激素的合成等。近年来，大量的实验证据表明，果实成熟是一系列与成熟相关基因时空表达以及相互作用的结果。蛋白质组学技术在果实发育研究中的应用，可以为更全面、系统地阐明果实发育机制而提供

34、线索。3.2 蛋白质组学在水果果实采后研究中的应用在蛋白质组学的迅猛发展下，双向电泳技术、质谱技术及生物信息学为核心的蛋白质组学技术逐渐参与到水果果实采后生理及病理学研究中。近年来，在水果果实采后生理病理学方面的蛋白质组学研究成果颇为显著。目前已经应用于番茄、桃、葡萄、柑橘、草莓、苹果等果实成熟衰老的研究，在这方面的研究应用主要集中在以下几个方面：成熟过程不同品种、不同成熟度果实的蛋白表达比较；水果果实的抗病性研究；水果果实的冷害机理研究；采后处理对果实成熟调控机理的研究等。水果果实的发育成熟是一项重要的阶段，而采收前后的成熟衰老在食品科学研究的意义上则更为重要，这个阶段设计到淀粉向糖的转化，

35、色素的合成，芳香物质的积累，细胞壁的修饰，多酚类物质及抗氧化系统的变化等49，这些过程在受到基因表达、生长发育阶段和激素调控等因素的调控的同时也受到果实采后处理方法、贮藏条件和时间等的调节。国内外的科研人员在基因表达、生理生化方面进行大量的研究，以满足对果实成熟衰老的分子机理的研究需要。但在果实成熟衰老的过程中对蛋白质表达的研究处于萌芽阶段。有专家认为15将蛋白质组学与基因组学、转录组学及代谢组学、表型组学相结合，对果实的成熟衰老的生理代谢研究的阐述能更加的系统清晰。利用蛋白质组学对研究与成熟衰老相关的功能性蛋白或者基因变化，为水果果实成熟衰老过程中各个生理生化过程分子机理的研究提供新的技术方

36、法和证据。3.2.1 水果果实成熟衰老机制研究 Guarino等50对苹果果实的蛋白质进行了分离分析并得到了蛋白图谱，得到303个清晰的蛋白点，44类蛋白由28个基因编码，其中参与能量代谢和成熟胁迫与防御的蛋白（病程相关蛋白）的最多，能量代谢包括磷酸戊糖途径、糖酵解途径、发酵作用和呼吸作用等。Faurobert等47利用荧光差异凝胶双向电泳(DIGE)技术对樱桃番茄成熟过程中的蛋白差异表达进行了研究。结果发现未成熟的番茄果实中：蛋白合成和氨基酸代谢的蛋白在细胞分裂阶段表达较多，随后表达量逐渐降低；在细胞膨胀阶段，参与光合作用和细胞壁形成的蛋白表达逐渐增加。成熟果实中，碳水化合物代谢和抵抗胁迫的

37、蛋白表达较多，这些蛋白变化贯穿着番茄果实成熟的全过程。水果果皮在一定程度上可以保护果实免受物理损伤和微生物侵染。Negri等51研究了葡萄成熟过程中果皮蛋白质的变化，通过LC-ESI-MS/MS鉴定出69个差异蛋白，这些蛋白分别参与了糖代谢、胁迫反应、氨基酸代谢等。研究发现参与基础代谢成熟的相关蛋白在果皮中被诱导表达而与前人以全果肉作为实验材料研究出现下调表达结果不同。其实，Pig-nataro等52在实验中利用蛋白质组学的方法(2DE，LC-ESI-MS/MS和ESTs数据库)鉴定出柠檬果实外皮含有大量的微生物糖类蛋白Cit s1异构体，它的分子量在20120 kDa之间。3.2.2水果采后

38、处理对果实成熟调控机制研究 对采后水果应用适当的处理，不仅可以延长果实的贮藏时间，保证水果的品质，而且也是保证市场季节性调控的有效措施。然而由于采后处理对果实成熟过程的调控机理仍不十分清楚，使得采后处理所采用的方法严重受限，也没有可观的发展前景。采用蛋白质组学技术来研究分析果实采后处理中果实成熟衰老的调控机制，希望可以得到明了的机理并为水果果实保鲜技术提供理论支持53。Wang等54研究草酸对枣的胁迫反应，利用蛋白质组学技术研究结果表明，适量草酸作用能抑制乙醇脱氢酶的表达及其活性，降低乙醇的含量；对乙烯的产生起到抑制作用，提高胱硫醚合酶的表达；同时能引发抗性蛋白的表达，抑制果实颜色变红，延缓枣

39、的衰老过程，并提高枣果实对青霉菌侵袭的抵抗力。Zhang等55对桃果实进行热处理实验，将桃果实在48热水中浸泡10 min后贮藏于室温条件下，经过蛋白质组学分析发现，热处理组和对照组共有30个蛋白达到2倍差异表达，这些蛋白主要参与了胁迫反应和防御、细胞结构、蛋白代谢、能量和代谢、成熟衰老，还有大概17%为功能未知。其中热处理诱导了两个分子量分别为17.7 kDa和17.4 kDa的小分子热激蛋白(mHSP)和18.4 kDa的应激蛋白，同时参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环的两个重要酶类抗坏血酸过氧化物酶和双脱氢抗坏血酸还原酶的表达，降低活性氧的含量，对糖酵解过程的酶类和成熟相关蛋白的表达有一定的抑制

40、作用，从蛋白水平方面解释了热处理对果实衰老、维持果实品质的生化机理有延缓作用。4 蛋白质组学在食品加工检测方面的应用前景尽管蛋白质组学诞生的时间较短，于二十世纪九十年代中期问世。但其发展速度迅速，目前已经在生物学、医学、食品科学等各领域得到应用。作为一门新兴的学科，蛋白质组学在蛋白质水平上对蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用进行探索，为食品成分的功能、安全性及食品营养组分的研究提供了理论和基础，并极大的拓展了食品科学的研究领域，同时促进了食品科学快速的反战，逐渐成为食品品质控制研究的一个高准确性、高灵敏度、高通量的研究平台。面对目前不断出现的各种食品营养及质量安全问题，

41、蛋白质组学技术为解决食品安全问题的提供了新的思路和方法。通过对食品中蛋白质的检测和分析可以确定食品中是否掺假，还可以得知掺假物的具体品种，甚至精确到可以得知掺假物来自动植物体的具体部位，这使得食品质量检测在精准度方面更进了一步。但是，现在蛋白质组学技术仍有很多不足之处，今后蛋白质组检测方法应该向便捷灵敏方向发展：操作的半自动化甚至自动化，减少工作量，提高重复性，缩短时间等。我们可以充分利用色谱良好的分离能力与光谱的结构鉴别能力以及双向凝胶电泳技术高分辨率能力，并将其结合使用，并且对食品的功能成分、营养成分及食品鉴伪的研究会是未来蛋白质组学在食品领域的发展趋势。参考文献：1 金良, 陈尚武, 马

42、会勤. 葡萄蛋白质组学研究进展J. 中国生物工程杂志, 2010, 30(10): 100-1072 Kahn P. From genome to proteome: looking at a cells proteinsJ. Science, 1995, 270: 369-3703 Manso M, Leonil J, Jan G, et al. Application of proteomics to the characterisation of milk and dairy productsJ. International Dairy Journal, 2005, 15(6): 845

43、-8554 Wasinger VC, Cordwell SJ, CerpaPoljak A, et al. Progress with geneproduct mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitaliumJ. Electrophoresis, 2005, 16(1): 1090-10945 Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomesJ. Nature, 2000, 405(6788): 837-8466 卢丞文, 潘晓琪, 田慧琴, 等. 番茄果实中蛋白质的提取和双向电泳条件

44、的优化J. 食品科技, 2010, (010): 196-2007 Tsugita A, Kawakami T, Uchida T, et al. Proteome analysis of mouse brain: Twodimensional electrophoresis profiles of tissue proteins during the course of agingJ. Electrophoresis, 2000, 21(9): 1853-18718 Maldonado AM, Echevarra-Zomeo S, Jean-Baptiste S, et al. Evalua

45、tion of three different protocols of protein extraction for Arabidopsis thaliana leaf proteome analysis by two-dimensional electrophoresisJ. Journal of proteomics, 2008, 71(4): 461-4729 Damerval C, De Vienne D, Zivy M, et al. Technical improvements in twodimensional electrophoresis increase the leve

46、l of genetic variation detected in wheatseedling proteinsJ. Electrophoresis, 1986, 7(1): 52-5410 Hurkman WJ, Tanaka CK. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresisJ. Plant Physiology, 1986, 81(3): 802-80611 Isaacson T, Damasceno CM, Saravanan RS, et

47、al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissuesJ. Nature Protocols, 2006, 1(2): 769-77412 Vincent D, Wheatley MD, Cramer GR. Optimization of protein extraction and solubilization for mature grape berry clustersJ. Electrophoresis, 2006, 27(9): 1853-186513 Wang W, Bia

48、nchi L, Scali M, et al. Proteomic analysis of -1, 3-glucanase in grape berry tissuesJ. Acta Physiologiae Plantarum, 2009, 31(3): 597-60414 Meyer Y, Grosset J, Chartier Y, et al. Preparation by twodimensional electrophoresis of proteins for antibody production: Antibodies against proteins whose synth

49、esis is reduced by auxin in tobacco mesophyll protoplastsJ. Electrophoresis, 2005, 9(11): 704-71215 Palma JM, Corpas FJ, del Ro LA. Proteomics as an approach to the understanding of the molecular physiology of fruit development and ripeningJ. Journal of proteomics, 2011, 74(8): 1230-124316 Gornall A

50、G, Bardawill CJ, David MM. Determination of serum proteins by means of the biuret reactionM. 194917 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagentJ. J biol chem, 1951, 193(1): 265-27518 BradfordMM. A rapid and sensitive method for the quantitation of micro

51、gram quantities of protein utilizing the principle of proteindye bindingJ. Anal Biochem, 1976, 72(7): 248-25419 Levashov PA, Sutherland DS, Besenbacher F, et al. A robust method of determination of high concentrations of peptides and proteinsJ. Analytical biochemistry, 2009, 395(1): 111-11220 Ram S,

52、 Sharma S, Verma A, et al. Comparative analyses of LMW glutenin alleles in bread wheat using allele-specific PCR and SDS-PAGEJ. Journal of Cereal Science, 2011, 54(3): 488-49321 徐祥云, 彭君, 何志坤. 浅谈毛细管电泳的基本原理及相关技术J. 宁夏农林科技, 2012, v.53;No.367(11): 91-92+9522 孟庆芳, 张养军, 王京兰, 等. 复杂生物体系中蛋白质高效分离分析技术的新进展J. 色谱,

53、 2005, 23(1): 26-3123 Cellulaire B. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountainsJ. Proteomics, 2002, 2: 3-1024 Grg A, Weiss W, Dunn MJ. Current twodimensional electrophoresis technology for proteomicsJ. Proteomics, 2004, 4(12): 3665-3685

54、25 Lei Z, Elmer AM, Watson BS, et al. A two-dimensional electrophoresis proteomic reference map and systematic identification of 1367 proteins from a cell suspension culture of the model legume Medicago truncatulaJ. Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4(11): 1812-182526 王玉琪, 彭新湘. 适用于水稻叶片蛋白质组分析的双向

55、电泳技术J. 植物生理与分子生物学学报, 2006, 32(2): 252-25627 李肖芳, 韩和平, 王旭初, 等. 适用于盐生植物的双向电泳样品制备方法J. 生态学报, 2006, 26(6): 1848-185328 曹尚银, 张秋明, 郭俊英, 等. 蛋白质组学研究技术及其在果树学中的应用J. 果树学报, 2005, 22(2): 138-14229 GORG A, WEISS W. Protein profile comparisons of microorganisms, cells and tissues using 2D gelsM. Elsevier, Amsterdam

56、, 200430 王一鸣, 花宝光, 王有年, 等. 桃果实蛋白质双向电泳影响因素的研究J. 园艺学报, 2007, 34(6): 1579-158431 杨爱珍, 王一鸣, 花宝光, 等. 桃果实硬核后期中果皮与内果皮中蛋白质组表达的双向电泳分析J. 中国农学通报, 2010, 26(14): 59-6432 Smith RD. Trends in mass spectrometry instrumentation for proteomicsJ. Trends in biotechnology, 2002, 20(12): s3-s733 王昕, 田芳, 张养军, 等. 基于质谱技术的蛋白

57、质组定量方法J. 生命的化学, 2011, 31(1): 134-14034 Patterson SD, Aebersold R. Mass spectrometric approaches for the identification of gelseparated proteinsJ. Electrophoresis, 2005, 16(1): 1791-181435 Mann M, Hendrickson RC, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometryJ. Annual review of bio

58、chemistry, 2001, 70(1): 437-47336 Jackson AM, Boutell J, Cooley N, et al. Cell-free protein synthesis for proteomicsJ. Briefings in functional genomics & proteomics, 2004, 2(4): 308-31937 狄翠霞, 张红, 杨立娜, 等. 无细胞蛋白质芯片的制备及其应用J. 中国生物化学与分子生物学报, 2012, v.28(01): 28-3438 汪琳, 邢佑尚, 周琦, 等. 3种转基因成分检测蛋白芯片的研制J. 植物检疫, 2011, 25(3): 1-639 Fung