《基因芯片技术》第4章利用基因芯片进行基因表达谱分析

1、基因芯片技术Gene chip technology第四章 利用基因芯片进行基因表达谱分析内容提要：第一节基因芯片应用 一、基因芯片的应用范 二、CDNA芯片的应用范 三、寡核甘酸芯片的应用范围四、单双色荧光系统第二节 阵列表达分析(Expression Analysis Arrays)一、Unique PM-MM Probe Design二、PMMM探针设计的优势三、单链和双链探针第三节基因芯片实验流程及方法一、cDNA microarray (TWO CHANNEL MICROARRAY)二、Affymetrix Expression Analysis第四部分数据分析流程图第一节基因芯片应

2、用基因芯片主要用于:RNA的检测：表达丰度，剪切体DNA的检测：SNP, CGH （比较基因组杂交）Methylation （甲基化作用） cDNA芯片主要用于：表达谱芯片，CGHRNA寡核甘酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯片DNA- aCGH SNPsAlternate-ChlP/LA -5Upresslpj? Splicing - miRNA ChromosomesDNA Gene promotersnRNA mRNA variants microRNAs双色荧光系统 cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片实验组及对照组两种组织的mRNA在反转录成 cDNA的过程中分别标记上C

3、y3和Cy5两种荧光, 竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量,通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中基因表达是否有变化。单荧光系统芯片的原理及流程图混合探针杂交Cy3标记的A组织mRNACy5标记的B组织mRNA以两种波长的激光扫描Cy3-532nmCy5-635nm数据分析、寻找差异表达的基因单色荧光系统较短的寡核昔酸芯片如Affymatrix芯片;载有较长片段的寡核昔酸芯片也可使用,如川umina （可照明的）芯片实验组和对照组分别用同样的荧光物质标记（或生物素biotin）,分别与芯片杂交, 即一张芯片

4、只杂交一个样本根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个 片段结合，通过与对照组的比较转化成基 因表达的改变探针A： biotin标记探针B： biotin标记3QS3两张芯片上 相同位点信Bins号比扫描数据分析、寻找差异表达的基因单通道和双通道的比较单通道实验结果重复性更好，使得比较不同样品之间各种基因表达的相对比例是可 靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的 比较时，只需在多个样本中设置对照。点 样的一般是寡核昔酸。双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但是探针可以测序验证。双色法需在每次杂交检测中设置对照，只能进行两个样品之 间的比较，多芯片之间的比较并不可靠。第二节表达阵列分析Unique

5、PM-MM Probe Design (Affymetrix)5*3Probe PairProbe cell or feature上=ChiPEach gene is represented on the probe array by multiple probe pairsEach probe pair consists of a perfect match and a mismatch oligonucleotideP幽t .豺到翳朝铐只有V期幅PMMM探针设计的优势灵敏度提高The Value of Mismatcti ProbesConcentration pM将已克隆的转录产物 以不

6、同的浓度掺入到组 织样品中。经过标记的 样品与 Affymetrix Genechip人类基因组 芯片杂交，在克隆转录 产物浓度低于8PM时， PM单独探针无法探测 出相应的浓度变化，而 与MM探针联合使用则 可以探测出。单链和双链探针双链探针：在液相条件下自我复性 从而大大降低与固着的靶DNA杂交的机会，从而降低了探测灵敏度, 因此需更多的探针量。单链探针：使杂交灵敏度提高RXA Eaqpermrvtrf RNA标记第三节 基因芯片实验流程及方法cDNA microarray(TWO CHANNELMICROARRAY )步骤：1提取mRNA2将mRNA逆转录为 cDNA3 cDNA进行标记

7、4杂交5将未杂交的cDNA洗掉6激光扫描7结果分析Affymetrix Expression AnalysismRNAReverse Transcriptase （拟转录酶）in vitro transcription （体外转录）Fragmentation of cRNA（cRNA的破裂）GeneChip HybridizationHybridization process of GeneChipLabeling cRNA fragmentHybridizatio n mixturehybridization (16hour)DataanalysisWash & stainScan实验步骤:

8、1样本制备:1）提取mRNA （mRNA的纯化方法）2）将mRNA逆转录为cDNA （方法）3） cDNA进行标记（样本量）2样本标记：1）核昔酸的修饰方法2）标记方法：a）扩增mRNA （cRNA）靶分子b）合成cDNA二链3预杂交4杂交：1）杂交过程2）原核生物样品杂交过程5洗涤6染色（如生物素标记）7扫描8数据分析样本制备表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA, 抽提出的mRNA需要经过反转录酶的作用转变 为cDNA,同时进行荧光标记，标记好的cDNA 靶分子就可用于杂交。基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子生物学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持

9、实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息之间的平行性。mRNA的纯化方法两步法：从样本中制备总RNA,再从总RNA中分离mRNA,总RNA中包括rRNA、tRNA和 mRNA,其中90%以上是rRNA和tRNA,分离mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的3 端都有polyA尾，用poly (dT) 纤维素亲和层 析纯化mRNA。 一步法：从组织样本中直接用poly (dT) 纤 维素亲和层析纯化mRNA,这种方法简便，但 RNA的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要 求不高时可采用逆转录：合成cDNA一链 mRNA逆转录合成cDNA时用poly (dT)作引物，可以直接用总RNA作为摸板进行

10、逆转录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从 而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中纯化mRNA的工作总RNA的纯度不如mRNA高，直接从总RNA 进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到 逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA 的纯度样本量从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验需要？非扩增：20微克；扩增：1微克有些情况下，样本极为稀有，不可能得到大量的mRNA靶分子基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程 度上限制了该技术的推广发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯 片实验样本用量类别，揩官,/组织*.提取3,1 竺niRZA 所 需组织量（克），提取1 Oji 1约 11RNTA 所 需

11、组织量（克X同人正常组级a月干70.2083.10 6944成人正常组织脑户鲂i,类成,人正常组织Q月巾Q0.3a1 A成人正常组织心、0.54，1.6667成人正常组织.、牌.0.14290.4762/成人正常组织Q肌+，0.7353.2 451A成人正常组织“皮肤-1.55A成人正常组织,聚丸305，1 6667成人正常组织，贲门一0.38461，1.2821川成人正常组织,甲状腺衣02、0.66G7，类别器官，组织*.提取jjnoiiiRXA / 需组织量（克）提取1 OpiiRJSTA 所 需组织量（克X胎儿。月干一0 1667,，0.5556”胎儿脑,，0.75,2.5胎儿。肺一0.

12、42861.4286胎儿山、0.2-0.6667k胎儿，腔,、0.12.0.6667胎儿，肌.，0.250.8333d胎儿肾A0.3%船儿-软骨一1.24。胎儿户肠。0.250.8333a类别一器官/组织工提取31i肾癌。O.4762c1.5873户病理组织小肝瘙/0.1116/0.3 72病理组织，肺癌C0.128204274c病理组织胆裳煽镰数据广核昔酸的修饰方法生物素标记的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin Fluorescent dye的结合进行检测,标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便，扫描成本较低。荧光素标记的dNT

13、P： Cy3的dNTP , Cy5的dNTP同位素标记的dNTP amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，掺入DNA和RNA链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他 染料；但实验误差大。荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光源激 发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行检测。如 花青素（Cyanin） Cy3、Cy5,其激发和发射波长分别为：550/570和649/670。大部分扫描仪都能对这两 种荧光标记进行图像处理。这种标记方法没有同位 素标记的限制；而且具有极高的灵敏度，能够进行定 量检测标记方法 RNA样本不扩增进行标记：在

14、反转录的体系中加入Cy3或Cy5标记过的dNTP类似物,通过反转录酶的作用，标记新合成的CDNA。 这种实验方法效率较低，对RNA样本需求量大，通常要50200Hg总RNA, 13用mRNA RNA样本扩增后进行标记1在反转录酶的作用下, 反转录生产cDNA一 条链。2并在cDNA一链的3， 端加上非模板的寡聚 C残基3加入3,端带有寡聚G 的引物，可以结合到 cDNA的3,端，生成一 小段双链的cDNA 4再在DNA聚合酶的 作用下延伸5加入RNase H,水 解淖RNA模板，以残 留的与cDNA一链配 对的短片段RNA为引 物，在DNA聚合酶的 作用下生成双链 cDNA扩增mRNA (cR

15、NA)靶分子联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应来完成线性扩增。 PCR方法：同一用量和限制循环次数的条件下， 通过RT-PCR可平行的扩增实验组和对照组的RNA样本以满足实验要求并同时进行荧光标记O 基于T7的mRNA线性扩增：利用模板指导下的体外转录反应来完成线性扩增。该方法能从150ngmRNA分子出发扩增出足够数量的cDNA靶分子。这种扩增方法更具线性合成cDNA二链AAAA 丁总心Ann-n 皿。(虹)-17弓I粉MMLV反转录TS引物夕 TS 引物 GGGaKAA 3CCCTTTI-T7 0HAI Ms H1 rex%总-门 ds CENAcccmr-T7I体外反转录于一

16、CCCVUU1T 宁于一HCmianti-sense 取于一cccumm 5UUUU 5rcccTotal RNA1. Primer hybridization5 I I I I I I I I I I I AAAAA 31 3, TTTTT -5,噬菌体T7 DNA编码 的酶，对T7启动子序 列具有高度特异性， 不能识别其它生物来 源的启动子。是依赖于DNA的RNA 聚合酶，具有5，t3， 的RNA聚合酶活性， 以含有T7启动子序列 的双链DNA为模板， 以NTP为底物，合成 与启动子下游的模板 DNA互补的RNA。2. Reverse transcription First strand

17、cDNA synthesis3. Second strand cDNA synthesis5, I I I I I I I I I I I AAAAA 31TTTTT -55, I I I I I I I I I I I AAAAA 3,31口 ndiooonn。口 ttttt - bsDODDOODOOOO aaaaa - 31aHDnDnnonOD O ttttt - 5,4. Cleanup of double-stranded cDNA5. Amplification and biotin labeling of antisense cRNABk)tinlabeled URibonuc

18、leotides *-C f TTTTT3 I I I I I I I i I I I UUUUU 516. Cleanup ofbiotinylated cRNA芯片杂交*将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交1小时左右(cDNA和长链寡核昔酸，42 (50%甲酰胺)；短链寡核昔酸，50 )杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内反应1418小时洗片，扫描检测杂交量依赖靶DNA和探针的浓度，当靶DNA浓 度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量 成线性关系RNA相对不稳定影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素:1 .核酸浓度2 .探针的类型和长度3 .碱基组成4 .杂交液成分(1)离子强度(2) Formamide(3)(4)季铁盐溶液杂交加速剂5 .不匹配序列6 .杂交时间7 .杂交温度原核生物样品1 . RZA ExtreictionRNA3,2. Random priming eONA syct八os -S1，口口 口口口 口 13. RfMA doQrodotion with ZnOIA. oONA c