J第七章分子荧光分析法

1、荧光的发现荧光的发现植物愈创木切片黄色植物愈创木切片黄色水溶液水溶液天兰色荧光；天兰色荧光；第一节概述第一节概述荧光的发现荧光的发现概述概述 某些物质被一定波长的光照射时，会在一定某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物的矿物 萤石萤石(fluospar)(fluospar)而得名。而得名。紫外荧光、可见荧光紫外荧光、可见荧光红外荧光、红外荧光、X射线荧光射线荧光用荧光抗体染色之用荧光抗体染色之原生动物原生动物澳大利

2、亚科学家最新发现澳大利亚科学家最新发现，一种叫，一种叫“螳螂虾螳螂虾”的海的海里动物通过发出色彩鲜艳里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶或者吸引性配偶，K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 23061 nmgreen-fluorescent protein (GFP)河南工业大学本科生课程化学化工学院分析测试中心第三章第三章 分子荧光分析法分子荧光分析法一、分子荧光一、分子荧光 化合物分子吸收电磁波并发射出另一波长电磁波化合物分子吸收电磁波并发射出另一波长电磁波二、分子荧光分析法二、分子荧光分析法 利用利用物质分子物质分子的

3、的荧光荧光进行分析测定的方法进行分析测定的方法l lex、I0l lem、Ifl lex、I激发光激发光发射光发射光透射光透射光什么结构的化合物具有分子荧光？什么结构的化合物具有分子荧光？基本原理基本原理分子荧光如何测量？分子荧光如何测量？荧光分光光度计荧光分光光度计分子荧光法有何应用？分子荧光法有何应用？分子荧光分析法应用分子荧光分析法应用概述概述第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光

4、的产生一、分子荧光的产生1.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；大多数有机分子的基态处于单重态；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换

5、外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫 3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射

6、射磷磷光光系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫 3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生S0S1S2T1激发单激发单重态重态激发三激发三重态重态激发光谱激发光谱: :固定测量波长固定测量波长( (选最选最大发射波长大发射波长),),化合物发射的荧化合物发射的荧光光( (磷光磷光) )强度与照射光

7、波长的强度与照射光波长的关系曲线关系曲线 （图中曲线（图中曲线I I ） 激发光谱形状与吸收光谱激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者形状完全相似，经校正后二者完全相同！完全相同！ 发射光谱：发射光谱：固定激发光波长固定激发光波长(选选最大激发波长最大激发波长), 化合物发射的荧化合物发射的荧光光(或磷光强度或磷光强度)与发射光波长关与发射光波长关系曲线系曲线(图中曲线图中曲线II或或III)。荧光荧光(磷光磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？：光致发光，照射光波长如何选择？吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显示系统示系统单色器单色器 发射荧光的能量比分子吸收的

8、能量小，波长长； l 2 l 2 l 1 荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长b. 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）

9、成镜像对称关系。 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl lc. c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。成镜像对称关系。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等基态上

10、的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件三、分子荧光与浓度间的关系三、分子荧光与浓度间的关系分子必须能够吸收激发光分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率分子必须具有一定的荧光量子产率)()(affII吸收的光强度荧光强度吸收的光量子数发射的光量子数与激发态分子失活过程的速率常数有关与激发态分子失活过程的速率常数有关ifffkkk发射过程中的速率常数发射过程中的速率常数其他过程有关的速率常其他过程有关的速率常数，主要取决于环境数，主要取决于环境1. 荧光量子产率荧光量子产率2. 分子荧光与浓度间的关系分子荧光与浓度间

11、的关系KclcIIff03 . 2A0.05affII /affIIclIIAt0log)1 (3 . 200cltaeIIIIclclteIII3 . 20010)1 (3 . 20clffeII ! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 21323 . 2clclcleclclecl3 . 213 . 2若若05. 0lcKclcIIff03 . 2 abcIIF03 . 2 KcIF 稀溶液第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素四、影响荧

12、光强度的因素 激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生S0S1S2T1激发单激发单重态重态激发三激发三重态重态吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显示系统示系统单色器单色器 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l 2 l 2 l 1 荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低

13、振动能级基态；3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长b. 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l abcIIF03 . 2 KcIF 稀溶液)()(affII吸收的光强度荧光强度吸收的光量子数发射的

14、光量子数三、分子荧光与浓度间的关系三、分子荧光与浓度间的关系1. 荧光量子产率荧光量子产率第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系三、分子荧光与浓度间的关系四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素（1）跃迁类型）跃迁类型（2） 共轭效应共轭效应（3）取代基效应）取代基效应（4）结构刚性效应）结构刚性效应四、四、 分子荧光与分子结构的关系分子荧光与分子结构的关系 n 振动弛豫振动弛豫激发激发 n荧光荧光（1）跃迁类型）跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系

15、数较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命较短的激发态寿命10-710-9s系间窜越至三重态几率小系间窜越至三重态几率小（2） 共轭效应共轭效应共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。0.070.180.930.27化合物化合物exmax(nm)205286365390580emmax (nm)278321400480640 F0.110.290.460.600.52ONO2化合物化合物 荧光相对强度荧光相对强度苯苯 10苯酚苯酚 18苯胺苯胺 20苯甲酸苯甲酸 3硝基苯硝基苯 0OHNH2COOHNO2NCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-CCHHCCHH

16、（4）结构刚性效应）结构刚性效应（1）跃迁类型）跃迁类型（2） 共轭效应共轭效应（3）取代基效应）取代基效应（4）结构刚性效应）结构刚性效应2. 分子荧光与分子结构的关系分子荧光与分子结构的关系五、影响荧光强度的主要因素五、影响荧光强度的主要因素 1.1.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 2.2.溶剂的影响溶剂的影响 3.3.温度的影响温度的影响 4. 4. 溶液溶液pHpH的影响的影响荧光熄灭（荧光猝灭）：荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低荧光强度降低或荧光强或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。度

17、与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。：引起荧光熄灭的物质。如如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。均为常见的荧光熄灭剂。 1）静态猝灭）静态猝灭2） 动态猝灭动态猝灭浓度限量浓度限量1g1mg/ml荧光猝灭法：荧光猝灭法：利用利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光猝荧光物质荧光强度的减弱与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系灭剂的浓度呈线性关系测定荧光猝灭剂含量的方法。测定荧光猝灭剂含量的方法。 3）荧光物质自猝灭）荧光物质自猝灭2 2）溶剂对荧光强度的影响）溶剂对荧光强度的

18、影响极性增加，荧光光谱红移，荧光产率增加；极性增加，荧光光谱红移，荧光产率增加；粘度增加，荧光产率增加粘度增加，荧光产率增加一般溶剂效应：介电常数，折射率。普遍存在一般溶剂效应：介电常数，折射率。普遍存在特殊溶剂效应：形成氢键特殊溶剂效应：形成氢键巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率3 3）温度对荧光强度的影响）温度对荧光强度的影响随着温度的增高，荧光物随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低荧光强度将降低 不同温度下邻菲啰啉的不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱（在邻二苯中）荧光光谱（在邻二苯中） 碰撞几率增大碰撞几率增

19、大粘度降低粘度降低NH3OHHNH2NHOHHpH13 无荧光无荧光 4 4）介质酸度的影响）介质酸度的影响五、影响荧光强度的主要因素五、影响荧光强度的主要因素 1.1.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 2.2.溶剂的影响溶剂的影响 3.3.温度的影响温度的影响 4. 4. 溶液溶液pHpH的影响的影响第二节第二节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生 光致激发光致激发非辐射跃迁失活非辐射跃迁失活辐射跃迁辐射跃迁二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱三、分子荧光与浓度间的关系三、分子荧光与浓度间的关系KclcIIff03 . 2A0.05四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度

20、的因素1. 荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系 跃迁类型、共轭、刚性平面、取代基跃迁类型、共轭、刚性平面、取代基2. 影响荧光强度的主要因素影响荧光强度的主要因素荧光猝灭、温度、荧光猝灭、温度、pH、溶剂、溶剂激发光源激发光源(light source) 样品池样品池( (吸收池吸收池)()(absorption cell)单色器单色器(monochromator )检测器检测器(detecor)记录及数据处理器记录及数据处理器(display) 一、仪器的主要部件一、仪器的主要部件 7-3 7-3 荧光分析仪器荧光分析仪器样品池样品池I0ItI0ItIF,pn滤光片、棱镜、滤光片、棱镜

21、、光栅光栅单色器单色器混合光混合光单色光单色光狭缝狭缝狭缝狭缝色散原件色散原件准准直直镜镜光电池或光电池或光电倍增管光电倍增管, , 光电二极管阵列式检测器光电二极管阵列式检测器检测器检测器二、荧光光谱仪二、荧光光谱仪吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器信号显信号显示系统示系统二、荧光光谱仪基本结构二、荧光光谱仪基本结构单色器单色器荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计光路光路光源光源仪器仪器校正校正吸收池吸收池入射光与吸收光入射光与吸收光同方向同方向入射光与荧光垂入射光与荧光垂直方向

22、直方向两种光源两种光源(紫外紫外+可见可见)一种光源一种光源(紫外紫外)空白溶液空白溶液(F=0)荧光对照品溶液荧光对照品溶液(F=100%或或50%)空白溶液空白溶液(T=100%)紫外无吸收紫外无吸收两面透光两面透光低荧光材料低荧光材料四面透光四面透光一、荧光分析法的特点一、荧光分析法的特点（1 1）信息量多：包括物质信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子产率、荧光寿命荧光量子产率、荧光寿命等。等。（2 2）选择性强）选择性强（3 3）试样量少，应用范围广。）试样量少，应用范围广。（4 4）灵敏度高）灵敏度高 分析物浓度范围：分析物浓度范围：1010

23、-5-5 1010-8 -8 mol/Lmol/L，检测下限：，检测下限：0.10.10.0010.001 g/mLg/mL 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级。个数量级。 定性方法定性方法 特征光谱：特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。 定量定量方法方法 If = 2.3 I0 b c = Kc比较法比较法xsxsCCFFFF00ssxxCFFFFC003. 荧光分析注意事项1） 防止荧光污染2） 防止散射光的干扰1.1.直接测定和间接测定直接测定和间接测定直接测定直接测定：被测物质本身发生荧光：被测物质本身发生荧光间接测定间接测定：被测物质本身不发荧光或荧光量子产率很低。：被测物质本身不发荧光或荧光量子产率很低。衍生化法；衍生化法；荧光猝灭法荧光猝灭法1.1.无机物分析：采用无机物分析：采用间接法间接法（1 1）与有机试剂形成配合物后测量）与有机试剂形成配合物后测量Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、T