高效液相色谱补充内容

1、第八章第八章 hplc的补充内容的补充内容液相色谱键合相的类型和色谱液相色谱键合相的类型和色谱性质的主要影响因素性质的主要影响因素高效液相色谱键合固定相的类型高效液相色谱键合固定相的类型主要有四类：主要有四类： 硅硅-氧氧-碳键型固定相碳键型固定相 硅硅-氮氮-碳键型固定相碳键型固定相 硅硅-氧氧-硅硅-碳键型固定相碳键型固定相 硅硅-碳键型固定相碳键型固定相siocsincsi o si csi c1、硅、硅-氧氧-碳键型固定相碳键型固定相制备方法之一：制备方法之一： 高压、过量醇、高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅度条件下与硅胶的硅羟基发生反应。羟基发生反应。制备方法之二：制备方法之二

2、： 亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，再与过量醇进行醇解反应。再与过量醇进行醇解反应。缺点：容易被水解缺点：容易被水解2、硅、硅-氮氮-碳键型固定相碳键型固定相制备方法：制备方法： 先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅胶反应。胶反应。对有机溶剂和对有机溶剂和ph=3-8的水介质稳定。的水介质稳定。3、硅、硅-氧氧-硅硅-碳键型固定相碳键型固定相制备方法：制备方法： 硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应硅氧烷进行硅烷化反应 。对有机溶剂和对有机溶剂和ph=2-8.5的水介质是稳定

3、的。的水介质是稳定的。4、硅、硅-碳键型固定相碳键型固定相制备方法：制备方法： 氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应。氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应。稳定性优于硅稳定性优于硅-氧氧-碳键型固定相，但生成的产碳键型固定相，但生成的产物覆盖度较低。物覆盖度较低。键合固定相的性质键合固定相的性质1、表面覆盖度、表面覆盖度完全水解的硅胶表面有完全水解的硅胶表面有8umol/m2硅羟基，由于位阻硅羟基，由于位阻的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应。的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应。好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂与参与硅羟基反应，以消除其不良影响。与

4、参与硅羟基反应，以消除其不良影响。表面覆盖度越高，色谱保留越强。表面覆盖度越高，色谱保留越强。2、键合相链长的影响、键合相链长的影响对于反相色谱固定相对于反相色谱固定相 键合相链长越长保留越键合相链长越长保留越强强对于正相色谱固定相对于正相色谱固定相 链长的影响不明显。链长的影响不明显。3、键合固定相基质性质的影响、键合固定相基质性质的影响基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。色谱柱色谱柱 hplc柱填料柱填料1、全多孔球形硅胶填料最为普遍、全多孔球形硅胶填料最为普遍硅胶基质分为微

5、孔硅胶基质分为微孔(小于小于2nm)，中孔，中孔(2-50nm)，大孔大孔(大于大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅硅胶，多用中孔和大孔硅胶填料胶填料2、其它金属氧化物基质填料、其它金属氧化物基质填料tio2、zr o2、高分子聚合物等基质的填料，、高分子聚合物等基质的填料，能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。 硅胶色谱柱填料的优势硅胶色谱柱填料的优势 硅胶有良好的机械强度硅胶有良好的机械强度 硅胶的孔结构和比表面积容易控制硅胶的孔结构和比表面积容易控制 硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性定性 硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以

6、进行化硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰学键合修饰 硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应 碱性分析物严重拖尾，分离度低。碱性分析物严重拖尾，分离度低。加入碱性流动相加入碱性流动相添加剂抑制添加剂抑制 反相色谱柱填料保留性能随温度的变化反相色谱柱填料保留性能随温度的变化lnkh=rtosro+ln-lnk与与1/t在一定温度范围内呈线性关系在一定温度范围内呈线性关系 提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能 提纯硅胶，利用高纯提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填硅胶色谱填料料 对硅胶进行充分封端（尾）对硅胶进行充分封端（尾

7、） 利用空间位阻掩蔽残余硅羟基利用空间位阻掩蔽残余硅羟基 键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基）酰胺基）1.1.双齿键合相双齿键合相高效液相色谱的流动相高效液相色谱的流动相 常用反相色谱流动相：甲醇常用反相色谱流动相：甲醇-水、乙腈水、乙腈-水水 常用正相色谱流动相：正己烷常用正相色谱流动相：正己烷-异丙醇、正异丙醇、正己烷己烷-乙醇、正己烷乙醇、正己烷-四氢呋喃四氢呋喃 常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化钠钠 需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱，溶剂紫外截止波长见

8、表吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表9-4。高效液相色谱方法的选择高效液相色谱方法的选择 反相色谱可以分析多数样品。反相色谱可以分析多数样品。 极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱，难以有效分离，可以用正相色谱很弱，难以有效分离，可以用正相色谱（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂-水流动相水流动相分离。分离。 弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离。弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离。 分析离子，首选离子色谱。分析离子，首选离子色谱。 生物分子的分离模式有反相、离子交换、生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式。体积排

9、阻、疏水作用、亲和色谱模式。色谱条件的影响色谱条件的影响 色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越小分离度越高。小分离度越高。 柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离度越大，但柱压越高（度越大，但柱压越高（5m到到3m柱效提高柱效提高30%柱压却升高柱压却升高1倍）。倍）。 流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。减弱。 流速越高，保留时间越短，但柱压液越高。流速越高，保留时间越短，但柱压

10、液越高。 柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低。柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低。 在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时，可以进行梯度洗脱。峰形时，可以进行梯度洗脱。40度度169bar90度度94bar温度的影响温度的影响sb-c8 4.6x75mm 3.5um流通池流通池: 5mm, 2.5ul2060%b (10min.)2ml/min.sb-c8 4.6x150mm 5um流通池流通池: 10mm, 8ul2060%b (30min.)1ml/min.填料粒径填料粒径的影响的影响5um色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm

11、3.5um色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm填料粒径填料粒径的影响的影响-cn柱柱-苯基柱苯基柱c8柱柱填料种类填料种类的影响的影响液相色谱仪器的维护和维修液相色谱仪器的维护和维修 流动相需要用流动相需要用0.45m的微孔滤膜进行过滤的微孔滤膜进行过滤微孔滤膜微孔滤膜滤膜种类分为滤膜种类分为过水相过水相和和过有机相过有机相两种两种 过滤有机相流动相用有机（聚四氟乙烯）过滤有机相流动相用有机（聚四氟乙烯）滤膜。滤膜。 过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜。过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜。 盐溶液作为流动相时，需要先将盐溶解后盐溶液作为流动相时，需要先将盐溶解后再进行过滤，不能先过滤完

12、水再溶解盐，再进行过滤，不能先过滤完水再溶解盐，防止盐中的固体不溶物堵塞流路。防止盐中的固体不溶物堵塞流路。 注意：用于过滤无机流动相的滤膜溶于有注意：用于过滤无机流动相的滤膜溶于有机溶剂。机溶剂。 样品需要用样品需要用0.22m的微孔滤膜进行过滤的微孔滤膜进行过滤 样品需要用样品需要用0.22m的微孔滤膜进行过滤的微孔滤膜进行过滤针式样品过滤器针式样品过滤器 流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过滤白头，导致泵压过高，需要及时更换。滤白头，导致泵压过高，需要及时更换。安捷伦液相色谱仪更换过滤白头安捷伦液相色谱仪更换过滤白头 密封圈老化、磨碎，导致漏液密封

13、圈老化、磨碎，导致漏液 检测器的维护一检测器的维护一氘灯（寿命氘灯（寿命2000h左右，价格左右，价格5000-6000元）元）不宜频繁开关不宜频繁开关 开开+关关=4小时小时需要用时才开，不使用时最好关闭需要用时才开，不使用时最好关闭冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器 一是节省灯的使用，二是防止污染检测器一是节省灯的使用，二是防止污染检测器 多数仪器的检测器电源开关在开机时就已打多数仪器的检测器电源开关在开机时就已打开，但灯的开关并没有开。开，但灯的开关并没有开。 检测器的维护二检测器的维护二 不用时充满有机流动相，如甲醇，乙腈等。不用时充满有机流动相，如甲

14、醇，乙腈等。 长时间未用在开始使用时检测器内可能会长时间未用在开始使用时检测器内可能会有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间增大放开后气泡会被冲出。增大放开后气泡会被冲出。检测器（连有进出液两管）被堵，先检查检测器（连有进出液两管）被堵，先检查是否是进液管被堵（多数情况下它被堵），是否是进液管被堵（多数情况下它被堵），用小流速倒冲，出液管连接泵。用小流速倒冲，出液管连接泵。 色谱柱的维护色谱柱的维护 色谱柱的保存参考购

15、买色谱柱的说明书，一色谱柱的保存参考购买色谱柱的说明书，一般反相色谱柱（般反相色谱柱（c18，c8等）用色谱纯甲醇等）用色谱纯甲醇或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存。或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存。 色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时（或本次使用时）残留在固定相上的样品污（或本次使用时）残留在固定相上的样品污染物等。染物等。色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污染了检测器。染了检测器。色谱柱使用多次后（出现柱压高、柱效低等）色谱柱使

16、用多次后（出现柱压高、柱效低等）参考说明书冲洗再生。参考说明书冲洗再生。 色谱柱的正确连接色谱柱的正确连接尽量减小缝隙，以减小死体积，减小色谱峰的展宽尽量减小缝隙，以减小死体积，减小色谱峰的展宽键合相稳定性取决于键合技术键合相稳定性取决于键合技术流动相中有机组分流动相中有机组分含量高时含量高时流动相中有机组分流动相中有机组分含量低时含量低时传统的键合和封端（封尾）传统的键合和封端（封尾）固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷封端封端三甲基氯硅烷三甲基氯硅烷传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应。具体表

17、现为保留减弱和残余硅羟基效应。侧链位阻基团大的侧链位阻基团大的键合相分子键合相分子主要依据色谱柱及填料参数主要依据色谱柱及填料参数 基质类型基质类型 粒径大小粒径大小 孔径大小孔径大小 碳含量高低碳含量高低 封尾类型封尾类型 色谱柱内径色谱柱内径 色谱柱长度色谱柱长度uplc和快速液相色谱和快速液相色谱 仪器方面代表性的是仪器方面代表性的是2004年年waters公司推出公司推出aquity 超高效液相色谱超高效液相色谱(uplc)，agilent公司公司 从从2006年相继推出年相继推出agilent 1200、1260、1290具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液具有更高耐压限和灵活性的

18、高分离度快速液相色谱系统（相色谱系统（rrlc）。）。 色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同品牌的亚品牌的亚2m（1.7m）的色谱柱，及性能和）的色谱柱，及性能和工作范围各不相同的超高效液相色谱产品。工作范围各不相同的超高效液相色谱产品。使用亚使用亚2微米粒径的色谱柱，用微米粒径的色谱柱，用agilent 1200系列高分离度快系列高分离度快速液相色谱（速液相色谱（rrlc）系统进行快速和超快速分析）系统进行快速和超快速分析uplc 超高效液相色谱（超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography uplc）

19、是分离科学中的一个全新类）是分离科学中的一个全新类别，别，uplc借助于借助于hplc（高效液相色法）的理论及原（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高效液相色谱是一个新兴的领域，色谱峰容量。超高效液相色谱是一个新兴的领域，作为世界第一个商品化作为世界第一个商品化uplc产品的产品的waters acquity uplctm 超高效液相色谱系统在超高效液相色谱系统在1996年问世，之后年问世，之后像安捷伦、岛津等公司也

20、陆续开始生产超高效色谱像安捷伦、岛津等公司也陆续开始生产超高效色谱仪。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入仪。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。液相实验中。agilent 1290 液相色谱系统液相色谱系统 uplc的原理与的原理与hplc相同，所改变的地方主相同，所改变的地方主要有以下几点：要有以下几点： 小颗粒、高性能微粒固定相的出现。小颗粒、高性能微粒固定相的出现。hplc色色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是粒径是5um，而，而uplc的色谱柱，会达到的色谱柱，会达到3.5um，甚至，甚至1.7um，具有更高柱效

21、，更加利于物质，具有更高柱效，更加利于物质分离。分离。超高压输液泵的使用。超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。液泵。 高速采样速度的灵敏检测器。高速采样速度的灵敏检测器。 与传统的与传统的hplc相比，相比，uplc的速度、灵敏度的速度、灵敏度及分离度分别是及分离度分别是hplc的的9倍、倍、3倍及倍及1.7倍，倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。降低

22、了分析成本。uplcuplc比比hplchplc更为优越，主要表现为更高效的更为优越，主要表现为更高效的分离效率，即分析时间更短和分离度更大。分离效率，即分析时间更短和分离度更大。 制备色谱制备色谱是能够获得一定量（从几毫克到千是能够获得一定量（从几毫克到千克甚至吨级）纯品的色谱分离方法。克甚至吨级）纯品的色谱分离方法。 制备色谱在制备色谱在医药工业医药工业（如外消旋体药物分子（如外消旋体药物分子的分离），的分离），生化技术生化技术（生物制品的纯化和植（生物制品的纯化和植物化学组分的纯化），物化学组分的纯化），精细化学品精细化学品的生产方的生产方面已成为越来越重要的制备分离手段。很多面已成为越

23、来越重要的制备分离手段。很多高纯标样只能用制备色谱获得。高纯标样只能用制备色谱获得。 为了满足生物、中药等复杂体系分离纯化的为了满足生物、中药等复杂体系分离纯化的任务，任务，制备色谱越发发挥出其作用。制备色谱越发发挥出其作用。 制备型液相色谱技术可以简单的认为是分制备型液相色谱技术可以简单的认为是分析型液相色谱技术的放大，一是输液泵有析型液相色谱技术的放大，一是输液泵有高的流量，二是所用的色谱柱有大的直径高的流量，二是所用的色谱柱有大的直径和柱填料有大的粒径，三是大的进样量，和柱填料有大的粒径，三是大的进样量，四是可以获得纯品。四是可以获得纯品。 分析型色谱注重的是分离度和分离速度，分析型色谱

24、注重的是分离度和分离速度，而制备色谱以获得纯品为唯一目的，在牺而制备色谱以获得纯品为唯一目的，在牺牲分离度和分析速度的前提下获得纯品。牲分离度和分析速度的前提下获得纯品。 分析色谱目的分析样品，制备色谱以获得纯品为目的分析色谱目的分析样品，制备色谱以获得纯品为目的 分析型色谱进样量小够检即可，制备色谱进样量尽可分析型色谱进样量小够检即可，制备色谱进样量尽可能大。能大。 分析色谱柱内径分析色谱柱内径1-5mm，制备色谱柱，制备色谱柱1-10cm甚至更大甚至更大 分析柱填料分析柱填料7m。 分析色谱流速分析色谱流速 10ml/min 分析色谱检测器可以破坏样品（如电化学检测器），分析色谱检测器可以破坏样品（如电化学检测器），制备色谱检测器不能对样品造成破坏。制备色谱检测器不能对样品造成破坏。 分析色谱流动相不需要易挥发，制备色谱流动相必须分析色谱流动相不需要易挥发，制