细胞工程学第3章

1、第第 三三 章章 动物动物细胞培养技术细胞培养技术 动物细胞培养可以在同一时期、动物细胞培养可以在同一时期、相同条件、相似性状的条件下提供相同条件、相似性状的条件下提供大量的实验样本，开展科学研究，大量的实验样本，开展科学研究，相对耗资较少，因而成为生物制品、相对耗资较少，因而成为生物制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的单克隆抗体和基因工程制品生产的重要手段。重要手段。 原代培养的细胞特点：原代培养的细胞特点：（1 1）原始性）原始性（2 2）不均一性）不均一性 一、取一、取 材材理论：理论： 各种动物和人体内所有组织都可进各种动物和人体内所有组织都可进行培养。行培养。实际：实际： 幼体组织尤

2、其是胚胎组织比老年的幼体组织尤其是胚胎组织比老年的易培养；分化程度底的组织比分化程易培养；分化程度底的组织比分化程度高的易生长；肿瘤组织比正常组织度高的易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。容易培养。一般要求：一般要求： 无特定的要求时，取容易培养的组无特定的要求时，取容易培养的组织进行培养，成功率高。取材后最好立织进行培养，成功率高。取材后最好立即培养，因故不能培养时，应把组织切即培养，因故不能培养时，应把组织切成成1cm1cm3 3左右的左右的小块小块，置培养液中，置培养液中，44储储存存，存放时间不宜超过，存放时间不宜超过2424小时。小时。为什么？为什么？ 2 2、取人体皮肤或活检材料、

3、取人体皮肤或活检材料 （1 1）皮肤用）皮肤用75%75%酒精消毒；酒精消毒；（2 2）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界；）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界；（3 3）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。 这种取皮方法的这种取皮方法的优点优点是表皮细胞多，培是表皮细胞多，培养容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须养容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须先准备含双抗的先准备含双抗的BSSBSS液送入手术间，手术后液送入手术间，手术后储储44冰箱。冰箱。 3 3、取内脏和实体瘤、取内脏和实体瘤 内脏除消化道外基本是无菌的，内脏除消化道外基本是无菌的，要明确和熟悉所需组织的类型和部

4、要明确和熟悉所需组织的类型和部位。位。 实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染。部分，以防污染。4 4、取鼠胚、取鼠胚5 5、取各种动物材料、取各种动物材料 先准备好一瓶含双抗的无菌先准备好一瓶含双抗的无菌PBSPBS液，待处死动物后，迅速取出液，待处死动物后，迅速取出所需要的脏器组织，放入无菌所需要的脏器组织，放入无菌PBS PBS 液内，尽快将实验材料送入超净液内，尽快将实验材料送入超净工作台，进行细胞原代培养。工作台，进行细胞原代培养。二、组织分离方法二、组织分离方法 从体内取出的各种组织均由众多的从

5、体内取出的各种组织均由众多的细胞和纤维成分组成，且结合十分紧密。细胞和纤维成分组成，且结合十分紧密。 为获取大量生长良好的细胞，必须把组为获取大量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开来，使织细胞分散开来，使细胞解离细胞解离出来；能出来；能达到达到单细胞单细胞水平更好，同时并不使细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害。受伤害。1 1、离心分离法、离心分离法 适用范围：适用范围：血液、羊水、腹水和胸水等细胞血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液。悬液。 方法：方法：一般用一般用5005001000r/min1000r/min的低速离心，的低速离心，如果离心速度过大和时间太长，则易挤压细如果离心速度过大和时间

6、太长，则易挤压细胞使之受损或死亡。胞使之受损或死亡。 分层液：分层液：分层液根据细胞比重不同，使各分层液根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的，红细胞比重为类细胞相互分开的，红细胞比重为1.0921.092，淋巴和大单核等白细胞比重为淋巴和大单核等白细胞比重为1.0701.070，分层，分层液适用于分离血中淋巴细胞。液适用于分离血中淋巴细胞。3 3、消化分离法、消化分离法 组织消化法是在把组织经过切割处理后，组织消化法是在把组织经过切割处理后，再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细胞然后加入培养液。胞然后加入培养液。制成细胞悬液制成细胞悬液，接种入，接种入

7、培养容器中后，细胞容易生长增殖，如：培养容器中后，细胞容易生长增殖，如： （1 1）胰蛋白酶消化法）胰蛋白酶消化法 适用范围：适用范围：适合于消化细胞间质较少的组织，适合于消化细胞间质较少的组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、心、肾等组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、心、肾等组织，对传代细胞效果也非常好。对传代细胞效果也非常好。配制溶液时要注意配制溶液时要注意CaCa2 2、MgMg2 2 （为什么？）（为什么？）血清有抑制胰蛋白酶活性的作用（为什么？）。血清有抑制胰蛋白酶活性的作用（为什么？）。 （2 2）胶原酶消化法）胶原酶消化法 适用范围：适用范围：消化纤维组织、上皮组织以及消化纤维组织、上皮组织

8、以及癌组织等。上皮细胞本身对胶原酶有一定癌组织等。上皮细胞本身对胶原酶有一定的耐性，但胶原酶对细胞间质有很好的消的耐性，但胶原酶对细胞间质有很好的消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果很好。不受伤害，效果很好。 此酶在此酶在CaCa2 2、MgMg2 2存在下仍有活性。存在下仍有活性。 （3 3）EDTAEDTA消化法（非酶消化法）消化法（非酶消化法） EDTAEDTA是一种是一种非酶性消化物非酶性消化物。常用不含常用不含CaCa2 2和和MgMg2 2的的PBSPBS配成配成0.02%0.02%的工作液。的工作液。三、细胞原代培养方法三、细胞

9、原代培养方法 优点：优点：组织和细胞刚刚离体，生组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有物性状尚未发生很大变化，具有二倍体遗传性状，供体来源充分、二倍体遗传性状，供体来源充分、生物条件稳定的情况下，在一定生物条件稳定的情况下，在一定程度上能反映在体状态。程度上能反映在体状态。 组织块培养法示意图组织块培养法示意图2 2、消化细胞培养法、消化细胞培养法 单层细胞培养示意图单层细胞培养示意图胰蛋白酶冷消化法胰蛋白酶冷消化法胰蛋白酶热消化法胰蛋白酶热消化法单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右）单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右） 3 3悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞

10、，如白对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞均无需消化，可采用低速离心胞均无需消化，可采用低速离心分离，使细胞呈悬浮状态下在培分离，使细胞呈悬浮状态下在培养液中连续生长。养液中连续生长。特点：特点：（1 1）细胞本身不粘附；）细胞本身不粘附；（2 2）通过机械搅动使细胞保持悬浮）通过机械搅动使细胞保持悬浮状态；状态；（3 3）通过选择（不贴壁）培养得到）通过选择（不贴壁）培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。 其其优点优点是：悬浮培养可是：悬浮培养可以在不增加底

11、物表面面积情以在不增加底物表面面积情况下，成功地得到大量细胞。况下，成功地得到大量细胞。 原代培养过程中要不断更换新原代培养过程中要不断更换新鲜培养液以维持细胞的生长。待细鲜培养液以维持细胞的生长。待细胞生长到一定的限度时会胞生长到一定的限度时会产生接触产生接触抑制，抑制，需要对细胞进行再培养。需要对细胞进行再培养。二、传代培养的确定二、传代培养的确定 2 2、悬浮细胞的传代培养、悬浮细胞的传代培养 四、细胞系的建立四、细胞系的建立 原代培养所含的细胞类型多而杂，培养原代培养所含的细胞类型多而杂，培养初期细胞类型多种多样。随着培养时间的延初期细胞类型多种多样。随着培养时间的延长，有的细胞类型经

12、过适应生长阶段而加速长，有的细胞类型经过适应生长阶段而加速繁殖生长；而另一些细胞，或者死亡，或者繁殖生长；而另一些细胞，或者死亡，或者经过逐步退化而至死亡。培养物的细胞类型经过逐步退化而至死亡。培养物的细胞类型由复杂逐步变为单一的或均匀的。由复杂逐步变为单一的或均匀的。 “有限有限”细胞系：细胞系：寿命有限的细寿命有限的细胞系。这类细胞系大多经过有限的细胞系。这类细胞系大多经过有限的细胞代数后，一般经胞代数后，一般经20208080群体倍增后，群体倍增后，细胞退化或死亡，其寿命长短与细胞细胞退化或死亡，其寿命长短与细胞类型和培养条件有关。类型和培养条件有关。 “无限无限”细胞系：细胞系：经过再

13、培养传经过再培养传代后，细胞发生转化，可连续培养和代后，细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为生长，寿命变为“无限无限”的，称谓连的，称谓连续培养细胞系，或续培养细胞系，或“无限无限”细胞系。细胞系。 一个克隆的细胞群体是从一个一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来。分离单一细单一母细胞繁殖而来。分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法胞并使其繁殖为一细胞群体的方法为为克隆化克隆化。 克隆的细胞群体，经生物学鉴定克隆的细胞群体，经生物学鉴定后，称为后，称为细胞株细胞株。克隆细胞的主要。克隆细胞的主要优点是使培养物由不均一性趋向均优点是使培养物由不均一性趋向均一，使培养物的遗传可变性减低

14、到一，使培养物的遗传可变性减低到最低限度。最低限度。 2 2、饲养层克隆法、饲养层克隆法 饲养层的制备饲养层的制备: : 取细胞系细胞或胚胎组织和肿瘤组取细胞系细胞或胚胎组织和肿瘤组织，用胰蛋白酶消化后接种入培养瓶内。织，用胰蛋白酶消化后接种入培养瓶内。待细胞生长到中等对数生长相时，加入待细胞生长到中等对数生长相时，加入丝裂霉素丝裂霉素C C，过夜或者用射线照射，处理，过夜或者用射线照射，处理培养物。培养物。影响群落形成效率的因素影响群落形成效率的因素 （1 1）接种的细胞密度与群落）接种的细胞密度与群落的形成率的相关性的形成率的相关性接种的细胞密度与群落的形成的关系接种的细胞密度与群落的形成

15、的关系接种细胞密度与群落形成的关系接种细胞密度与群落形成的关系期待的群落形成率期待的群落形成率接种细胞的最适数目接种细胞的最适数目1ml1ml中中1cm1cm3 3上上0.10%0.10%10104 42 210103 31.00%1.00%10103 320020010%10%100100202050%50%20204 4 100%100%10102 2（2 2）培养液）培养液 最适的克隆化培养液需通过选最适的克隆化培养液需通过选择性培养来选定，选群落形成效率择性培养来选定，选群落形成效率比较高的培养液，比较高的培养液，HamHam氏的氏的F12F12培养培养液被证明是最好的克隆化培养液，液

16、被证明是最好的克隆化培养液，可适用于许多细胞类型。可适用于许多细胞类型。（3 3）血）血 清清 培养液中的血清成分以胎牛血清培养液中的血清成分以胎牛血清最合适，比一般用的小牛或马血清优最合适，比一般用的小牛或马血清优越。可先挑选一批血清供克隆化用。越。可先挑选一批血清供克隆化用。（4 4）适应性条件培养液）适应性条件培养液 组织培养研究过程中发现，培养物组织培养研究过程中发现，培养物在培养过程会释放出某些营养物质，并在培养过程会释放出某些营养物质，并分泌某些化学信息。这引起物质释放到分泌某些化学信息。这引起物质释放到培养液中反过来又作用于培养物。因此培养液中反过来又作用于培养物。因此在更换培养

17、液时，常以新的培养液更换在更换培养液时，常以新的培养液更换出一部分旧培养液，这样有利于细胞的出一部分旧培养液，这样有利于细胞的生存和生长。生存和生长。（5 5）化学信息）化学信息 化学信息对群落的形成起促进作化学信息对群落的形成起促进作用，一些化学信息是高密度细胞培养用，一些化学信息是高密度细胞培养过程中分泌到培养液中，能调节细胞过程中分泌到培养液中，能调节细胞的生存和生长。群落刺激活性因子可的生存和生长。群落刺激活性因子可通过饲养层提供克隆细胞所需。通过饲养层提供克隆细胞所需。（6 6）饲养层细胞可用同源细胞）饲养层细胞可用同源细胞 用同源细胞作为饲养层细胞有利用同源细胞作为饲养层细胞有利于

18、群落形成，但是用不均一的细胞作于群落形成，但是用不均一的细胞作饲养层有其优点，即当分离克隆时，饲养层有其优点，即当分离克隆时，可通过染色体分析检测克隆是否遭受可通过染色体分析检测克隆是否遭受饲养层细胞的污染。饲养层细胞活性饲养层细胞的污染。饲养层细胞活性可维持达三周之久。可维持达三周之久。（7 7）中间代谢物）中间代谢物 中间代谢物，如丙酮酸或中间代谢物，如丙酮酸或-酮戊二酸和核苷类等曾被用来补充酮戊二酸和核苷类等曾被用来补充培养液，以改进细胞克隆化。培养液，以改进细胞克隆化。 （8 8）COCO2 2 的存在的存在 COCO2 2的存在对大多数细胞来说都是的存在对大多数细胞来说都是必要的必要

19、的 ，能得到最大的克隆化形成，能得到最大的克隆化形成率。通常用率。通常用5%CO5%CO2 2，采用，采用2%CO2%CO2 2对许多对许多细胞也已足够了，对人类神经胶质和细胞也已足够了，对人类神经胶质和成纤维细胞的效果更好一些。成纤维细胞的效果更好一些。 2 2、射线照射分离克隆法、射线照射分离克隆法 显微镜下检查克隆，将选中的显微镜下检查克隆，将选中的克隆用笔做好标志。用一片克隆用笔做好标志。用一片2mm2mm厚度厚度的铅片盖住选中的克隆，将培养瓶的铅片盖住选中的克隆，将培养瓶倒置，其余细胞用倒置，其余细胞用X X射线或射线或6060CoCo源照源照射处理。射处理。3 3、悬浮细胞克隆的分

20、离、悬浮细胞克隆的分离 （1 1）借助解剖显微镜挑选群落。）借助解剖显微镜挑选群落。（2 2）用毛细滴管的尖端插入半固体）用毛细滴管的尖端插入半固体培液并靠近选中的克隆，轻轻吸取培液并靠近选中的克隆，轻轻吸取群落。群落。第四节第四节各种细胞培养方法的选择各种细胞培养方法的选择 一、悬滴培养法一、悬滴培养法 悬滴培养法的基本要点：悬滴培养法的基本要点： 将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组织块放于铺展开的培养液中央待培养的组织块放于铺展开的培养液中央部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。密封后进行培养。悬

21、滴培养用的凹载玻片（mm）图中凹载玻片（1）用于双盖玻片悬滴法；图中凹载玻片（2）用于单盖片悬滴法；图中凹载玻片（3）用于悬滴培养后，可直接用相差显微镜观察。 二、培养瓶培养方法二、培养瓶培养方法三、旋转管培养法三、旋转管培养法 用此法培养细胞的基本原理与悬滴用此法培养细胞的基本原理与悬滴法和培养瓶法是相一致的。不同的是，法和培养瓶法是相一致的。不同的是，在培养过程中，组织块或细胞是交替地在培养过程中，组织块或细胞是交替地与培养液和空气直接接触，有利于细胞与培养液和空气直接接触，有利于细胞生长。生长。 四、灌注小室培养法四、灌注小室培养法 灌注小室培养法是在盖玻片悬滴灌注小室培养法是在盖玻片悬滴培养方法的基础上发展起来的。用来培养方法的基础上发展起来的。用来连续观察活细胞的动态变化，研究