PCR实验室分区设置及要求PPT课件

1、 在由中华人民共和国卫生部办公厅于2002年1月14日下发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法卫医发200210号文)附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。设计根据第1页/共28页临床PCR诊断实验室设计方案工作流向专用走廊产物分析区扩增区标本制备区试剂准备区缓冲区缓冲区缓冲区空气流向空气流向空气流向空气流向第2页/共28页错误的设计第3页/共28页 临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。 进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试

2、剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。第4页/共28页 在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。 清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。第5页/共28页试剂准备区设置要求 超净工作台或试剂配置箱 试剂冰箱 可调移液器一套（四支）， 配有带滤芯（防止气溶胶）及无 RNaseRNase酶的吸嘴 无粉的乳胶手套 涡旋器 专用工作服 无菌离心管

3、第6页/共28页 下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。第7页/共28页 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应

4、数来决定。 主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于热启动技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。 在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。第8页/共28页 严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作

5、完成后调至实验台上6090cm内照射。由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。第9页/共28页标本制备区设置要求 生物安全柜 样本冰箱 可调移液器一套（四支）， 带滤芯（防止气溶胶）及无RNaseRNase酶的吸嘴 台式微型离心机（最大RCF 16000RCF 16000 g g， 最小RCF12500RCF12500 g g）； 试管架（SarstedtSarstedt 93.1428 93.1428） 无粉的乳胶手套 涡旋器 专用工作服 无菌离心管 加热块第10页/共28页 下述操作在该区进行：临

6、床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。第11页/共28页 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。 cDNA合成的理想温度依所使用的

7、酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。 待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。第12页/共28页扩增区设置要求 CobasCobas AmplicorAmplicorNucliSensNucliSens EasyQEasyQ LightCyclerLightCycler 荧光定量PCRPCR仪 LightCyclerLightCycler Capillary Releaser Capillary Releaser 专

8、用工作服 PCRPCR扩增仪第13页/共28页 下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。 不能从本区再进入任何上游区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。第14页/共28页 为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是

9、在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。用过的加样器必须注意清洁消毒。 完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。第15页/共28页产物分析区设置要求 孵箱 洗板机 酶标仪 数据处理系统 专用工作服第16页/共28页 下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。 核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖

10、凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。 目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探针杂交方法。第17页/共28页 本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1mol/L HC1中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。 由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。 本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)