全血DNA的提取及电泳ppt课件

1、DNA的提取及电泳2013.03.301;.21.实 验 原 理DNA一、全血DNA的提取34由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。在管底，从而与白细胞相分离。通过通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。最后用乙醇沉淀洗出最后用乙醇沉淀洗出DNA。52.材料与方法. .材料材料用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有用含抗

2、凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTAEDTA和肝素，和肝素，EDTAEDTA更好一些，不更好一些，不会影响下游的反应。会影响下游的反应。每每5ml5ml的血液中加入的血液中加入0.4ml 0.04M EDTA0.4ml 0.04M EDTA配好的配好的EDTAEDTA溶液，颠倒混匀即可。溶液，颠倒混匀即可。保存于保存于-20-20至至-80-80，最好在，最好在2 2个月内提取。个月内提取。 63%明胶，明胶，TES， Tris饱和酚（饱和酚（pH7.8），氯仿：异戊醇（），氯仿：异戊醇（24:1），无水乙），无水乙醇，醇，TE离心机，离心机，7ml离心管，离心管，1.5mlEP管，中试

3、管，移液器管，中试管，移液器7方法： 提取WBC取1ml 全血等体积3%明胶37静置，510min取上清3000r/min 离心 ，5min弃上清颠倒混匀溶液颜色均一溶液颜色上下分层沉淀颜色为红色8 破碎WBC加入2ml TES加10滴10%SDS轻轻敲击管底震荡混匀颠倒混匀溶液全部变为粉红色溶液颜色变暗9 抽提DNA加等体加等体积积Tris饱饱和酚和酚颠倒混匀，50次， 3000rpm，离心5min取下层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色取上清取上清加等体加等体积积氯仿：异戊氯仿：异戊醇（醇（24:1）将上清移入试管将上清移入试管颠倒混匀，50次3000rpm，离心5min混匀后溶液变为均一的

4、乳白色上清夜（DNA）蛋白质层 酚溶液上清夜（DNA）蛋白质层 氯仿溶液10 沉淀DNA加2.5倍无水乙醇吸出絮状沉淀到1.5mlEP管挥干至无色液体通风橱内放置5min加入100 ddH2O溶解缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。无水乙醇与水溶液交界面特点： 1.气泡 2.白色絮状沉淀11二、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯化DNA或者RNA分子的方法。这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。1.原理12电泳介质 琼琼脂糖是一种天然聚合脂糖是一种天

5、然聚合长链长链状分子，是由状分子，是由D型和型和L型半乳糖以型半乳糖以-1， ，3和和-1， ，4糖苷糖苷键键相相连连形成的形成的线线状高聚物。沸水中溶解，状高聚物。沸水中溶解，45 开始形成多孔性开始形成多孔性刚刚性性滤滤孔，凝胶孔径的大小（孔径范孔，凝胶孔径的大小（孔径范围围从从50nm到大于到大于200nm）决定于）决定于琼琼脂糖的脂糖的浓浓度。度。13.DNA分子的电荷效应： DNA在高于其等在高于其等电电点的溶液中点的溶液中带负电带负电，在，在电场电场中向阳极移中向阳极移动动。 。DNA带净电带净电荷量的多少与荷量的多少与电电流流强强度，度，电电泳泳缓缓冲液的冲液的pH值值和离子和离

6、子强强度有关度有关。14. DNA琼脂糖电泳的分子筛效应： 在一定的在一定的电场强电场强度下，度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分子分子的迁移速度取决于分子筛筛效效应应，即分子本身的大小、构型和，即分子本身的大小、构型和琼琼脂糖的脂糖的浓浓度是主要的影响因素。度是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。分子的迁移速度与其相对分子量成反比。M 1 2 3 4 51516琼琼脂糖脂糖的的浓浓度度17示踪染料：示踪染料： 有致癌性有致癌性: EB， ，吖啶吖啶橙等橙等; 无毒的染料：无毒的染料：goldview I核酸染料等核酸染料等.示踪染料和分子量示踪染料和分子量标标准参照

7、物准参照物EBgoldview18 分子量分子量标标准参照物（准参照物（Marker） ）19实验实验材料：材料： 全血基因全血基因组总组总DNA. .实验试剂实验试剂： ：琼琼脂糖脂糖5TAE电电泳泳缓缓冲液冲液6电电泳泳载样缓载样缓冲液（冲液（ 6 loading dye）：）： 0.25 溴酚溴酚蓝蓝， ，0.25% 二甲苯青，二甲苯青，40(w/v) 蔗糖水溶液，蔗糖水溶液，贮贮存于存于 4。 。goldview I型核酸染料：型核酸染料： 每每10 l DNA加入加入2 l染料。染料。3. 3. 实验材料和试剂实验材料和试剂20.实验仪实验仪器器21凝胶成像系统凝胶成像系统224.

8、操作步骤. .制胶制胶 1.0% 1.0% 琼琼脂糖凝胶，脂糖凝胶，0.50.5TBETBE. .上上样样 上上样缓样缓冲液冲液. .电电泳泳 100V100V， ，20min20min. .观观察察 紫外灯下紫外灯下观观察察溶溶 胶胶23;.上样准备DNA: 8l6loading dye: 2lTotal : 10l 分别吸取上述体积的DNA和6loading dye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。24;.凝胶冷却至凝胶冷却至50，加，加goldview I 2 l摇摇匀匀25;.凝胶凝固后取出梳子凝胶凝固后取出梳子26;.加加缓缓冲液冲液27;.准准备样备样品品28;.点点 样样29;.电电 泳泳30;.注意注意观观察溴酚察溴酚蓝蓝染液的迁移染液的迁移31;.紫外灯下紫外灯下观观察察电电泳泳结结果果32;.照照 相相33;.34制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易