第3讲DNA的复制和修复

1、第三讲第三讲 dna的复制与修复的复制与修复第一节 dna的复制一、dna的半保留复制1、dna复制的3种可能类型全保留复制、半保留复制、分散复制2、dna半保留复制的证明半保留复制的证明 1958年，年，meselson和和stahl的著名实验：同位素标记，密度的著名实验：同位素标记，密度梯度离心。梯度离心。 e.coli 培养培养15代代 0代代 分别取分别取1代，代，2代，代，3代代 提取提取dna 密度梯度离心密度梯度离心15nnh4cl14nnh4clcscl6mol/l 图3-1 三种不同的复制模型 半保留复 全保留复 分散模型 制模型 制模型 15n 15n 15n 15n 15

2、n 15n 第一次复制 14n 15n 15n14n 15n 15n 14n14n 14n 14n 15n 15n 15n 15n 14n 14n 第二次复制 证实半保留复制的实验细菌培养在含14n 的培养基中一代两代14n15n14n/ 15n二、二、 边解链边复制边解链边复制 1. dna的复制是边解链边合成的复制是边解链边合成 实验证据：实验证据：sv40复制的早期复制的早期电镜照片电镜照片，复制部分和未，复制部分和未复制部分。复制部分。 复制从原点（复制从原点（origin)的特定位点开始，形成的特定位点开始，形成复制眼复制眼（replication eye),逐步向未复制部分扩大。逐

3、步向未复制部分扩大。 复制叉复制叉（reolixation fork) 单向或双向单向或双向复制复制 2. 复制子：由一个原点（复制子：由一个原点（origin)引发的复制，称为一个引发的复制，称为一个复制子，即一个复制单位。包含一个复制子，即一个复制单位。包含一个origin和一个和一个terminus。 原核原核，只有一个复制原点，因此只有一个复制子。，只有一个复制原点，因此只有一个复制子。 真核真核，具有多个复制原点，因此有多个复制子。，具有多个复制原点，因此有多个复制子。图图 3 3 在复制不同阶段的在复制不同阶段的dna分子分子图图 3 4 在非在非复制复制dna的旁的旁边复制的边复

4、制的dna被看成是复制被看成是复制眼眼图图3 5 放放射活性标射活性标记的不同记的不同密度可被密度可被用于区别用于区别不定向和不定向和双向复制双向复制图图3-6 复制可能是不定向或复制可能是不定向或双向的，这决定于在起始点双向的，这决定于在起始点形成形成1或或2个复制叉。个复制叉。表表 2-9 部分生物复制子的比较部分生物复制子的比较物种物种 细胞内复制子数目细胞内复制子数目/个个 平均长度平均长度/kb 复制子移动速度复制子移动速度/（bp/min）大肠杆菌大肠杆菌 1 4 200 50 000 酵母酵母 500 40 ？ 果蝇果蝇 3 500 40 2 600 蟾蜍蟾蜍 15 000 20

5、0 500 蚕豆蚕豆 35 000 300 ？ 1. 线性双链线性双链 2. 环状环状dna复制复制 型型，双向，双向 滚筒式滚筒式，单向，单向 d型型，单向，在动物线粒体中有。，单向，在动物线粒体中有。 双链环在固定点解开，进行复制，但两条双链环在固定点解开，进行复制，但两条链合成速度不对称，一条链复制链合成速度不对称，一条链复制60%后，第二后，第二条链才开始复制。条链才开始复制。三、三、dna半保留复制的不同类型半保留复制的不同类型图图3-7 真核生物真核生物dna的双向复制的双向复制 滚环复制的电镜照片图图3 7 滚动循环产生一个滚动循环产生一个多聚单链尾巴。多聚单链尾巴。图图3 8

6、滚动循环可用于不滚动循环可用于不同的目的，这依赖于移出同的目的，这依赖于移出尾巴的命运尾巴的命运图图3 9 x174rf是一个合成单是一个合成单链病毒圆环的模板链病毒圆环的模板图图3 10 d环复制环复制四、半不连续复制 okazaki（冈崎）于（冈崎）于1968年通过年通过h3 脱氧胸苷（脱氧胸苷（ h3 dt）标记实验证实了半不连续复制。标记实验证实了半不连续复制。 1. 实验材料：实验材料：t4感染的感染的e.coli 野生型野生型phage t4 mutant t4 （连接酶突变）（连接酶突变） 2. 实验系统：实验系统：h3 dt标记标记e.coli ；phage t4 感染；密感染

7、；密度梯度离心。度梯度离心。 检测标记检测标记dna在不同时间合成的情况。在不同时间合成的情况。 3. 实验结果实验结果： 短时间内，首先合成较短的短时间内，首先合成较短的dna（冈崎片段），接（冈崎片段），接着出现较大分子着出现较大分子dna。 突变型连接酶突变型连接酶t4中，大片段中，大片段dna很少或无。很少或无。 半不连续合成，放射性标记一半出现于短片段（冈崎半不连续合成，放射性标记一半出现于短片段（冈崎片段），另一半出现在长片段片段），另一半出现在长片段dna中。中。 4. 结论：结论：dna复制是半保留复制是半保留半不连续复制半不连续复制。图图3-11 半不连续半不连续dna复制的

8、实验证明复制的实验证明半不连续复制五、五、dna复制过程复制过程 根据反应阶段和所需的不同酶类，根据反应阶段和所需的不同酶类，dna的复制可的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个dna复制的独立单元被称为复制子（复制的独立单元被称为复制子（replicon），），主要包括复制起始位点（主要包括复制起始位点（origine of replication）和终止位点（和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。上一般只有一个复制起始位点。 大肠杆菌大肠杆菌dna的复制需要有的复制需

9、要有20种左右的酶和蛋白种左右的酶和蛋白质因子参与，整个质因子参与，整个dna复制机器被称之为复制机器被称之为dna replicase system或或replisome。 helicase，任何，任何dna在被复制前都必须解开双链，这个过在被复制前都必须解开双链，这个过程是由程是由helicase来完成的，它可在来完成的，它可在atp的作用下将的作用下将dna母链母链不断解开形成单链。不断解开形成单链。topoisomerase，主要功能是消除，主要功能是消除dna解链过程中所产生解链过程中所产生的扭曲力。的扭曲力。dna结合蛋白，使新解链的结合蛋白，使新解链的dna保持稳定结构。保持稳定

10、结构。primases，为，为dna复制提供复制提供rna引物。引物。dna polymerases，合成新生，合成新生dna链，切除链，切除rna引物。引物。dna ligases，使新生，使新生dna链上的缺口（链上的缺口（3-oh, 5-p）生成）生成磷酸二酯键。磷酸二酯键。1、dna replicase system（1）dna聚合酶聚合酶原核原核dna聚合酶有三种：聚合酶有三种： dna聚合酶聚合酶、ii、iii。dna聚合酶聚合酶： 不是不是dna复制的主酶。复制的主酶。（a） 53 聚合酶活性聚合酶活性（b）35外切酶活性外切酶活性（c）53外切酶活性外切酶活性生理功能生理功能：

11、（：（a）切除嘧啶二聚体（）切除嘧啶二聚体（b）去除冈崎片段）去除冈崎片段rna引引物，使冈崎片段物，使冈崎片段 间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。dna聚合酶聚合酶ii：不是不是dna复制的主酶。复制的主酶。（a） 53 聚合酶活性聚合酶活性 活性很低活性很低（b）35外切酶活性外切酶活性 校对功能校对功能生理功能：主要是起修复生理功能：主要是起修复dna的作用。的作用。dna聚合酶聚合酶iii： 是是dna复制的主酶。复制的主酶。（a） 53 聚合酶活性：是聚合酶活性：是dna聚合酶聚合酶i的的15倍，倍， dna聚合酶聚合酶ii的的30倍。倍。（

12、b）35外切酶活性外切酶活性它能在引物羟基上以每分钟约它能在引物羟基上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长万个核苷酸的速率延长新生的新生的dna链，是大肠杆菌链，是大肠杆菌dna复制中链延长反应的复制中链延长反应的主导聚合酶。主导聚合酶。 dnapolymerase 全酶组成：全酶组成： 在复制叉处为一个在复制叉处为一个 二聚体二聚体图图3 12 在若干阶段，在若干阶段，dnapol 全酶被装配，产生一个酶复合体，全酶被装配，产生一个酶复合体，它合成两个新链的它合成两个新链的dna。（2）引物酶及引发体）引物酶及引发体 （a）dna合成以合成以rna为引物为引物实验：实验：reiji 以以 32p

13、 ntp 标记未标记标记未标记dntp为底物。为底物。 引发合成后，用稀碱处理，引发合成后，用稀碱处理，32p在在dna中出现，证明中出现，证明rna为引物。为引物。 p p p p p p p p p p p p p稀碱水解稀碱水解p p pp p p p p p pdna 32p ntp dntp （b）引发酶（引发酶（primerase)dnag rna 引物由引发酶合成。引物由引发酶合成。 意义：意义：减少致死突变。减少致死突变。dna合成中最初几个核苷酸正确性合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物远比其后的低。引物rna 随后被降解，从而减少了复制错误。随后被降解，从而减少了复

14、制错误。 （c） 引发体（引发体（primosome) 后随链的引发过程往往由引发体来完成。后随链的引发过程往往由引发体来完成。 引发体组成：引发体组成： dnag：引发酶，引发酶，60kd单肽，合成引物。单肽，合成引物。 n n： n?： dnai： dnab：解螺旋酶。解螺旋酶。 dnac：最先进入最先进入ori的引发体成员，与的引发体成员，与dnab协同，协同，ori识识别蛋白？别蛋白？（3） dna链解旋，解链的酶和蛋白链解旋，解链的酶和蛋白 （a） dnab：解旋酶，引发体成员，使复制叉形成，并在以：解旋酶，引发体成员，使复制叉形成，并在以后结合于一个复制叉，推动复制叉向前延伸（后结

15、合于一个复制叉，推动复制叉向前延伸（helicase)。 需需atp。 生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与dna修修复，重组等非复制过程。复，重组等非复制过程。（b）ssb：单链结合蛋白（：单链结合蛋白（single strand binding protein) ssb结合于解旋的结合于解旋的dna双链的单股链上。双链的单股链上。 ssb的作用：的作用：v 使使dna单链保持一种伸展构象，能作为模板；单链保持一种伸展构象，能作为模板；v 使解开的单链不形成发卡结构；使解开的单链不形成发卡结构；v 保护保护dna单链不受单链不受dnase水解。水解

16、。 ssb特性：特性：v 原核生物原核生物ssb蛋白与蛋白与dna结合表现出协同性结合表现出协同性（coperativity)；v ssb可重复使用。可重复使用。（4） 拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerase) 拓扑异构体：拓扑异构体：具有不同螺旋数的同一具有不同螺旋数的同一dna分子两种异构体。分子两种异构体。 拓扑异构酶：拓扑异构酶：可使可使dna的两种拓扑异构体互变的酶。的两种拓扑异构体互变的酶。v 与与dna形成共价结合中间体，使形成共价结合中间体，使dna磷酸二酯键断裂，磷酸二酯键断裂，形成形成dnanick，dna的一条链进行解旋旋转而改变的一条链进行解旋旋转而改变dn

17、a分子的拓扑状态。分子的拓扑状态。功能：功能：v 参与复制、转录、重组。参与复制、转录、重组。 效应效应：拓扑异构酶可使拓扑异构酶可使dna发生：发生： 连环化（连环化（catenate) 脱连环化脱连环化(decatenate) 打结（打结（knot) 解结（解结（unknot)图图3 13 i型拓扑异构酶作用机理示意图型拓扑异构酶作用机理示意图（5） 连接酶（连接酶（ligase) dna 随后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连随后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件：接酶连接，连接酶的反应条件：v 被连接的两链必须与另一链（模板链）互补；被连接的两链必

18、须与另一链（模板链）互补；v 两链相邻；两链相邻；v 每次只能连接一个切口；每次只能连接一个切口；v 使一条链的使一条链的5- p 与另一链的与另一链的3- oh形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。a t a g t c g at a t c a g c t p hoa t a g t c g at a t c a g c t v 连接能量来自连接能量来自nad（如（如e.coli 或或t4诱导的连接酶，动、诱导的连接酶，动、植物中的酶）。植物中的酶）。v 缺口缺失核苷酸不连接。缺口缺失核苷酸不连接。2、大肠杆菌dna复制（1） dna复制的起始复制的起始 大肠杆菌中的复制起始位点是大肠杆菌中的复

19、制起始位点是ori c，全长，全长245bp，该，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。含有含有2个系列个系列的重复单位，的重复单位，313bp 49bp 均富含均富含a/t 。9bp（a位点）位点）为为dnaa蛋白识别位点。蛋白识别位点。极小的原点在由极小的原点在由13mer和和9mer重复区之间的距离确定重复区之间的距离确定(续表）复制起始的主要步骤 a. 大约大约20个左右的个左右的dnaa蛋白首先与蛋白首先与oric中的中的4个个9碱基重碱基重复区相结合；复区相结合； b. 识别并使识别并使3个个13碱基串联重复区碱基串联重复区dna形成开环

20、结构；形成开环结构； c. dnab蛋白在蛋白在dnac的帮助下与未解链序列结合。每六个的帮助下与未解链序列结合。每六个dnab蛋白形成一组并与一条蛋白形成一组并与一条dna母链结合，可在不同方向母链结合，可在不同方向同时起始同时起始dna的复制。当细胞中存在足够的的复制。当细胞中存在足够的ssb和和dna gyrase时，时，dnab的解链效率非常高。的解链效率非常高。（2）dna子链的延伸子链的延伸 主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后链的后链的合成合成。由。由dna helicase解开双螺旋，由拓朴异构酶解开双螺旋，由拓朴异

21、构酶消除消除dna链上的扭曲力，链上的扭曲力，ssb结合使结合使dna单链稳定。单链稳定。 前导链的合成：由前导链的合成：由dnag（primase）在复制起始位点附）在复制起始位点附近合成一个近合成一个10-60 nt的的rna引物，然后由引物，然后由polii把把dntp加到加到该引物上。该引物上。 滞后链的合成：产生滞后链的合成：产生okazaki fragments，消除，消除rna引物引物并由并由dna pol i补上这一小段补上这一小段dna序列，由序列，由dna ligase把两把两个片段相连。个片段相连。3. dna链的终止链的终止 当子链延伸达到当子链延伸达到terminus

22、 region（ter，带有多个带有多个20bp序列）时，序列）时，dna复制就终止了。复制就终止了。ter有点像一个陷井有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。），使复制叉只能进入，不能出来。ter的功能主要的功能主要是由是由ter-tus复合物（复合物（ter utilization substance）来完成的。）来完成的。4. 真核细胞dna复制的特点 真核生物的真核生物的origin of replication被称为被称为ars（autonomously replicating sequences）或者被称为）或者被称为replicators。yeast repli

23、cators长约长约150bp，有多个保，有多个保守重复区，共有约守重复区，共有约500个个replicators分布于酵母的分布于酵母的17条条染色体中。染色体中。真核生物与原核生物真核生物与原核生物dna复制的区别：复制的区别：（1）真核生物每条染色体上可以有多个复制起始点，而）真核生物每条染色体上可以有多个复制起始点，而原核生物只有一个起始点。原核生物只有一个起始点。（2）真核生物的染色体在完成全部复制之前，各个起始）真核生物的染色体在完成全部复制之前，各个起始点上的点上的dna的复制不能再开始；而在快速生长的原核生的复制不能再开始；而在快速生长的原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的

24、物中，复制起始点上可以连续开始新的dna复制，表现复制，表现为虽只有一个复制单元，却可有多个复制叉。为虽只有一个复制单元，却可有多个复制叉。表表2-11 真核生物真核生物dna聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较性质性质dna聚聚合酶合酶dna聚聚合酶合酶dna聚聚合酶合酶dna聚聚合酶合酶dna聚聚合酶合酶亚基数亚基数 4 1 2 2 3 1在细胞内分布在细胞内分布 核内核内 核内核内 线粒体线粒体 核内核内 核内核内功能功能 dna引物合成引物合成线粒体线粒体dna复制复制主要主要dna复制酶复制酶dna复制复制（？）（？）损伤修复损伤修复35外切外切 无无 无无 有有 有有 有有53外切外切

25、 无无 无无 无无 无无 无无七、dna复制的调控1.cole1质粒dna的复制调控二 rnase h rna (rna 引物) ori 600 400 200 0 200 400 600 rna rop 图 11-69 col e1 质粒的复制调控 2.真核细胞dna的复制调控（1）细胞生活水平的调控（2）染色体水平调控（3）复制子水平的调控第二节第二节 dna的损伤修复的损伤修复 1 错配修复（mismatch repair） 错配修复对dna复制忠实性的贡献力达102-103，dna子链中的错配几乎完全都被修正，充分反映了母链的重要性。错错配配修修复复2. 碱基切除修复（base-exc

26、ision repair） dna gylcosylases能特异性识别常见的dna损伤（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为ap位点（apurinic or apyrimidinic）。细胞中最常见的uracil glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。碱基切除修复3. 核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair） 当dna链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，由核苷酸切除修复系统负责进行修复。核苷酸切除修复586224.dna的直接修复（direct repair） dna光解酶：可把在光下

27、或经紫外线照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物还原为单体。o6-甲基鸟嘌呤核苷酸的形成可引起g-t错配。重组修复第三节第三节 dna的转座的转座 dna的转座，或称移位(transposition），是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。已经发现转座这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于dna的复制。 1.转座子的分类和结构特征转座子的分类和结构特征 a. 简单转座子 转座子（transposon，tn）是存在于染色体dna上可自主复制和移位

28、的基本单位。 最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，is）。 is是细菌染色体或质粒dna的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个is序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。is序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。 b.复合式转座子（composite transposon） 是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的is序列，表明is序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。 一旦形成复合转座子，is序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合

29、体移动。没有没有isis序列的、体积庞大的转座子（序列的、体积庞大的转座子（5000bp5000bp以以上）上）tnatna家族家族。 这类转座子带有3个基因，其中1个是内酰胺酶（ampr），另外两个则是转座必需的。mrna靶位点复制靶位点复制左倒转重复序列 （38bp）右倒转重复序列 （38bp）转座子转座子tnatna的结构示意图的结构示意图转座酶 解离酶 -内酰胺酶2.真核生物中的转座子真核生物中的转座子（1）玉米中的控制因子）玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和转座的功能非自主性因子：单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能，成为与自主性因子相同的转座子。a. ac-ds系统系统ac长4563bp，转录生成单一rna，其产物为转座酶。ds属于非自主性因子，又称解离因子，与ac属于同一家族的控制因子。已知所有ds都是ac转座子的缺失突变体，失去转座酶功能。当ac因子存在时，能活化ds，使其在基因组内转座或插入结构基因之内，导致基因失活或改变结构基因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组。orf1orf2cactacaagaaaattttcttgtagtg外显子外显子1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11b. spm-dspm系