第五章人工诱发单倍体及其应用

1、第五章第五章 人工诱发单倍体及其应用人工诱发单倍体及其应用培养对象培养对象 花药培养、花粉培养花药培养、花粉培养 子房培养、胚珠培养、胚培养、胚乳培养子房培养、胚珠培养、胚培养、胚乳培养 离体受精离体受精第一节第一节 花药和花粉培养花药和花粉培养一、一、 概述概述概念概念 花药培养花药培养: :把发育到一定阶段的花药接种在人工培把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上养基上, ,使其发育和分化成为植株的过程使其发育和分化成为植株的过程. . 花粉培养花粉培养( (小孢子培养小孢子培养):):从花药中分离出花粉粒从花药中分离出花粉粒, ,使之成为分散的或游离状态使之成为分散的或游离状态, ,通过

2、培养使通过培养使花粉粒花粉粒脱脱分化分化, ,进而发育成完整植株的过程进而发育成完整植株的过程. .花药培养和花粉培养是获花药培养和花粉培养是获是植物是植物单倍体单倍体的有效方法之一的有效方法之一二倍体(diploid )植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid如，马铃薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普

3、通小麦2n = 6x = 42， n = 3x = 21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28单倍体单倍体(haploid)是不是就是一倍体呢？单倍体单倍体(haploid)指具有配子体（gametophyte）染色体数的孢子体(植物个体)(sporophyte)。 体细胞染色体数体细胞染色体数减半减半；单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点：单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点： 生长发育生长发育弱弱，体形，体形小小、各器官明显、各器官明显减小减小； 雌雄配子严重雌雄配子严重败育败育，有的甚

4、至不能进入有性，有的甚至不能进入有性 世代。世代。 （二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：供体植株小孢子（n）花粉培养花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株（2n）（1 1）缩短育种年限：常规育种需）缩短育种年限：常规育种需4-64-6年获得纯年获得纯系，而小孢子培养仅需系，而小孢子培养仅需1-21-2年。年。一年内获得纯系例：例：二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为aabb，若要从后代中，若要从后代中选择基因为选择基因为aabb的纯合单株的纯合单株常规方法：常规方法： aabb出现的概率为出现的概率为1/16，并且不能，并且不能将将a

5、abb与与aabb、aabb区分开。区分开。（2）提高了目标基因型的选择效率）提高了目标基因型的选择效率abababababaabbaabbaabbaabbabaabbaabbaabbaabbabaabbaabbaabbaabbabaabbaabbaabbaabb例：例：二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为aabbaabb，若要从后代中，若要从后代中选择基因为选择基因为aabbaabb的纯合单株的纯合单株单倍体方法：单倍体方法： aabbaabb出现的概率为出现的概率为1/41/4。 单倍体单倍体 二倍体二倍体ab- - aabbab- aabbab- aabbab- - aabb供体

6、亲本供体亲本aabb花粉花粉培养培养（2）提高了目标基因型的选择效率）提高了目标基因型的选择效率 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。纯系。利于筛选隐性突变体利于筛选隐性突变体 提高诱变效率。提高诱变效率。（3 3）诱变育种中的作用）诱变育种中的作用（4 4） 利于获得优良植株利于获得优良植株 如：芦笋全雄系的培育如：芦笋全雄系的培育（5 5）用作基础研究的各个领域）用作基础研究的各个领域花花药药的的结结构构及及花花粉粉管管的的形形成成花药的结构及花粉粒的发育2nn减数分裂

7、 四分体 4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央） 营养细胞（大） 单核花粉粒（单核靠边期） （两者仅以质膜相隔） 精细胞 生殖细胞（小） 有丝分裂 （2-细胞花粉粒） 精细胞 (3-细胞花粉粒）n双核早期（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径 1、a途径途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞形成营养细胞和生殖细胞 （1）a-v途径途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）a-g途径途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3）a-vg途径（

8、途径（e途径）途径） 由营养细胞和生殖细由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）c途径途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株形成多倍体植株2、b途径途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分小孢子第一次有丝分裂为均等分裂裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。融合形成多倍体植株。（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径（四）花药培养与花粉培养的异同点（四）花药培养

9、与花粉培养的异同点 培养目的相同，均获得小孢子植株。培养目的相同，均获得小孢子植株。 花药培养属于花药培养属于器官培养器官培养；而花粉培养属于；而花粉培养属于细胞细胞培养培养。 花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。（一）研究历史：首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者guha和maheshwari (1964, 1966)。 1996年的统计数据表明,已有至少250多种植物花药培养成功。 花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。二、二、 花药培养技术花药培养技术（二）花药培养的基本程序是（二）花

10、药培养的基本程序是：外植体选择消毒剥取花药接种诱导培养植株再生q外植体的选择：供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花粉的发育时期等。 四分体 4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央） 营养细胞（大） 单核花粉粒（单核靠边期） （两者仅以质膜相隔） 精细胞 生殖细胞（小） 有丝分裂 （2-细胞花粉粒） 精细胞 (3-细胞花粉粒）n双核早期 选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。是否处于适宜的发育期。 最常用的方法有最常用的方法有醋酸洋红法醋酸洋红法。但是，某些植物。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用的花粉细胞

11、核不易着色，需采用焙花青焙花青- -铬矾法铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色蓝黑色。different flower stages as used in anther culture. stage 2 is the optimum stage of developmentfor use in tobacco anther culture（二）花药培养的基本程序是：（二）花药培养的基本程序是：外植体选择消毒外植体选择消毒剥取花药剥取花药接种接种诱导培诱导培养养植株再生植株再生q花药的剥取：花药的剥取：避免花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组避免花药受到损伤，因为

12、损伤常会刺激花药壁组织的发育，形成二倍体的愈伤组织。织的发育，形成二倍体的愈伤组织。p花药预处理花药预处理 大量试验结果表明，花药培养前给予一大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。定的低温处理是十分必要的。q 花药培养常用的基本培养基：花药培养常用的基本培养基： n6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物的花药培养的花药培养 b5、ms、white、nitch 等。等。 c17（王培等，（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高）：适于小麦花药培养，提高 出愈率。出愈率。激素激素：相对较低的激素水平：相对较低的激素水平蔗糖蔗糖：

13、一般：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利，高浓度对禾谷类较有利 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应蔗糖浓度 2 3 4 6 10 13 17诱导频率 5 10 12 18 25 45 8q培养条件培养条件温度和光照：温度和光照：三、花粉培养技术三、花粉培养技术 1、取材时期取材时期：四分体时期到单核早期。：四分体时期到单核早期。 2、花粉的分离花粉的分离： 3、小孢子纯化：、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子 4、花粉的培养花粉的培养1）自然散落法）自然散落法(漂浮培养自然释放法漂浮培养自然释放法) ：

14、将花药接将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。后，收集培养。2）机械游离法）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；花药，使花粉游离出来； b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。出后收集培养。花粉培养方法花粉培养方法 1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养：、液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，

15、以利通气。需震荡，以利通气。 3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。液体培养基培养。 4、看护培养看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。的活性物质促进花粉小孢子发育。 5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。成微室进行花粉培养。看护培养图解1 1、胚状体发育途径：、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各小孢子经历胚发生的各个阶段，最后

16、子叶展开，形成花粉植株。个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。四、花粉植株的形态发生方式烟草花药培养烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株通过胚状体途径再生形成小植株1 1、胚状体发育途径：、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2 2、愈伤组织发育途径：、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。植株会出现变异且倍性复杂。四、花粉植株的形态发生方式愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再

17、生植株部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养的愈伤化发生途径五、花粉植株的倍性及染色体加倍五、花粉植株的倍性及染色体加倍1. 对花粉再生植株群体进行鉴定的必要性：对花粉再生植株群体进行鉴定的必要性：体细胞干扰体细胞干扰生殖细胞的自发加倍生殖细胞的自发加倍2. 花粉植株的倍性：花粉植株的倍性： 单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体3. 影响非整倍体植株出现的频率的因素：影响非整倍体植株出现的频率的因素： 植株的种类植株的种类 接种花粉的发育时期接种花粉的发育时期 培养基中激素的浓度和种类培养基中激素的浓度和种类 花粉植株发生的方式花粉植株发生的方式 愈伤组织继代培养时间长短愈伤组织继代培养时间长短五、花粉植株的倍性及染色体加倍五、花粉植株的倍性及染色体加倍五、花粉植株的倍性及染色体加倍五、花粉植株的倍性及染色体加倍4. 单倍体植株的鉴定单倍体植株的鉴定 1）形态学鉴定）形态学鉴定 2）染色体分析）染色体分析5.