实验四酵母菌形态观察及计数

1、实验中心网站：实验中心网站：http:/ 2010.12氧化还原和电极电势氧化还原和电极电势自定义内容自定义内容酵母菌形态观察及微生物直接计数法细菌形态观察细菌形态观察3一、目的要求一、目的要求: : 1 1、观察酵母菌的形态特征及出芽方式。、观察酵母菌的形态特征及出芽方式。2 2、了解血球计数板计数原理，掌握显微、了解血球计数板计数原理，掌握显微 计数的原理及方法计数的原理及方法 。细菌形态观察细菌形态观察4二、实验原理二、实验原理: : 1. 1.酵母菌酵母菌 酵母菌是单细胞真核生物，菌体比细酵母菌是单细胞真核生物，菌体比细菌大且不运动。繁殖方式以无性为菌大且不运动。繁殖方式以无性为（芽殖

2、或裂殖）有性繁殖产生子囊和（芽殖或裂殖）有性繁殖产生子囊和子囊孢子。子囊孢子。 细菌形态观察细菌形态观察52.2.酵母死活细胞鉴别的理论依据：酵母死活细胞鉴别的理论依据： 本实验通过美蓝染液水浸片观察酵母的形本实验通过美蓝染液水浸片观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变

3、为无色的还原型。因此具有还原能力的酵母无色的还原型。因此具有还原能力的酵母活细胞是无色的活细胞是无色的、而、而死细胞死细胞或代谢作用微或代谢作用微弱的衰老细胞弱的衰老细胞 则则呈蓝色呈蓝色或淡蓝色，借此即或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 细菌形态观察细菌形态观察6 直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。接计数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。养悬浮液，如有

4、杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般数板，一般细菌细菌则采用彼得罗夫则采用彼得罗夫霍泽霍泽（petrof hausserpetrof hausser）细菌计数板。两种计数）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。3.3.直接计数法直接计数法细菌形态观察细菌形态观察74.血球计数板的构造血球计数板的构造细菌形态观察

5、细菌形态观察8 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有玻片上有4 4条槽而构成条槽而构成3 3个平台。中间的平个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个每个半边上面各有一个计数区计数区（图（图21-121-1），），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为计数区的刻度有两种：一种是计数区分为1616个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成个大方格又分成2525个小方格；另一种是一个小方格；另一种是一个计数区分成个计数区分成2525个大方格（大方格

6、之间用个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成双线分开），而每个大方格又分成1616个小个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由们都有一个共同特点，即计数区都由400400个个小方格组成。小方格组成。 细菌形态观察细菌形态观察9计数区边长为计数区边长为1mm1mm，高度为，高度为0.1mm0.1mm，所以每个计，所以每个计数区的体积为数区的体积为0.10.1mmmm3 3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数在计数时，通常数五个中方格的总菌数n n，然后，然后求得每个中方格的平均值，再乘上求得每个中方格的平均值，再乘

7、上1616或或2525，就，就得出一个大方格中的总菌数，然后再得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成换算成1ml1ml菌液中的总菌数菌液中的总菌数, ,最后乘以稀释倍数最后乘以稀释倍数m m。计算公式： 25个中方格个中方格 1ml菌液中的总数=n/52510000m=50000nm（个） 16个中方格个中方格 1ml菌液中的总数=n/51610000m=32000nm（个）细菌形态观察细菌形态观察105.5.计数原则计数原则1.1.在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有释度后再计数。一般样品稀释度要求每

8、小格内约有 510 510 个菌体为宜。个菌体为宜。2.2.每个计数室选每个计数室选 5 5 个中格（可选个中格（可选 4 4 个角和中央的个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。一个中格）中的菌体进行计数。3.3.位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。 4.4.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。即作为两个菌体计数。5.5.计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样来计算样 品的含菌量。品的含菌量。 细菌形态观察细菌形态观察11三

9、、实验操作:1.1.配制培养基、灭菌、接种培养配制培养基、灭菌、接种培养每台配制每台配制100ml100ml马丁氏液体培养基（不加琼脂），分装马丁氏液体培养基（不加琼脂），分装到到8 8支试管中，支试管中，121121，30min30min灭菌，灭菌后每一小组分灭菌，灭菌后每一小组分得得2 2支试管，液体接种酵母菌，支试管，液体接种酵母菌，3030恒温摇床培养恒温摇床培养细菌形态观察细菌形态观察122.2.死活细胞鉴定美蓝浸片观察死活细胞鉴定美蓝浸片观察（1 1）在载玻片中央加一滴）在载玻片中央加一滴0.10.1美蓝染色美蓝染色 液，挑菌混匀；液，挑菌混匀；（2 2）倾斜缓慢放置盖玻片；）倾斜

10、缓慢放置盖玻片；（3 3）放置）放置3min3min后镜检；后镜检；（4 4）染色半小时后再次进行观察，注意死）染色半小时后再次进行观察，注意死 活细胞数量是否增加；活细胞数量是否增加； (5) (5) 用用0.050.05吕氏碱性美蓝染液重复上述吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。操作。 细菌形态观察细菌形态观察133.3.血球计数实验操作血球计数实验操作（1 1）镜检计数室：去污，清洗，吹干；）镜检计数室：去污，清洗，吹干；（2 2）加样品：盖上盖玻片，菌悬液于边缘滴一小滴，）加样品：盖上盖玻片，菌悬液于边缘滴一小滴，渗入，使充满菌液；渗入，使充满菌液；（3 3）显微镜计数：加样后静止）显微镜计数：加样后静止5min5min，每个小格内，每个小格内5 51010个菌体，取个菌体，取5 5个中格（可选个中格（可选4 4个角和中央的个角和中央的一个中格）计数；一个中格）计数；（4 4）清洗）清洗（5 5）计算菌浓度）计算菌浓度细菌形态观察细菌形态观察14思考题思考题:1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不