CRISPRCas概述解读实用PPT学习教案

1、会计学1CRISPRCas概述解读实用概述解读实用背景背景 1、CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大学（年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。段的两端还存在一段不太长的特有的序列。u2013以后，

2、研究者们在包括以后，研究者们在包括science和和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。精确的基因修饰。第1页/共41页CRISPR-Cas主要由两部分组成主要由两部分组成：识别识别切割切割背景背景第2页/共41页 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性特异性的识别，利用的识别，利用Ca

3、s蛋白蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。进行切割，从而达到对自身的免疫。背景背景第3页/共41页背景背景第4页/共41页综述综述第5页/共41页综述综述第6页/共41页综述综述第7页/共41页综述综述第8页/共41页综述图解综述图解第9页/共41页第10页/共41页一个最简化的CRISPRi系统包含一个蛋白和一个RNA，它能有效沉默转录起始和延伸Result 1第11页/共41页第12页/共41页第13页/共41页第14页/共41页第15页/共41页Result 2第16页/共41页Result 3第17页/共41页第18页/共41页第19页/共41页Result 4第20页/共41页Res

4、ult 5第21页/共41页Result 6第22页/共41页第23页/共41页第24页/共41页Result 7第25页/共41页第26页/共41页第27页/共41页将dCas9蛋白密码子最优化，融合到三个拷贝的核定位序列（NLS），并利用小鼠干细胞逆转录载体表达。sgRNA用RNA聚合酶U6启动子表达。通过病毒侵染创建了一个在SV40启动子下表达EGFP的HEK293报告细胞系。Result 8第28页/共41页第29页/共41页CRISPRi不依赖于复杂的宿主因子，只需要dCas9蛋白和引导RNAs，并且灵活性和可塑性高。我们的结果证实在微生物中该系统能有效沉默基因。这种沉默是十分特异性的；我们的观察没有发现脱靶效应。另外，敲除效率能通过改变定位位点和sgRNA与目的基因之间碱基配对程度加以改变。该系统通过直接阻碍转录发挥功能，可以很容易的通过设计sgRNAs来实现。另外，这些dCas9：sgRNA复合物也能在任何启动子中通过定位关键反式激活结构域调节转录，空间上阻碍它们同源的顺式激活因子。第30页/共41页能将多个元件连接到同一个表达载体。讨论第31页/共41页讨论第32页/共41