实验七猪圆环病毒病PCR诊断

1、实验七实验七 猪圆环病毒病猪圆环病毒病pcrpcr诊断诊断实验目的：1、了解pcr反应的原理、方法及操作步骤；2、掌握猪圆环病毒pcr检测的方法；实验内容：1、讲述pcr反应的原理、方法及操作步骤，2、猪细小病毒pcr检测。什么是什么是pcr？ 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称，简称pcr）又称无细胞分子克隆或特异性）又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外序列体外引物定向酶促扩增技术。引物定向酶促扩增技术。一、pcr反应的原理、方法及操作步骤pcr原理原理 pcr pcr是一种选择性扩增是一种选择性扩增dnadna或或rnarna的方法

2、，其基本原理是依的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的据体内细胞分裂中的dnadna半保留复制机理，以及在体外半保留复制机理，以及在体外dnadna分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链地控制体外合成系统的温度，以促使双链dnadna变成单链；变成单链；单链单链dnadna与人工合成的引物退火，以及在与人工合成的引物退火，以及在dntpdntp存在下，耐存在下，耐高温的高温的dnadna聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链dnadna。高。高温变性，低温退火，适温

3、延伸等步反应循环进行，使目温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的的dnadna得以迅速扩增。得以迅速扩增。pcr原理原理 pcrpcr技术在模板技术在模板dnadna、dntpdntp、mg2+mg2+、合适、合适bufferbuffer等条件下，用耐热的等条件下，用耐热的taqtaq聚合酶代替聚合酶代替dnadna聚合酶，用合成的聚合酶，用合成的dnadna引物代替引物代替rnarna引物，经过引物，经过dnadna变性、引物与模板结合（复性）和延伸变性、引物与模板结合（复性）和延伸3 3个个步骤的反复循环步骤的反复循环 （2525 3030次）过程，使目的次）过程，使目的dna

4、dna呈指数呈指数扩增扩增 。反应程序反应程序 变性：变性：93-94 2min93-94 2min 变性：变性：93-94 30s93-94 30s 复性：复性：55-65 30s55-65 30s 延伸：延伸：72 30s72 30s 延伸：延伸：72 2min72 2min3535个循环个循环pcrpcr原理原理sample denaturatationprimer annealingprimer extensionpcr productpcr product标准的标准的pcrpcr反应体系反应体系 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dntp混合物混合物 各各200umol/l

5、引物引物 10100pmol 模板模板dna 0.12ug taq dna聚合酶聚合酶 2.5u mg2+ 1.5mmol/l 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul酶及其浓度酶及其浓度 目前有两种目前有两种 taq dna taq dna 聚合酶供应聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的一个典型的 pcrpcr反应约需酶量反应约需酶量 2.5u2.5u（指总反应（指总反应体积为体积为100 ul100 ul时）时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量

6、减少物量减少引物引物 引物是引物是pcrpcr特异性反应的关键特异性反应的关键 pcr pcr 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板dnadna互补的程度互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板dnadna序列，就能按其设序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用计互补的寡核苷酸链做引物，用 pcrpcr就可将模板就可将模板dnadna在在体外大量扩增体外大量扩增引物在线设计网址：引物在线设计网址： /cgi-bin/primer/primer3_www.cgipcrpcr产物分析产物分析 凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（可用琼脂糖（agroseagrose）或聚丙烯酰胺（）或聚丙烯酰胺（pagepage）凝胶电）凝胶电泳检测泳检测pcrpcr扩增产物的大小。扩增产物的大小。 同时应以标准同时应以标准dnadna分子量作平行对照，凝胶中加入溴化分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。乙锭，电泳后，紫外检测仪下