人类染色体疾病的诊断三

1、第五节第五节 荧光原位杂交（荧光原位杂交（fish）染色体显带技术的优缺点染色体显带技术的优缺点一、一、fish原理原理依据dna双链碱基互补、变性双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同样本中是否存在与其互补的同源核酸序列，这一过程叫做杂源核酸序列，这一过程叫做杂交。交。原位杂交(in situ hybridization)是用已是用已标记的核酸探针与组织切片或标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序细胞中的待测核酸中的互补序列杂交列杂交,从而对组织细胞中的从而对组织细胞中

2、的核酸进行定性、定位和相对定核酸进行定性、定位和相对定量分析。量分析。原位杂交原位杂交荧光原位杂交（荧光原位杂交（fish）原理：通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。二、二、fish的优点：的优点：三、三、fish探针探针l优点：在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大l缺点 步骤较多, 操作麻烦。（一）、直接标记和间接标记（一）、直接标记和间接标记直接用荧光素标记dna的方法称为直接标记直接标记。l优点：由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应。由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针应用越来越多。探针标记（二）、

3、（二）、fish探针的种类探针的种类四、fish的临床应用染色体着丝粒荧光染色体端粒荧光fish检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充手段：手段： 传统的染色体检查方法周期长，人工消耗大，而且染色体分析需要有较好质量的中期分裂相。白血病患者肿瘤细胞中期分裂相不易获得，而且有些重要预后意义的累及基因位点的微缺失或仅存在于间期细胞中的异常，传统的细胞遗传学技术是不能检测出来的。 荧光原位杂交技术不需要中期分裂相，因此可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、重复性好、敏感性和特异性高的优点。但需要指定基因特异性的探针，失去了核型分析的宏观

4、性。translocation t(9;22)(q34;q11)translocation t(9;22)(q34;q11)在正常的细胞中，两个红点和两个绿点分别表示正常的abl和bcr基因的正常位置。在不正常的细胞中，bcr-abl融合基因呈现为红绿两种颜色的融合，这种融合基因常常在观察中显示为黄色荧光（箭头所指）。五、几种新技术介绍五、几种新技术介绍1.多色荧光原位杂交（多色荧光原位杂交（m-fish）采用全染色体探针（wcp）与染色体杂交，分析染色体数量和结构异常的分子生物学方法。探针是经过聚合酶链反应(degenerate oligonucleotideprimedpolymerase

5、 chain reaction, dop-pcr)扩增、流式分选、 并用 5 种荧光素组合荧光标记法标记的同源染色体。这种经过标记的探针集合(pool)与制备好的间期细胞染色体杂交, 可使杂交后的每条染色体表现出独有的颜色, 从而能够分辨出人的22 对常染色体和x、y 两条性染色体(图215), 杂交后的图像通过滤光装置被计算机获得并分析得出结果。如果一条染色体的颜色不相同, 则提示该条染色体有重组现象, 根据每条染色体各自独有的颜色, 可以知道哪几条染色体之间进行了重组m-fish 对染色体间复杂易位的分析有突出优势, 但是对染色体微小易位(1mb)的分析则受到限制, 而对染色体内部异常的分

6、析则无能为力, 这包括染色体的扩增、微小缺失和倒位染色体光谱核型比对分析技术（sky-spectral-karyotyping)-创新的染色体数目和结构异常检查工具原理：光谱核型分析sky经由ccd相机撷取图像，利用光谱干涉仪及傅立叶转换技术，分辨获得图像每一像素点的光谱，以此标定出不同光谱的不同颜色。优势： 对比传统的m-fish,光谱核型分析技术的采用优势无法比拟。一 传统的技术使用显微镜荧光滤镜来分辨荧光信号，缺点存在严重的荧光信号干扰（cross-talk),信号重叠，信号位移等，无法有效分辨染色体，也无法准确诊断染色体的细微变异，异位。而sky完全克服以上缺点，对图像每一像素的光谱标

7、以不同颜色，显而易见。二 从成本上看，不需要电动显微镜，荧光滤镜仅使用一颗sky滤镜，skypaint探针做一次杂交，一次图像撷取，让使用人员减轻时间，精力，同时获取稳定结果。4. 4. 比较基因组杂交比较基因组杂交 comparative genomic hybridization (cgh) (cgh) 原理：原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析肿瘤的检测及其基因组分析是由是由kallioniemi等在等在1992年首先提出的，是年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组检

8、测整个肿瘤基因组dna增加或减少的强有力增加或减少的强有力的工具的工具比较基因组杂交（cgh） 比较基因组杂交原理示意比较基因组杂交原理示意 肿瘤肿瘤dnadna和对照和对照dnadna在染色在染色体上的相对结合量取决于两体上的相对结合量取决于两种种dnadna标本中相应杂交序列标本中相应杂交序列的多少的多少 因此可根据不同荧光強度因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因的比率而定量分析肿瘤基因組中組中dnadna的增加或丟失的增加或丟失等比混合等比混合比较基因组杂交过程比较基因组杂交过程dapidapi4 4,6-,6-二联脒二联脒-2-2-吲哚苯吲哚苯fitc异硫氰酸酯异硫氰酸酯tritc硫氰酸四甲基罗丹明硫氰酸四甲基罗丹明人染色体不同荧光素染色结果人染色体不同荧光素染色结果数字化图像数字化图像fitc/tritc fitc/tritc 荧光强度比率分析图荧光强度比率分析图ratio image fitc/tritcratio image fitc/tritc比较基因组杂交应用范畴比较基因组杂交应用范畴优势：优势： 可快捷检测中期、间期基因组可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道