实验三通课20134

1、一、物理因素对细菌的影响一、物理因素对细菌的影响 (1.5(1.5学时学时) ) 1. 1.高压蒸汽灭菌法（两个实验室一台）高压蒸汽灭菌法（两个实验室一台） 2.2.紫外线杀菌实验（普通平板：紫外线杀菌实验（普通平板：4 4个）个）二、二、肠道致病菌的鉴定肠道致病菌的鉴定(2.5(2.5学时学时) ) 1. 1.双糖铁培养基：双糖铁培养基：8 8个个 2.2.玻片凝集实验：每人一张玻片凝集实验：每人一张 3.3.革兰染色：每人一张革兰染色：每人一张三、药敏实验三、药敏实验(1(1学时学时) ) 示教示教 第三次实验课内容（第三次实验课内容（3 3个）个） 三、药敏试验三、药敏试验 二、肠道致病

2、菌的鉴定二、肠道致病菌的鉴定 一、物理因素对细菌的影响一、物理因素对细菌的影响 一、物理因素对细菌的影响一、物理因素对细菌的影响 1.1.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法2.2.紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响1.1.高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法完全杀灭细菌的繁殖体和芽胞完全杀灭细菌的繁殖体和芽胞压力：压力：103.4kpa103.4kpa温度温度: : 121.3121.3时间：时间：15-20min15-20min（4343页）页） 使用方法：使用方法：v加水至锅内达规定的水平面，放入欲灭菌物品，加水至锅内达规定的水平面，放入欲灭菌物品，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使以两两对称

3、的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使锅盖均匀密闭。锅盖均匀密闭。v用电炉加热，同时打开排气阀门，使冷空气逸用电炉加热，同时打开排气阀门，使冷空气逸出。待冷空气全部排出后，关闭排气阀。出。待冷空气全部排出后，关闭排气阀。v继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，继续加热注视压力表，器内压力又逐渐升高，直到压力表指在所需数字即调节热源，维持直到压力表指在所需数字即调节热源，维持151520min20minv停止加热，待压力自行下降至零时方可徐徐开停止加热，待压力自行下降至零时方可徐徐开放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。放排气阀，排尽余气，打开锅盖，取出灭菌物品。注意事项：注意事项：v 锅内物

4、品不宜过紧。锅内物品不宜过紧。v 注意排出冷气，否则气压表虽已达注意排出冷气，否则气压表虽已达1515磅，温度达磅，温度达不到不到121.3121.3，不能保证灭菌效果。，不能保证灭菌效果。v 灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或引灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或引起破裂。起破裂。v 不耐高热高压之物品，不能用此法。不耐高热高压之物品，不能用此法。v紫外线杀菌作用紫外线杀菌作用强强，而穿透能力，而穿透能力弱弱。v紫外线中波长紫外线中波长265-266nm265-266nm的杀菌作用最强。的杀菌作用最强。v杀菌机制：引起杀菌机制：引起dnadna链上相邻的胸腺嘧啶形成二聚链上相邻的胸

5、腺嘧啶形成二聚体，从而干扰体，从而干扰dnadna的复制和转录，导致细菌死亡。的复制和转录，导致细菌死亡。2.2.紫外线对细菌的影响紫外线对细菌的影响 方法方法: :（每个实验室（每个实验室4 4个培养皿）个培养皿） v取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，取一无菌滤纸片将平皿部分遮盖（或打开一半取一无菌滤纸片将平皿部分遮盖（或打开一半平皿盖），置于紫外灯下照射平皿盖），置于紫外灯下照射3030分钟，将纸片分钟，将纸片拿开，然后盖好平皿，拿开，然后盖好平皿，3737倒置培养倒置培养24h24h后取后取出观察结果。出观察结果。滤纸片用后需要用火烧掉滤

6、纸片用后需要用火烧掉 分三次接种，分三次接种，每次取一环。第每次取一环。第一次密涂接种后一次密涂接种后旋转旋转6060度二次密度二次密涂接种，然后同涂接种，然后同方向旋转方向旋转6060度后度后再次密涂接种。再次密涂接种。二、肠道致病菌的鉴定二、肠道致病菌的鉴定病原菌的检验程序病原菌的检验程序增菌培养革兰染色分离培养接种琼脂斜面纯培养采集标本生化试验生化试验血清学试血清学试验验动物试验动物试验分析鉴定革兰染色观察菌落观察菌落特征特征一、糖发酵试验一、糖发酵试验v 原理原理 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在

7、糖发酵培产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂养基中加入指示剂溴甲酚紫溴甲酚紫（即（即b.c.pb.c.p指示剂，其指示剂，其phph在在5.25.2以下呈黄色，以下呈黄色，phph在在6.86.8以上呈紫色），经培养后根以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置养基中放入倒置杜氏小管杜氏小管观察。观察。1 1、确定细菌是否生长。、确定细菌是否生长。2 2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+ +” ” 表示。表示。3 3、产

8、酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用泡，用“”表示。表示。4 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“- -”表示。表示。 结果结果 方法方法 取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色， 倒立小管内无气泡，接种细菌后置倒立小管内无气泡，接种细菌后置3737温箱培养温箱培养18-2418-24小小 时，观察结果。时，观察结果。 葡萄糖葡萄糖乳乳 糖糖 大肠杆菌大肠杆菌 伤寒杆菌伤寒杆菌 + - 副伤寒杆菌副伤寒杆菌 - 糖发酵实验

9、二、硫化氢产生试验二、硫化氢产生试验 v 原理原理 某些细菌能分解蛋白质中的某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸含硫氨基酸，如半胱氨酸、，如半胱氨酸、甲硫氨酸，生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或甲硫氨酸，生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。v 方法方法 分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养基中。基中。3737孵育孵育2424小时后观察结果。小时后观察结果。 结果结果 沿穿刺线部位呈黑褐色，表明沿穿刺线部位呈黑褐色，表明有硫化氢产生，为阳性以有硫化氢产生，为阳性

10、以“+ +”表示。表示。不变色者为阴性，以不变色者为阴性，以“- -”表示。表示。 大肠杆菌：大肠杆菌：- - 变形杆菌：变形杆菌：+ +双糖铁培养基双糖铁培养基v乳糖和葡萄糖乳糖和葡萄糖: : 产酸产酸或或产气产气。v硫酸亚铁硫酸亚铁: : 如细菌分解含硫氨基酸生成如细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢硫化氢, , 可形成黑色沉淀。可形成黑色沉淀。v酚红指示剂酚红指示剂: : 酸酸: : 黄黄 碱碱: : 红红 双糖铁培养基的用途双糖铁培养基的用途v用于观察细菌对葡萄糖及乳糖的发酵用于观察细菌对葡萄糖及乳糖的发酵 能力（产酸产气）。能力（产酸产气）。v用于观察细菌是否产生硫化氢。用于观察细菌是否产生

11、硫化氢。v大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验）大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验）, ,斜面及低层均呈黄色并有气泡。斜面及低层均呈黄色并有气泡。v沙门菌和志贺菌沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖只发酵葡萄糖, ,不发酵乳糖不发酵乳糖, ,分解葡萄分解葡萄 糖产的酸使培养基糖产的酸使培养基phph下降下降, ,酚红指示剂变黄酚红指示剂变黄, ,但是培养但是培养 基中的葡萄糖仅有基中的葡萄糖仅有0.1%,0.1%,斜面的酸性物质被氧化成斜面的酸性物质被氧化成 挥发性酸挥发性酸, ,且细菌氧化氨基酸物质产生的且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作氨的中和作 用用, ,斜面变红斜面变红, ,

12、而底层则为黄色。而底层则为黄色。v细菌分解含硫氨基酸生成的细菌分解含硫氨基酸生成的硫化氢硫化氢可以和可以和fesofeso4 4反应生反应生成成fesfes黑色沉淀。黑色沉淀。双糖铁培养基的特性双糖铁培养基的特性双糖铁培养基上细菌的生长现象双糖铁培养基上细菌的生长现象 大肠杆菌大肠杆菌黄色有气泡黄色有气泡伤寒杆菌伤寒杆菌上红下黄中间有黑色沉淀上红下黄中间有黑色沉淀痢疾杆菌痢疾杆菌上红下黄上红下黄double suger iron slantv1.1.标本的采集标本的采集 粪便标本粪便标本 ssss培养基培养基 v2.2.分离培养分离培养 观察菌落特点观察菌落特点 革兰染色革兰染色( (形态学鉴

13、定形态学鉴定) ) ss ss平板平板 接种双糖铁培养基（生化反应）接种双糖铁培养基（生化反应） 玻片凝集试验（血清学鉴定）玻片凝集试验（血清学鉴定） 肠道杆菌的鉴定程序 一、观察上次实验内容一、观察上次实验内容 在在ssss平板上可看到散在分布的大小不同、平板上可看到散在分布的大小不同、颜色不同的菌落。颜色不同的菌落。一种是较大的一种是较大的红色红色菌落。菌落。一种是较小的一种是较小的无色半透明无色半透明的菌落，中间有的菌落，中间有黑色沉淀黑色沉淀。方法：方法：穿刺穿刺+ +斜面斜面 v接种针挑取单个菌落，沿培养基中心垂直插入至距离接种针挑取单个菌落，沿培养基中心垂直插入至距离管底管底0.5

14、cm0.5cm处，原路退出。处，原路退出。v接种环挑取单个菌落，自斜面底部向上划一直线，然接种环挑取单个菌落，自斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上轻轻来回作蜿蜒划线。后再从斜面底部向上轻轻来回作蜿蜒划线。v培养培养18-2418-24小时，观察结果并分析小时，观察结果并分析。注意：注意：1. 应在菌落稀疏部位挑取单个菌落。应在菌落稀疏部位挑取单个菌落。 2. 穿刺和斜面接种原则上应为同一个菌落。穿刺和斜面接种原则上应为同一个菌落。 3. 不同的小组可以选择不同颜色的菌落来接种。不同的小组可以选择不同颜色的菌落来接种。二、双糖铁培养基的接种二、双糖铁培养基的接种 三、玻片凝集试验三、玻片

15、凝集试验 原理原理： 材料：材料：方法：方法： 1.1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用加样器分别在两边加沙门菌属多价加样器分别在两边加沙门菌属多价o o血清血清7 7微升。微升。 2.2.无菌操作下用接种环挑取无菌操作下用接种环挑取ssss平板上菌落（平板上菌落（黑色黑色菌落，粉红色大菌落菌落，粉红色大菌落）与血清混合研磨成均匀乳状。）与血清混合研磨成均匀乳状。 3.3.轻轻摇动玻片，经轻轻摇动玻片，经1 12min2min后观察结果。后观察结果。 伤寒血清伤寒血清+ +待测菌待测菌 伤寒血清伤寒血清+ +待测菌待测菌结果结果: 凝集凝集+ +

16、 ；无凝集；无凝集- - 注意事项：注意事项：注意涂菌时，需要标明菌落，以免混淆导致错注意涂菌时，需要标明菌落，以免混淆导致错误判断。误判断。摇动玻片时要小心，不要使液体流到手上。摇动玻片时要小心，不要使液体流到手上。实验结束将玻片放入玻片缸内，切勿任意放置实验结束将玻片放入玻片缸内，切勿任意放置或冲洗。或冲洗。四、挑取可疑菌落进行革兰染色四、挑取可疑菌落进行革兰染色v每组同学各选取一个大小和颜色每组同学各选取一个大小和颜色 不同的菌落不同的菌落v每人一张玻片每人一张玻片五、结果判断五、结果判断 vssss平板：菌落的形态、大小、颜色；平板：菌落的形态、大小、颜色；v革兰染色：形态，排列，染色

17、特点；革兰染色：形态，排列，染色特点；v双糖铁培养基上生化反应特点；双糖铁培养基上生化反应特点；v玻片凝集试验结果。玻片凝集试验结果。操作内容操作内容1.1.观察菌落特征（观察菌落特征（ssss平板）。平板）。2.2.将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+ +斜斜 面），面），3737培养培养24h24h，观察结果。，观察结果。 1 1支支/ /台台3.3.玻片凝集试验。玻片凝集试验。 1 1片片/ /人人4.4.取可疑菌落做革兰染色。取可疑菌落做革兰染色。 1 1片片/ /人人注意：按照上面的顺序依次进行实验。注意：按照上面的顺序依次进行实验。目的：目的：

18、1.1.掌握：掌握：纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定；纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定；2.2.了解：了解：药敏试验的操作方法和意义。药敏试验的操作方法和意义。v含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑制，形成透明的抑菌圈抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。菌对测定药物的敏感程度。 1.1.普通琼脂平板普通琼脂平板2.2.含抗生素的滤纸片：含抗生素的滤纸片： 青霉素青霉素 氯霉素氯