发酵工业菌种

1、第二章第二章 发酵工业菌种发酵工业菌种 一、一、常用的工业微生物常用的工业微生物二、二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术发酵工业菌种筛选的原则与基本技术三、三、发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良最常用的工业微生物最常用的工业微生物n细菌细菌n醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌n乳酸杆菌乳酸杆菌n枯草杆菌枯草杆菌n丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌n大肠杆菌大肠杆菌n谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌最常用的工业微生物最常用的工业微生物n酵母菌酵母菌n酿酒酵母酿酒酵母n假丝酵母属假丝酵母属n产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母产朊假丝酵母、解脂假丝酵母、热带假丝酵母n毕赤酵母

2、属、汉逊酵母属毕赤酵母属、汉逊酵母属最常用的工业微生物最常用的工业微生物n霉菌霉菌n曲霉属曲霉属n米曲霉米曲霉n黑曲霉黑曲霉n青霉属青霉属n青霉菌：点青霉、产黄青霉青霉菌：点青霉、产黄青霉n桔青霉桔青霉n根霉属根霉属n德氏根霉德氏根霉n米根霉、小麦曲根霉米根霉、小麦曲根霉n红曲霉属红曲霉属n紫红曲霉紫红曲霉最常用的工业微生物最常用的工业微生物n放线菌放线菌n链霉菌属链霉菌属n小单孢菌属小单孢菌属n地中海诺卡氏菌地中海诺卡氏菌n米苏里游动放线菌米苏里游动放线菌 未培养微生物未培养微生物n定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物

3、，其在自然环境微方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为生物群落中占有非常高的比例，约为99。n研究方法研究方法 模拟自然培养法模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、单原位培养、培养条件优化、单 细胞操作细胞操作 宏基因组分析法宏基因组分析法 二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术（一）（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求（二）（二）分离筛选原理与技术分离筛选原理与技术（三）（三）应用举例应用举例 1. 菌种选择的总趋势菌种选择的总趋势n野生菌野生菌变异菌变异菌n自然选育自然选育代谢控制育

4、种代谢控制育种n诱发基因突变诱发基因突变基因重组的定向育种基因重组的定向育种 2. 菌种选择的要求菌种选择的要求 n能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；的目的产物产量高、易于回收； n生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；n培养条件易于控制；培养条件易于控制；n抗噬菌体及杂菌污染的能力强；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；2. 菌种选择的要求（续）菌种选择的要求（续）n菌种不易变异退化；菌种不易变异退化；n对放大设备的适应性强；对放大设备的适应性强；n菌种不是病原菌，不产生任何有害的生菌

5、种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。物活性物质和毒素。（二）分离筛选原理与技术（二）分离筛选原理与技术1. 筛选的指导思想筛选的指导思想2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面3. 新种分离筛选原理与技术新种分离筛选原理与技术1. 筛选的两种指导思想筛选的两种指导思想 n先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。n分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株只获得选育所需的出发菌

6、株2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面n从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； n生产中长期使用的菌种的定期分离筛选生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；n从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株的的优良菌株 ；n从已知菌种和大自然中分离新菌株从已知菌种和大自然中分离新菌株n寻找新的发酵产品的产生菌；寻找新的发酵产品的产生菌；n寻找老产品的新的优良菌株。寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：从保藏机构获取菌种进行分离筛

7、选有两个好处： 经济性经济性 指导性指导性设计筛选方案时必须考虑两个要点设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性选择性灵敏度灵敏度3. 新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤 调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计试验方案设计 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 （如何使样品中所含微（如何使样品中所含微 生物的可能性大？）生物的可能性大？） 样品预处理样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可（如何在后续的操作中使这种可 能性实现）能性实现） 菌种分离菌种分离 根据目的菌株及其产物特点分根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法选择性分离方法 随机分离方法随机分离方法

8、(定向筛选定向筛选选择压力选择压力) (用筛选方案用筛选方案- 检测系统进行间接分离）检测系统进行间接分离）富集液体培养富集液体培养 固体培养基条件培养固体培养基条件培养 (初筛初筛) 菌种纯化菌种纯化 复筛复筛 菌种纯化菌种纯化初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索 再复筛再复筛 生产性能测试生产性能测试 较优菌株较优菌株1-3株株保藏及进一步做生产试验保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和某些必要试验和 或作为育种的出发菌株或作为育种的出发菌株 毒性试验等毒性试验等 含微生物样品的采集含微生物样品的采集n采样时应注意的问题采样时应注意的问题:n土壤微生物的分布土壤微生物的分布n采土深度采土深度n

9、土壤植被情况土壤植被情况n采样季节采样季节n土壤的酸碱度土壤的酸碱度n对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：n土壤来源广泛土壤来源广泛n在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种菌种样品的预处理样品的预处理n目的：提高分离效率目的：提高分离效率n方法：方法：n物理方法：热处理；膜过滤法；离心法物理方法：热处理；膜过滤法；离心法n化学方法化学方法n诱饵法诱饵法分离方法的选择分离方法的选择 n根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法n菌种的营养特征独特菌种的营养特征独

10、特 n生长特征独特生长特征独特 n无无选择性特征选择性特征 根据产物的特征进行根据产物的特征进行 随机分离随机分离 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。制，从而实现定向富集筛选。选择性分离选择性分离 选择性分离原理和技术选择性分离原理和技术n生长条件的选择与控制原理生长条件的选择与控制原理n控制营养成分控制营养成分 n控制培养基酸碱度控制培养基酸碱度 n添加抑制剂添加抑制剂 n控制培养温度控制培养温度 n控制通气条件控制通气条件 n选择性分离技术选择性分离技术n富集液体培养技术富集液体培养技术n固体培养技术固体培养技术施加选

11、择压力，进行定向筛选施加选择压力，进行定向筛选 a.富集液体培养富集液体培养n增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术n技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件n培养方式培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率分批培养方式：以最大比生长速率 （max）筛选，）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（连续培养方式：以比生长速率（ ）筛选）筛选 abs0基质浓度对基

12、质浓度对a、b两种菌的比生长速率（两种菌的比生长速率（）的影响）的影响 当当ss0时，富集什么菌株？时，富集什么菌株？连续富集培养技术分离菌株的优点连续富集培养技术分离菌株的优点 n分离的菌株特别适合连续发酵生产过程分离的菌株特别适合连续发酵生产过程n有利于分离具有某种工业生产特性的菌株有利于分离具有某种工业生产特性的菌株n可以筛选出能共生的稳定混合培养物可以筛选出能共生的稳定混合培养物b. 固体培养技术固体培养技术n常用于分离某些酶产生菌常用于分离某些酶产生菌 n选择压力：在选择培养基中加入所需酶选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质的基质随机分离原理与技术随机分离原理与技术n从产物入手，

13、通过设计从产物入手，通过设计高产培养基高产培养基和建立快速和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。选出所需的目的菌。n技术技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。筛选方法的确定。n随机分离技术举例随机分离技术举例 n抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选n生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选n多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选高产培养基设计的几个原则高产培养基设计的几个原则 n制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为制

14、备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；生长限制因素；n使用一聚合或复合形式的生长限制养分；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；n避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；阻遏；n确定含有所需的辅因子（确定含有所需的辅因子（co2+,mg2+,mn2+,fe2+）；）；n使使用用ph缓冲剂以减少缓冲剂以减少ph变化；变化；n前体、促进剂及抑制剂的采用。前体、促进剂及抑制剂的采用。抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n筛选模型：筛选模型：试验菌试验菌n筛选方法：筛选方法： 铺菌法铺菌法 复印平板法复印平板法 液体培养筛选液体培养

15、筛选 抗药性抗药性筛选筛选筛选模型：筛选模型：氨苄青霉素氨苄青霉素和和-内酰胺酶内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同产生菌（克雷白氏菌）协同 i i ii ii无试样时（不含棒酸时），无试样时（不含棒酸时），i i对对iiii菌作用不大菌作用不大有试样时（含棒酸时），有试样时（含棒酸时），i i对对iiii菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性 固体培养筛选固体培养筛选试验菌试验菌 代表微生物类型代表微生物类型金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌209p 革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌枯草杆菌枯草杆菌6633 革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌 大肠杆菌大肠杆菌 革兰氏阴性肠道细菌革兰氏阴性

16、肠道细菌耻垢分枝杆菌耻垢分枝杆菌607 结核杆菌结核杆菌白色念珠菌白色念珠菌 酵母状真菌酵母状真菌 青霉菌青霉菌 丝状真菌丝状真菌 药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选 n 药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。治疗的目的。n 筛选模型：目标酶筛选模型：目标酶生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选n 筛选模型：营养缺陷型试验菌筛选模型：营养缺陷型试验菌 n 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试

17、验菌生长营养缺陷型试验菌生长氨基酸产生菌的筛选氨基酸产生菌的筛选 样品样品 预处理预处理 初筛（除真菌）初筛（除真菌） 在分离平板上生长获得多个单菌落在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（复印平板（copy copy 法）法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到对应到copycopy前相应前相应 u.vu.v线杀死长好的菌落线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，目

18、的菌落进行液体培养， 对产物进行定量测定对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株筛选产物含量高的菌株多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选n取样特点：碳水化合物工业的废弃物取样特点：碳水化合物工业的废弃物n筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。筛选高产菌。细菌分离：以乳酸菌为例细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜

19、检培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养2-3代代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、caco3的琼脂培养基的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） rf值定性值定性 （有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点） 乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）放线菌的分离：放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）以产链霉素菌种的分离

20、为例（从退化菌种中筛选） 取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品1 1环环放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏斜面保藏 高产菌恢复高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以取发酵液少许以10倍稀释成倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法稀释分离法 取取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（加入固体培

21、养基铺平皿（2） 在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，25培养培养48-72h 形态筛选形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生成子囊孢子速度测定生成子囊孢子速度测定 发酵力测定发酵力测定 性能测定性能测定 热死温度测定热死温度测定 凝集力测定凝集力测定 双乙酰含量测定双乙酰含量测定菌种选育改良的具体目标菌种选育改良的具体目标n提高目标产物的产量提高目标产物的产量 n提高目标产物的纯度，减少副产物提高目标产物的纯度，减少副产物 n改良菌种性状，改善发酵

22、过程改良菌种性状，改善发酵过程 n改变生物合成途径，以获得高产的新产品改变生物合成途径，以获得高产的新产品 发酵工业菌种改良方法发酵工业菌种改良方法n常规育种常规育种(诱变育种诱变育种)n细胞工程育种细胞工程育种 n基于代谢调节的育种技术基于代谢调节的育种技术 n基因工程育种基因工程育种 n蛋白质工程育种蛋白质工程育种 n代谢工程育种代谢工程育种赖氨酸生产菌种的选育改良思路赖氨酸生产菌种的选育改良思路n出发菌株出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌n育种思路育种思路 1.优先合成的转换优先合成的转换渗漏缺陷型的选育渗漏缺陷型的选育 2.切断

23、支路代谢切断支路代谢营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：抗结构类似物突变株的选育：aec 4.解除代谢互锁：解除代谢互锁：leu- 、 抗抗leu结构类似物、结构类似物、 喹啉喹啉s 、 苯醌苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：增加前体物的合成和阻塞副产物的生成： ala-、抗、抗asp结构类似物结构类似物 选育适宜的选育适宜的co2固定酶固定酶/tca循环酶活性比突变株循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种应用细胞工程

24、和基因工程育种选育适宜的选育适宜的co2固定酶固定酶/tca循环酶活性比突变株循环酶活性比突变株赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径：赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径：通过通过tca循环循环 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 草酰乙酸草酰乙酸 天冬氨酸天冬氨酸 赖氨酸赖氨酸 通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应 葡萄糖葡萄糖 磷酸烯醇磷酸烯醇 草酰乙酸草酰乙酸 天冬氨酸天冬氨酸 式丙酮酸式丙酮酸 丙酮酸丙酮酸 赖氨酸赖氨酸 代谢工程的定义代谢工程的定义n利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基进行修饰、改造，

25、改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。起来的一个新的学科领域。n又称作途径工程，是多基因的基因工程。又称作途径工程，是多基因的基因工程。 代谢工程代谢工程发展基础发展基础 代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。是孤立地来考虑。代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。合

26、成起决定作用的少数节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为：根据节点下游分支的可变程度，节点分为：柔性节点柔性节点： 解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。产物的产量。半柔性节点半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。产量。刚性节点刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。：其下游各分支的比例不易改变。 代谢工程代谢工程发展基础发展基础相依网络相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避：代谢

27、网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。独立网络独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢修饰的应答能力，其对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。取决于各节点的刚柔性及其位置。 s i p s p b b1 b2相依网路相依网路独立网路独立网路（三）代谢工程育种思路（三）代谢工程育种思路1.1. 改变代谢流改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。断有害代