乙型肝炎病毒在肝外组织中复制并影响血糖调节

1、乙型肝炎病毒在肝外组织中复制并影响血糖调节 摘要 目的: 研究肝外组织是否支持乙型肝炎病毒复制以及乙型肝炎的泛嗜性对血糖调节的影响。方法: 利用PCR法检测麻鸭血清中的鸭乙型肝炎病毒以筛选携带鸭乙型肝炎病毒的麻鸭，分组后进行静脉葡萄糖耐量实验。分别提取携带鸭乙型肝炎病毒麻鸭的肝、胰、肾和肌肉组织总DNA，利用滚环扩增法检测肝、胰、肾和肌肉中是否存在鸭乙型肝炎病毒复制的标志分子共价闭合环状DNA。用SPSS中的ANOVA分析麻鸭血糖与携带鸭乙型肝炎病毒的关系，以及血糖与鸭乙型肝炎病毒在胰、肾和肌肉中复制的关系。结果: 利用PCR筛选出36只携带鸭乙型肝炎病毒麻鸭及60只阴性麻鸭，阳性率为37.5

2、%。携带DHBV麻鸭的肝、胰、肾和肌肉其复制标志物共价闭合环状DNA的检出率分别为100%、55.6%、66.7%、44.4%。携带鸭乙型肝炎病毒的麻鸭其空腹、0.5小时、1小时及2小时血糖浓度平均值均高于末携带鸭乙型肝炎病毒的麻鸭，肾和肌肉被感染的麻鸭其血糖平均值略高于末感染的麻鸭，但均无统计学意义。胰腺被感染的麻鸭其空腹、0.5小时、1小时及2小时血糖浓度平均值高于末感染的麻鸭，且具有统计学意义（P0.05）。结论: 乙型肝炎病毒肝外组织可支持乙型肝炎病毒复制，乙型肝炎病毒感染胰腺可能是诱发糖耐量异常的原因之一。关键词 乙型肝炎病毒； 泛嗜性； 血糖调节 HBV Replication i

3、n Extrahepatic Tissues and Impactin the Blood Glucose RegulationAbstract Object This study attempts to investigage whether the extrahepatic suports the replication of hronic hepatitis B virus (HBV), and whether HBV replication in extrahepatic infuences blood glucose regulation. Methods The duck wth

4、duck hronic hepatitis B virus (DHBV) were screened by amplified the DHBV DNA from the serum of duck, the blood glucose regulation were evaluated by intravenous glucose tolerance test. The total DNA of hepatic tissues, pancreas, kidney and muscle of duck with DHBV were extracted, then using rolling c

5、ircle of amplification to exame the the cccDNA of DHBV. The relation between the blood glucose regulation and the DHBV replication in hepatic, pancreas, kidney and muscle was evaluated by the ANOVA. 推荐精选Results Total 36 ducks were screened the positive for DHBV and 60 ducks were negative, the positi

6、ve rate of ducks with DHBV were 37.5%. The detection rate of hepatic tissues, pancreas, kidney and muscle of DHBV cccDNA were 100%, 55.6%, 66.7%, 44.4% respectively. The averages of blood glucose concentration of duck with DHBV were higher than the duck without DHBV, includinf the blood glucose conc

7、entration of empty stomach, half an hour, 1 hour and 2 hour after injected sugar of blood glucose concentration of duck, but there were no statistically significant, the same results were observed in duck which cccDNA screened was positive in kidney and muscle. The averages of blood glucose concentr

8、ation of duck which cccDNA screened was positive in pancreas was higer than that cccDNA screened was negative, and there were statistically significant (P0.05). Conclusions HBV can replicated in extrahepatic tissues and HBV infection pancreas are attributable to the impaired glucose tolerance.Key wo

9、rds hepatitis B virus, extrahepatic tissues, blood glucose regulation 世界卫生组织统计全世界有3.5亿慢性乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者，而我国属HBV感染高流行区，有1.3亿人HBV表面抗原阳性，每年因肝病死亡人数约30万1-3。慢性活动性肝炎可引发多种并发症，如肝源性糖尿病、肾炎、消化系统病变等4，5，其中肝源性糖尿病是乙肝患者常见的并发症，据研究报道乙肝患者并发糖尿病的几率为9%-16%6。但其发病机制并不清楚。 现有大量的科学研究证实在肝外组织可检测到HBV，但由于乙肝病毒存在于血液当中

10、，各肝外组织检测到的HBV DNA是存在于各肝外组织细胞中还是存在于肝外组织的血液中还无法明确界定。 DHBV（duck hepatitis B virus, DHBV）和HBV均为嗜肝DNA 病毒, 它们都有相似的基因组和病毒结构特征以及通过RNA 逆转录复制的特性，由于DHBV不受宿主组织细胞来源的限制，因此HBV的复制机制的特点均基于对DHBV复制研究的基础之上7。本研究拟以携带DHBV的麻鸭为实验动物，研究肝外组织是否支持乙型肝炎病毒复制以及乙型肝炎病毒的泛嗜性对血糖调节的影响。1 材料与方法1.1 材料 推荐精选1.1.1 主要试剂 QIAamp DNA Micro试剂盒购自德国Qi

11、agen公司；Taq DNA Polymerase、2Taq PCR MasterMix均购自北京天根生化科技公司；葡萄糖试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司；胰RNase A 、牛血清标准蛋白、质粒DNA小量抽提试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒及普通生物化学试剂均购自上海生工生物工程公司，75乙醇、无水乙醇购自于广东精细化学工程技术研究开发中心；phi29 DNA Polymerase购自Fermentas公司。克隆载体pGEMTeasy购自美国Promega公司。引物均由上海生工生物工程合成。1.1.2 引物 根据GenBank公布的DHBV基因全长序列，参考有关文献设计筛选携带DHBV麻

12、鸭的引物Ps1和Ps2，其扩增DHBV 部分S基因；根据DHBV的高度保守序列设计了4对RCA引物RCA18，分别与DHBV的正负链互补；此外，设计了一对跨缺口扩增DHBV的引物PK1和PK2，及设计了一对全长扩增DHBV的引物DP1和DP2。引物序列及位置见表1，均由上海生物工程有限公司合成。表1 DHBV引物序列一览表引物名称引物序列位置Ps15- AGCTGGCCTAATCGGATTAC -3nt1319-1338Ps25-TGTCCGTCAGATACAGCAAG-3nt1581-1562RCA15-AATTCTCGAAATA*C*T -3nt1361-1375RCA25-GATCCGA

13、GGGCAG*T*A -3nt1668-1654RCA35-CCAATGGGAGTCG*G*T -3nt1610-1624RCA45-TACACGTGGCAAA*G*G-3nt2164-2150RCA55-CTGTACCTTTGCC*A*C-3nt2145-2159RCA65-CCGCAATTCTTTC*C*A -3nt1912-1898RCA75-TAGAAGAAGAAAA*G*T -3nt267-281RCA85- AGTAAATGGTAAC*A*C-3nt2005-1991PK15- CCAACACATGGCGCAATATC -3nt2180-2199PK25- GCCTAAAGGTAT

14、CTCCTCAG -3nt2958-2939注：*为硫代修饰碱基推荐精选1.2 方法1.2.1 鸭血清中DHBV的提取及检测翅静脉采集麻鸭的全血，分离血清。取100 L血清沸水浴10 min后12 000g离心10 min。PCR反应体系为：2Taq PCR MasterMix 12.5 L，10 mM引物Ps1，Ps2各加0.5 L，Taq DNA Polymerase 0.5 L，上述上清液5 L，加无菌双蒸水至25L。扩增条件为：94 3 min；94 30 s，56 40 s，72 30 s，共35个循环；72 7 min，68 10 min。以筛选携带DHBV的麻鸭。扩增长度为262

15、bp。1%琼脂糖电泳检测结果。1.2.2 静脉葡萄糖耐量实验 将麻鸭饥饿过夜后，称量麻鸭重量，计算并准备好需要注射的葡萄糖。翅静脉采集麻鸭的全血后，注射准备好的葡萄糖，记下时间。之后再在0.5h、1h及2h时采血。4000 rpm离心10 min，取上清液至另一离心管。按照葡萄糖试剂盒（氧化酶法）的说明书测血糖浓度。剩余血清置于20保存备用。1.2.3 携带DHBV麻鸭各组织DHBV DNA的提取 分别解剖每只携带DHBV的麻鸭，获取适量肝、胰腺、肾及肌肉组织，经PBS漂洗后，液氮保存。分别从这四种组织中提取DHBV cccDNA，操作步骤按QIAamp DNA Micro试剂盒说明书进行。置

16、于20保存备用。1.2.4 滚环扩增 分别取8.5 L麻鸭血清DHBV DNA，肝组织总DNA及肝组织DHBV DNA为模板，加入29 DNA Polymerase buffer 1 L，4对RCA引物混合液 (10 mol/L) 0.5 L ，混匀后入PCR仪，95 3 min，50 15 s，30 15 s，20 10 min后放置冰上。在上述产物中加入29 DNA Polymerase buffer 1 L，4对RCA引物混合液 (10 mol/L) 0.5 L，BSA (5 mg /mL) 0.2 L，dNTP (2.5 mmol/L) 1.6 L，29 DNA polymerase

17、(10 U/L) 10 U，补足水至总体积为20 L，混匀后放入PCR仪，30 18 h，65 10 min。1%琼脂糖电泳检测结果后，置于20保存备用。1.2.5 跨缺口引物PCR扩增 根据DHBV的正负链缺口设计跨缺口引物，PK1及PK2引物序列如表1。PCR反应体系为：2Taq PCR MasterMix 12.5 L，10 mM引物PK1、PK2各加0.5 L，Taq DNA Polymerase 0.5 L，上述RCA产物1 L，加无菌双蒸水至25 L。反应条件为：94 预变性3 min；94 40 s，56 30 s，72 1 min，共35个循环；72 5 min。扩增长度为77

18、9 bp。推荐精选1%琼脂糖电泳检测结果。2 结果2.1 鸭血清中DHBV的提取及检测 以PCR方法筛选96只麻鸭，检测出36只血清中携带DHBV的麻鸭，阳性率为37.5%。部分血清检测结果如图1，扩增片段大小约为262bp，阳性血清扩增出正常的阳性条带，阴性血清无扩增条带。 图1 PCR筛选DHBV阳性的麻鸭电泳图待测为部分待检测的麻鸭血清的扩增产物，“+”和“-”分别为阳性血清的扩增产物和阴性血清扩增产物。2.2 滚环扩增 以RCA方法扩增同一只阳性麻鸭的血清DHBV DNA、肝、胰腺、肾和肌肉组织的DNA，部分实验结果如图2。血清中DHBV以rcDNA存在，无条带，而肝细胞中DHBV以c

19、ccDNA存在，有较好的扩增，与预期相符。推荐精选 图2 血清、肝、胰腺、肾和肌滚环扩增电泳图2.3 跨缺口引物PCR扩增分别从同一只麻鸭血清DHBV DNA、肝、胰、肾和肌肉组织的RCA产物中取0.5uL为模板，其中阴性对照以水为模板，用跨缺口引物PCR扩增，部分结果如图3，扩增片段大小约为790bp。血清及阴性对照无条带，肝细胞扩增出阳性结果，与预期相符，胰腺、肾及肌肉组织均扩增出阳性结果。经统计，从96只麻鸭中检测出的36只阳性麻鸭，血清均无跨缺口引物的PCR扩增产物，肝组织扩增出目的片段的概率为100%，与预期相符，胰腺、肾和肌肉中分别检测出cccDNA，其中胰腺是20只，肾是24只，

20、肌肉16只。胰腺、肾及肌肉检测到DHBV cccDNA的概率分别为55.6%、66.7%、44.4%。 图3 血清、肝、胰腺、肾和肌跨缺口引物PCR检测电泳图2.4葡萄糖耐量实验推荐精选 将96只麻鸭分组，以葡萄糖试剂盒测定麻鸭空腹血糖、0.5小时、1小时及2小时血糖浓度。表一：麻鸭的阳性血清与阴性血清血糖检测 单位mmol/L数量空腹血糖浓度0.5小时血糖浓度1小时血糖浓度2小时血糖浓度血清检测阳性36只10.50392.481123.98486.887515.85286.551411.86265.5569血清检测阴性60只10.31211.346622.43874.106214.65953

21、.062811.04552.1579表二：携带DHBV的麻鸭的胰腺cccDNA检测阳性与阴性的血糖检测 单位mmol/L 数量空腹血糖浓度0.5小时血糖浓度1小时血糖浓度2小时血糖浓度胰腺cccDNA检测阳性19只10.94102.636628.42897.7936 20.034010.7755 15.653310.7225 胰腺cccDNA检测阴性17只9.28471.4027 23.32412.5132 12.68022.3207 10.41851.7842 表三：携带DHBV的麻鸭的肾脏cccDNA检测阳性与阴性的血糖检测 单位mmol/L数量空腹血糖浓度0.5小时血糖浓度1小时血糖浓度

22、2小时血糖浓度肾脏cccDNA检测阳性24只9.81562.449627.05727.814017.658410.7398 14.81439.9016肾脏1210.98351.8808 24.36600.1463 14.98012.2040 10.35150.3828 推荐精选cccDNA检测阴性只表四：携带DHBV的麻鸭的肌肉cccDNA检测阳性与阴性的血糖检测 单位mmol/L数量空腹血糖浓度0.5小时血糖浓度1小时血糖浓度2小时血糖浓度肌肉cccDNA检测阳性12只9.87672.8901 22.83902.8102 12.81943.3682 9.72491.0986 肌肉cccDNA

23、检测阴性24只10.36902.1267 27.82077.1329 18.738810.0798 15.12779.6906 3 讨论 目前对乙肝并发糖尿病发病机制主要有三方面的解释：外周组织产生胰岛素抵抗、肝细胞损害造成肝功能障碍导致糖代谢异常及肝病病毒对胰腺的直接侵犯或免疫损害8，9。但其具体的分子机制并不清楚。时德仁等10，11报道HBV可影响胰岛，细胞超微结构，并认为HBV可直接侵害胰岛细胞，是引起乙肝并发糖尿病发病机制之一。共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的形成是乙型肝炎病毒侵入细胞后在细胞内进行复制的起始步骤，也是前

24、基因组RNA复制的原始模板，是建立病毒感染状态的最重要标志，故cccDNA可作为HBV复制的重要指标12。因HBV在血液中以rcDNA的形式存在，如在肝外组织中检测到cccDNA标志着此HBV DNA必然在肝外组织细胞中复制而不是存在于肝外组织的血液中。我们建立了滚环式扩增法（rolling circle amplification，RCA）13检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的方法14，15，并以此方法对携带DHBV麻鸭的肝、胰、肾和肌肉进行cccDNA检测，结果发现除肝组织外，发现胰、肾和肌肉组织中存在DHBV的cc

25、cDNA，证实了乙型肝炎病毒确实具泛嗜性，可在肝外组织中复制。推荐精选我们的实验证实胰腺被感染的麻鸭其空腹、0.5小时、1小时及2小时血糖浓度平均值高于末感染的麻鸭，且具有统计学意义（P0.05）。但DHBV是否由于感染了胰腺并在胰腺中复制表达其蛋白，影响胰岛素的分泌进而引起血糖调节受损还有待研究。参考文献1 Akbar DH, Siddique AM, Ahmed MM. Prevalence of Type-2 diabetes in patients with hepatitis C and B virus infection in Jeddah, Saudi Arabia. Med P

26、rinc Pract, 2002, 11: 82-85.2 赵英杰, 熊良仲, 高志文. 对慢性乙型肝炎发病机制的再认识J . 华西医学, 2004, 19( 2) : 345.3 沈松林. 病毒性肝炎的肝外表现J . 山东医药, 1998, 38( 8) : 42-43.4 Lin CY. Hepat it is B virus deoxyribonucl eic acid in kidney cells probablyleading to viralpathogensis among hepat it is B virus associated membranousnephropathy

27、 patientsJ .Nephron, 1993, 63( 1) : 58-64.5 Canem D,Prince AM.Hepatitis B virus infection-Natural history and clinical consequencesJ. N Engl J Med, 2004, 11:121336.6 Wright T L.Introduction to chronic hepatitis B infectionJ. Am J Gastroenterol, 2006, 101(Suppl1): 1-6.7 Technology Planning and Management Corporation Canterbury Hall. Report on Carcinogens Background Document for Hepatitis B Virus.20038 Takumi K, Eitaro T, Minoru I, et al. Insulin resistance and chronic liver disease, World