重组人白细胞介素-2

1、重组人白细胞介素重组人白细胞介素-2Recombinant Human Interleukin-2白细胞介素-2基本信息为多肽类免疫增强剂，是一种淋巴因子。为多肽类免疫增强剂，是一种淋巴因子。刺激刺激B细胞增殖分化和分泌抗体。细胞增殖分化和分泌抗体。诱导干扰素和多种细胞因子的分泌诱导干扰素和多种细胞因子的分泌用于肿瘤辅助治疗和癌性胸、腹水的治疗用于肿瘤辅助治疗和癌性胸、腹水的治疗。也可各种自身免疫病的治疗。也可各种自身免疫病的治疗。对乙型肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染对乙型肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染等具有一定的治疗作用等具有一定的治疗作用。免疫作用机理IL -2 能与任何能形成

2、IL -2 受体的细胞, 如辅助性T 细胞(T H ) 、细胞毒性T 细胞(T e ) 、B 细胞和自然杀伤细胞结合, 但结合的强度以T c 细胞为最高。IL -2 与相应受体结合后, 细胞即从G 相进入S相并开始分化增殖。2021-10-163临床应用1. 肿瘤治疗： 在恶性肿瘤的发病机制中, 肿瘤病人的白介素-2 含量较正常的水平低, 不能使NK、CT L、LAK 等杀伤细胞活化和增殖, 使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外源白介素-2, 帮助病人完成免疫监视功能, 这就是白介素-2 治疗肿瘤的免疫学基础。2.抗病毒感染3.对感染性疾病的治疗作用4.对其他疾病的治疗：白介素-2 在急

3、性白血病、抗高血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。2021-10-165二、生产制备生产制备的方式主要有两种：1、传统工艺制备2、基因工程制备其中以第二种方法为主传统工艺流程IL-2一级结构2021-10-168 IL-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中共有三个半胱氨酸（cys)分别在第58、105、125位，其中58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需，且易错配或生成二聚体，降低生物活性。 基因工程重组IL-2用点突变的方法把125位的cys改成Ser或Ala，使IL-2分子稳定性增强。 如果用点突变的方法把58或105位的cys变成其他氨基酸，则rIL-2的

4、活性几乎完全丧失。改造后的优点1.提高白细胞介素2的比活性2.提高白细胞介素2的稳定性： 由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。2021-10-1693.易于纯化： 在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2 。由于125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异构体和二聚体一方面会给纯化工

5、作带来麻烦，另一方面比活性降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而有利于IL-2的纯化。4.降低毒性： 125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活性进一步提高，在给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治疗的进行。2021-10-1610化学修饰：对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力, 延长其在体内的作用时间, 提高药效，降低或消除其在体内的免疫原性。对IL-2 进行修饰的主要为PEG,。 1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2, 作用时间提高

6、10 倍，而且免疫原性下降, 抗肿瘤性能提高, 毒副作用有所降低。 1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道; 随后白介素-2 的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了研究的热点。2021-10-1611基因工程制备流程IL-2 cDNA IL-2 cDNA 文库的构建文库的构建利用探针杂交筛选利用探针杂交筛选IL-2 cDNAIL-2 cDNA阳性克隆阳性克隆与质粒载体与质粒载体pBV220pBV220连接，连接，并转入大肠杆菌并转入大肠杆菌DH5aDH5aIL-2IL-2基因表达基因表达分离纯化包涵体分离纯化包涵体

7、溶解，复性，纯化溶解，复性，纯化纯化的纯化的rIL-2rIL-2T T细胞细胞mRNAmRNA反转录反转录cDNAcDNA 制备方法：1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选出目的菌。2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30 振荡培养8-10小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30 下培养11-13小时，再在42 下培养5-6小时，发酵后收集菌体。3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲液中，加溶菌酶，4 下作用30分钟，冰浴超声至完全破裂为止，离心

8、除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT。搅拌下缓慢滴加同体积PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-8mMol 尿素，室温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性杂志，沉淀再用缓冲液洗两遍，再将沉淀溶于PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-10mMol DTT-7至8Mol GuHCL,溶解1.5小时后离心取上清在4 保存。2021-10-16134.（1）凝胶层析：取上清装入sephacrylus-200中，用PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-3至6Mol GuHcl充分平衡后上样，平衡液洗脱，结果出现三个蛋白峰，收集第三峰，4 保存； （2）复性：取凝胶层析后样品，浓度为50mMol Tris.Hcl稀释三倍，加氧化和还原性谷胱甘肽，至1mMol和5-10mMol，调PH使为7-9，室温放置两小时，浓缩至10倍，过sephadex G25柱，用