第十五章DNA的复制、修复和重组

1、Chapter 15 DNA的复制、修复和重组的复制、修复和重组 1. 掌握遗传信息传递的中心法则。掌握遗传信息传递的中心法则。 2. 掌握掌握DNA复制的一般规律：复制的一般规律：DNA的半保留复制、的半保留复制、DNA的半不连续复制的概念。的半不连续复制的概念。 3.了解三种大肠杆菌了解三种大肠杆菌DNA聚合酶的催化特性及其功聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物用；了解原核生物DNA的复制过程。的复制过程。 4.了解使了解使DNA损伤的因素；损伤的因素；DNA损伤的修复机制：损伤的修复机制： 错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、直接修

2、复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要复、重组修复及倾向差错的修复的过程及过程所需要 的酶类；了解的酶类；了解DNA损伤修复的意义。损伤修复的意义。目的要求目的要求 19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出中心法则：遗传信息的提出中心法则：遗传信息的单向流动。单向流动。 1964-1970 1964-1970发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录及逆转录及RNARNA的复制存在于的复制存在于RNARNA病毒病毒 中 心 法 则中 心 法 则病毒（复制）病毒（复制）复制复制转录转录DNA RNA 蛋白质蛋白质翻译

3、逆转录逆转录 复制：复制：以亲代以亲代DNADNA或或RNARNA为模板，根据为模板，根据碱基配对的原则碱基配对的原则，在一，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNADNA或或RNARNA的过程。的过程。 转录：转录：以以DNADNA为模板，按照碱基配对原则合成为模板，按照碱基配对原则合成RNARNA，即将即将DNADNA所所含的遗传信息传给含的遗传信息传给RNARNA，形成一条形成一条与与DNADNA链互补的链互补的RNARNA的过程。的过程。 翻译：翻译：亦叫转译，以亦叫转译，以mRNAmRNA为模板，将为模板，将mRNAmRNA的密码解读成蛋白的

4、密码解读成蛋白质的质的氨基酸顺序氨基酸顺序的过程。的过程。 逆转录：逆转录：以以RNARNA为模板，在为模板，在逆转录酶逆转录酶作用下，生成作用下，生成DNADNA的过程。的过程。几个基本概念几个基本概念Reverse transcription1 DNA的代谢的代谢一、一、DNA代谢包括代谢包括DNA复制、修复和重组复制、修复和重组二、大肠杆菌遗传图二、大肠杆菌遗传图 遗传图：遗传图：通过遗传学方法测定的一物种各基因通过遗传学方法测定的一物种各基因沿着染色体相对顺序和位置的排列图。沿着染色体相对顺序和位置的排列图。 一、关于模板的概念一、关于模板的概念二、二、DNA的半保留复制的半保留复制

5、1. 定义定义 以以亲代亲代DNA双链双链为模板以为模板以碱基互补碱基互补方式合成子代方式合成子代DNA，这样新形成的子代这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制半保留复制。 2. 半保留复制的实验证据半保留复制的实验证据 1958年年Meselson和和Stahl用用15N标记标记大肠杆菌大肠杆菌DNA，首先证明了，首先证明了DNA的半保留复制。的半保留复制。全保留与全保留与全新复制全新复制分散复制分散复制半保留复制半保留复制DNADNA半保半保留复留复制图制图示示半 保 留 复

6、制 的 证 明半 保 留 复 制 的 证 明 Meselson和和Stahl将将15N标记的标记的15NH4Cl加入大肠杆菌加入大肠杆菌的培养基中培养的培养基中培养12代，使大肠杆菌代，使大肠杆菌DNA都带上都带上15N标记，标记，然后将该大肠杆菌转入然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后的普通培养基中培养后,分离分离子一代、子二代、子三代、子四代子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行进行氯氯化铯化铯密度梯度离心，实验证明了密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。的半保留复制。亲代亲代DNADNA（1515N N1515N N）子一代子一代DNADNA（1515N N1414N

7、 N）子二代子二代DNA(DNA(1515N N1414N,N,1414N N1414N 1N 1:1)1)子三代子三代DNA(DNA(1515N N1414N,N,1414N N1414N 1N 1:3)3)子四代子四代DNA(DNA(1515N N1414N,N,1414N N1414N 1N 1:7 7) )亲代亲代DNADNA与子二代与子二代DNADNA的混合物的混合物亲代亲代DNADNA与子四代与子四代DNADNA的混合物的混合物D N AD N A 半 保 留 复 制 的 生 物 学 意 义半 保 留 复 制 的 生 物 学 意 义 DNA的半保留复制表明的半保留复制表明DNA在代

8、谢上的在代谢上的稳定性稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。 DNA在代谢上的稳定性并非指在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物。是一种惰性物。双向复制双向复制单向复制单向复制复制原点复制原点复制叉复制叉DNADNA复制的主要方式复制的主要方式 大肠杆菌双链大肠杆菌双链环状环状DNADNA的复制（的复制（一个一个复制起点，双向复制）复制起点，双向复制） 真核细胞真核细胞线状染色体线状染色体DNADNA的复制方式（的复制方式（多个多个复制起点，双复制起点，双 向复制）向复制） 单向单向滚环式滚环式复制（噬菌体复制（噬菌体 X174D

9、NA X174DNA 单链环状）单链环状）3 不同位置不同位置D-D-环式环式复制方式（线粒体双链环状复制方式（线粒体双链环状DNADNA：两条链两条链 的的复制起点复制起点不同位置，且复制不同步）不同位置，且复制不同步）前导链前导链滞后链滞后链冈崎片段冈崎片段前导链：前导链：以以3 5 方向的方向的亲代链为模板连续合成的子代亲代链为模板连续合成的子代链。链。滞后链：滞后链：以以5 3方向方向的亲代链为模板的子代链先的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎逆复制叉移动方向合成冈崎片片段，再连接成滞后链。段，再连接成滞后链。半 不 连 续 复 制 的 发 现半 不 连 续 复 制 的 发

10、 现 日本学者冈崎（日本学者冈崎（1968 1968 ）：）：用用3 3H H dTdT标记标记T T4 4噬菌体感染大肠杆噬菌体感染大肠杆菌菌 短时间内分离的短时间内分离的DNADNA均为均为DNADNA小片段小片段 一段时间后一段时间后 检测到检测到 DNADNA大片段。当用大片段。当用DNADNA连接酶缺失的变异株时，检测到连接酶缺失的变异株时，检测到大量大量DNADNA小小片段的积累。证明片段的积累。证明DNADNA复制中有小片段合成。复制中有小片段合成。 一、一、DNA是由是由DNA聚合酶催化合成的聚合酶催化合成的n 原料：原料：四种脱氧核苷三磷酸（四种脱氧核苷三磷酸（dNTPdNT

11、P）n 需要需要模板：模板：以以DNADNA为模板链，合成子代为模板链，合成子代DNADNA，模板可以是双链模板可以是双链, , 也可以是单链也可以是单链DNADNA。合成产物与模板互补。合成产物与模板互补。n 需要需要引物：引物：一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）为引物，在大肠杆菌中，为引物，在大肠杆菌中，DNADNA 的合成需要一段的合成需要一段RNARNA链作为引物链作为引物，引物含，引物含33- -OHOH。 n 合成方向：合成方向：5 5 3 3 DNA聚合酶聚合酶 1956年，年，Kornberg等在大肠杆菌中首先发现等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，聚合酶，其后发现

12、该酶在许多生物中广泛存在。其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：该酶的催化性质如下：二、二、DNADNA复制的精确性（高保真复制）复制的精确性（高保真复制） DNA复制必须具有复制必须具有高度精确性高度精确性，在大肠杆菌的细胞，在大肠杆菌的细胞DNA复制复制中其中其错误率约为错误率约为1/1091/1010，即每即每1091010个核苷酸才出现一个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制复制100010000次才出现次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：

13、 （1）碱基的配对规律：）碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为碱基配错几率约为1/1041/105。 （2）DNA聚合酶的聚合酶的35外切酶活性的校对功能，外切酶活性的校对功能，使碱基使碱基的错配几率又降低的错配几率又降低1001000倍。倍。 （3）DNA的损伤修复系统。的损伤修复系统。三、大肠杆菌三种三、大肠杆菌三种DNADNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 1956年年Kornberg首先从首先从大肠杆菌大肠杆菌中分离。该中分离。该酶为单体酶，含一个锌原子。为酶为单体酶，含一个锌原子。为多功能酶多功能酶，具有，具有: （1）5

14、 3 聚合酶聚合酶功能（但持续合成功能（但持续合成DNA的能力差）；的能力差）； （2）3 5外切酶外切酶活性（校对功能）；活性（校对功能）； （3）还具有）还具有5 3外切酶外切酶活性（双链有效）；活性（双链有效）； 该酶缺失时大肠杆菌仍具有该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对合成酶活性，只是对DNA损损伤的修复能力伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在损伤的修复，以及在DNA复制时复制时RNA引物切除及其缺口引物切除及其缺口的填补。的填补。 Arthur Kornberg Arthur Kornb

15、erg 1918 Stanford University Stanford University Stanford, CA, USAStanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acidDNADNA聚合酶聚合酶 多亚基酶，聚合作用，聚合活力比多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNADNA聚合酶聚合酶高；高；

16、持续合成持续合成DNADNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNADNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNADNA聚合酶。聚合酶。该酶该酶具有具有33 5 5外切酶活性外切酶活性。其功能可能其功能可能在在修复紫外光引起的修复紫外光引起的DNADNA损伤损伤中起作用。中起作用。DNADNA聚合酶聚合酶 含含十种亚基十种亚基: ()，其中其中()称为称为核心酶核心酶，2称称为夹子，（为夹子，（2）组成）组成复合物复合物，其主要功能是帮助，其主要功能是帮助亚基亚基夹住夹住DNA，故称为故称为夹子装配器夹子装配器，该酶，该酶DNA合

17、成的合成的持续能力强持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，速度大，活性高，缺失缺失时 大 肠 杆 菌 因时 大 肠 杆 菌 因 D N A 复 制 抑 制 而 致 死 。复 制 抑 制 而 致 死 。因此认为该酶因此认为该酶DNA的真正复制酶的真正复制酶。亚基亚基相对分子相对分子量量亚基亚基数目数目基因基因亚基功能亚基功能1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadXholAholBholCholDdnaN聚合作用聚合作用3

18、5外切酶的校对功能外切酶的校对功能组建核心酶组建核心酶使核心酶二聚化使核心酶二聚化依赖依赖DNADNA的的ATPATP酶，形成酶，形成复合物复合物与与亚基结合，形成亚基结合，形成复合物复合物形成形成复合物复合物形成形成复合物复合物形成形成复合物复合物两个两个亚基形成滑动夹子，以提高酶亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。的持续合成能力。DNADNA聚合酶聚合酶全酶的亚基组成全酶的亚基组成前导链的合成前导链的合成滞后链的合成滞后链的合成DNA双螺旋双螺旋 DNA PolDNA Pol DNA Pol 结构基因结构基因不同种类的亚基数目不同种类的亚基数目相对分子质量相对分子质量35外切酶外切酶

19、53外切酶外切酶聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）持续合成能力持续合成能力功能功能Pol A1103,0001,000-1,2003-200切除引物，修复Pol B788,0002,4001,500修复Pol C10830,00015,000-60,000500,000复制大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶比较聚合酶比较蛋白质蛋白质功能功能相对分子量相对分子量（10103 3）分子分子/ /细胞细胞DNADNA旋转酶旋转酶（或拓扑异构酶）（或拓扑异构酶）DNADNA解链酶解链酶单链结合蛋白单链结合蛋白引物合成酶引物合成酶DNADNA聚合酶聚合酶引入或松开超螺旋引入或松开超螺旋使双链使

20、双链DNADNA解链解链稳定单链区稳定单链区合成合成RNARNA引物引物除去引物并填满缺口除去引物并填满缺口4004006565747460601091095050300300100100300300四、四、DNADNA复制许多酶和蛋白因子复制许多酶和蛋白因子 拓扑异构酶：拓扑异构酶：催化催化DNADNA的拓扑连环数发生变化的酶的拓扑连环数发生变化的酶, ,在在DNADNA重组修复和其重组修复和其它它转变方面起重要作用。转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的除连环数不同外其它性质均相同的DNADNA分子称为分子称为拓拓扑异构体扑异构体，催化拓扑异构体之间互变的酶称为，催化拓扑异构

21、体之间互变的酶称为拓扑拓扑异构酶异构酶。 拓扑异构酶拓扑异构酶 使使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。同转录有关。 拓扑异构酶拓扑异构酶 使使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。提供能量，同复制有关。 二者共同控制二者共同控制DNA的拓扑结构。的拓扑结构。两 类 拓 扑 异 构 酶 作 用 特 点两 类 拓 扑 异 构 酶 作 用 特 点 解螺旋酶（解链酶）解

22、螺旋酶（解链酶） 通过水解通过水解ATP将将DNA两条链打两条链打开。开。E.coli中中rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解每解开一对碱基需要水解2 ATP分子。分子。 单链结合蛋白单链结合蛋白 稳定稳定DNA解开的单链，防止复性和保解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。护单链部分不被核酸酶水解。 引物合成酶引物合成酶 催化引物催化引物RNA的生成。的生成。 引发前体引发前体 它由多种蛋白质它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和和 i 组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。组成。引发前体再

23、与引发酶结合组装成引发体。 引发体可以沿模板链引发体可以沿模板链5 3方向移动，具有方向移动，具有识别合成识别合成起始位点起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物合成。引物合成。移动和引发均需要移动和引发均需要ATP提供能量，提供能量，n蛋白具有蛋白具有ATP酶活力。酶活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段冈崎片段的合成的合成方向相反。方向相反。细胞细胞DNA复制的阶段性（以大肠杆菌为例）复制的阶段性（以大肠杆菌为例）一、复制的起始阶段一、复制的起始阶段1 1、起始复合物的形成：称为引发、起始复合物的

24、形成：称为引发2 2、RNARNA引物的合成引物的合成二、二、复制的延长阶段复制的延长阶段三、复制的终止阶段三、复制的终止阶段复制原点复制原点oriC和原点的识别和原点的识别 DNA的复制有特定的起始位点，叫做的复制有特定的起始位点，叫做复制原点复制原点，常用，常用ori C（或（或o）表示。大肠杆菌的复制原点表示。大肠杆菌的复制原点ori C由由245 bp构成，含两构成，含两组保守的重复序列：三个组保守的重复序列：三个13 bp的序列（富含的序列（富含A、T的序列）和的序列）和四个四个9 bp的序列；许多生物的复制原点也都的序列；许多生物的复制原点也都富含富含A、T区段区段。 复制原点复制

25、原点由由DnaA蛋白识别，在原点由蛋白识别，在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链（DNA双链的解开还需双链的解开还需DNA拓扑异构酶拓扑异构酶、SSB），在原点处），在原点处形成一个眼状结构，叫形成一个眼状结构，叫复制眼复制眼。 从复制原点到终点，组成一个从复制原点到终点，组成一个复制单位复制单位，叫，叫复制子复制子（基因组（基因组独立进行复制的单位）。独立进行复制的单位）。1 1. . 拓扑异构酶解开超螺旋。拓扑异构酶解开超螺旋。2 2. . DnaDna A A蛋白识别并在蛋白识

26、别并在ATPATP存在下存在下结合于四个结合于四个9 9 bpbp重复序列。重复序列。3 3. . 在类组蛋白（在类组蛋白（HUHU）、）、ATPATP参与参与下下, , Dan ADan A蛋白变性蛋白变性13 13 bpbp的重复的重复序列，形成开链复合物。序列，形成开链复合物。4 4. . DnaDna B B借助于水解借助于水解ATPATP产生的能产生的能量在量在DnaDna C C的帮助下沿的帮助下沿5 5 3 3 方向移动，解开方向移动，解开DNADNA双链，形成前双链，形成前引引发复合物。发复合物。5 5. . 单链结合蛋白结合于单链。单链结合蛋白结合于单链。6 6. . 引物合

27、成酶（引物合成酶（DnaDna G G蛋白）开蛋白）开始合成始合成RNARNA引物。引物。一、复制的起始一、复制的起始 真核生物真核生物的冈崎片段为：的冈崎片段为：100 - 200 100 - 200 bpbp 原核生物原核生物的冈崎片段为：的冈崎片段为：1000-2000 1000-2000 bpbpD N AD N A 链 的 延 伸链 的 延 伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶催化下，以四催化下，以四种种5-5-脱氧核苷三磷酸为底物，脱氧核苷三磷酸为底物，在在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯键端以磷酸二酯键连接脱氧核糖核苷酸并释放出焦连接脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。磷酸。DNA

28、DNA链延伸的同时进行前链延伸的同时进行前导链和滞后链合成。两条链方向导链和滞后链合成。两条链方向相反。相反。 前导链前导链 滞后链滞后链 冈崎片段冈崎片段 半不连续复制半不连续复制冈崎模型冈崎模型 前导链和滞后链的合成（前导链和滞后链的合成（DNADNA聚合酶的异二聚体催化）聚合酶的异二聚体催化）DNADNA连接酶：连接连接酶：连接DNADNA双链中的单链切口双链中的单链切口作用特点作用特点 大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶连接酶要求要求NAD+提供能量；提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。提供能量。T4噬菌体噬菌体DNA连接

29、酶不仅能连接双链连接酶不仅能连接双链DNA的粘性切口，而且能连的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链接无粘性末端的平头双链DNA。 DNA连接酶在连接酶在DNA复制、损伤修复、重组复制、损伤修复、重组等过程中起重等过程中起重要作用。要作用。顺时针终止陷阱顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱逆时针终止陷阱 TerTer: :终止陷阱，引起复制终止的特定区域，终止陷阱，引起复制终止的特定区域，2020bpbp的序列，终止的序列，终止利用物质利用物质TusTus可识别并结合，从而导致可识别并结合，从而导致DNADNA复制的终止。复制的终止。连环、解连环连环、解连环四、真核生物四、真核生物DNADNA复制

30、复制的特点的特点 1. 真核生物染色体有多个复制起点，称真核生物染色体有多个复制起点，称自主复制序列自主复制序列(ARS)或复制基因或复制基因(replicator)；多复制眼，呈双向复制，多复制子。；多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2. 冈崎片段长约冈崎片段长约200 bp，相当于核小体长度相当于核小体长度。 3. 真核生物真核生物DNA复制速度复制速度比原核比原核慢慢，速度为，速度为10003000 bp/ Min（仅为原核生物的（仅为原核生物的1/201/50）。）。 4. 真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速

31、生长的原核生物染色体而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多复制起点更多复制起点。5. 真核生物有真核生物有多种多种DNA聚合酶聚合酶，DNA聚合酶聚合酶（）是真正）是真正的复制酶，在的复制酶，在增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（PCNA）存在下有持续合成）存在下有持续合成能力。能力。PCNA相当于大肠杆菌相当于大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的的-夹子，夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。蛋白相当于夹子装配器。6. 真核生物线性染色体两端有真核生物线性染色体两端有端粒结构端粒结构，它是由许多

32、成串的，它是由许多成串的短重复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染短重复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在消除末段在消除RNA引引物后造成的空缺，使染色体物后造成的空缺，使染色体保持保持一定长度一定长度。端粒酶端粒酶是含一段是含一段RNA的逆转录酶。的逆转录酶。 7. RPA：真核生物的单链结合蛋白；真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和和MF-1切除切除RNA引物，引物，DNA聚合酶聚合酶填补缺口。填补缺口。DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA

33、聚合酶聚合酶DNADNA聚合聚合酶酶定位定位亚基数目亚基数目外切酶活性外切酶活性引物合成酶活性引物合成酶活性持续合成能力持续合成能力抑制剂抑制剂功能功能细胞核细胞核4中等中等蚜肠霉素蚜肠霉素引物合成引物合成细胞核细胞核1低低双脱氧双脱氧TTP修复修复线粒体线粒体235外切酶外切酶高高双脱氧双脱氧TTP线粒体线粒体DNA合成合成细胞核细胞核2 35外切酶外切酶有有PCNA时高时高蚜肠霉素蚜肠霉素核核DNA合成合成细胞核细胞核153 外切酶外切酶高高蚜肠霉素蚜肠霉素修复修复 (POL )真核细胞内有五种真核细胞内有五种DNADNA聚合酶聚合酶细菌和真核生物复制体的组成细菌和真核生物复制体的组成 组

34、 成 细 菌 真 核 生 物复制酶POL全酶POL/POL进行性因子夹子增殖细胞核抗原定位因子复合物RF-C(夹子装配器)引物合成酶Dna GPOL除去引物RNase H和POLRNase H和MF-1滞后链修复POL和DNA连接酶POL和DNA连接酶解螺旋酶Dna B（旋转酶）T抗原消除螺旋张力旋转酶TOP单链结合SSBRP-A六、逆转录（六、逆转录（reverse transcription reverse transcription ） 定义定义: 以以RNA为模板，按照为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。的过程称为逆转录，由

35、逆转录酶催化进行。 1970年年Temin等和等和Baltimore分别从分别从劳氏肉瘤病毒劳氏肉瘤病毒和小鼠和小鼠白白血病病毒血病病毒等致病等致病RNA病毒中分离出病毒中分离出逆转录酶逆转录酶，迄今已知的，迄今已知的致致癌癌RNA病毒都含有逆转录酶。病毒都含有逆转录酶。 用用DNA复制的复制的特异抑制物特异抑制物（放线菌素（放线菌素D）能抑制致癌能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响，可见病毒的复制无影响，可见致癌致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以所以Temin于于1964年年提出提出前病毒前病毒的假说。的假说。 以

36、前病毒形式整合到宿主细胞以前病毒形式整合到宿主细胞DNADNA中而使细胞恶性转化。中而使细胞恶性转化。单链病毒单链病毒RNA RNA RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子 双链双链DNADNA（前病毒）前病毒） 逆转录酶也和逆转录酶也和DNADNA聚合酶一样，沿聚合酶一样，沿5 5 33方向合成方向合成DNADNA，底物为四种底物为四种dNTPdNTP, ,并要求短链并要求短链RNARNA作引物。作引物。+RNA+RNA+DNA-DNA-RNA+RNA+DNA-DNA-DNA+DNA+致癌致癌RNARNA病毒的逆转录过程病毒的逆转录过程 逆转录酶是多功能酶，兼有逆转录酶是多功能酶，兼有

37、3种酶的活性种酶的活性 RNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； 核糖核酸酶核糖核酸酶H的活性，专一水解的活性，专一水解RNA-DNA杂交分杂交分子中的子中的RNA，可沿可沿5 3方向起核酸外切酶的作方向起核酸外切酶的作用用; 无校对功能，错误率高，易产生变异。无校对功能，错误率高，易产生变异。 cDNA：反义反义DNA 几乎所有真核生物几乎所有真核生物mRNA分子的分子的3末端都有一末端都有一段段polyA，当加入寡聚，当加入寡聚dT作为引物时，作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与该转录酶催

38、化下在体外合成与该mRNA互补的互补的DNA，称称cDNA。 逆转录酶发现的理论与实践意义：逆转录酶发现的理论与实践意义：不能把不能把“中心法则中心法则”绝对化，绝对化，遗传信息也可以从遗传信息也可以从RNA传递到传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤防治提供了新的线索。目前，逆转录酶已和病毒学的研究，为肿瘤防治提供了新的线索。目前，逆转录酶已经经成为研究工具。成为研究工具。 1983年，年，发现人类免疫缺陷病毒（发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience virus），感染），感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体

39、免疫系统损淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（伤，引起艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），该病毒为），该病毒为逆转录病毒。逆转录病毒。 端粒（端粒（telomere）是真核染色体末端的特殊结构，它一般含许多是真核染色体末端的特殊结构，它一般含许多串联重复的寡聚核苷酸序列，通常是串联重复的寡聚核苷酸序列，通常是TxGy的形式，的形式，x、y常为常为1-4。 端粒结构端粒结构提出了一个特别的生物学问题。提出了一个特别的生物学问题。DNA复制需要引物，但复制需要引物，但在线形在线形DNA分子中，分子中，DNA复制结束后，引

40、物去除留下的链的短缺无复制结束后，引物去除留下的链的短缺无法进行补缺，若没有特殊的机制解决末端复制，法进行补缺，若没有特殊的机制解决末端复制，DNA就会因为复制就会因为复制而不断变短。这个问题是由一种特殊的酶而不断变短。这个问题是由一种特殊的酶 端粒酶（端粒酶（telomerase）解决的。解决的。 端粒酶，端粒的合成酶端粒酶，端粒的合成酶，含有一段，含有一段RNA和蛋白质，其中的和蛋白质，其中的RNA成成分为分为150个核苷酸，并含个核苷酸，并含1.5个拷贝的与端粒互补的重复序列个拷贝的与端粒互补的重复序列CyAx，这是端粒这是端粒 TxGy合成的模板。端粒酶是以该段合成的模板。端粒酶是以该

41、段RNA为模板的逆转录为模板的逆转录酶，端粒合成时以该段酶，端粒合成时以该段RNA为引物和模板，合成因引物切除而产生为引物和模板，合成因引物切除而产生的的DNA末端缺口，使染色体的端粒达到正常的长度。末端缺口，使染色体的端粒达到正常的长度。端 粒 酶 是 一 种 逆 转 录 酶端 粒 酶 是 一 种 逆 转 录 酶端粒的合成端粒的合成 DNA的损伤与的损伤与DNA突变突变 DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNA的结构及功能发生改变的结构及功能发生改变。从

42、而引起生物突变，甚至导致。从而引起生物突变，甚至导致死亡。死亡。5 DNA修 复修 复 DNA突变突变 DNA的的核苷酸顺序核苷酸顺序永久性的改变称为永久性的改变称为DNA的突变。其主要形式有：的突变。其主要形式有：1. 点突变点突变 DNA分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。分子中一个碱基对替代另一个碱基对称为点的突变。2. 插入作用插入作用 DNA分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。分子中插入一个或几个碱基称为插入作用。3. 缺失作用缺失作用 DNA分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。分子中缺失一个或多个碱基对称为缺失作用。 沉默突变：沉默突变：突变影响非必需的突变影响非必需的DNA或突变对一个基因的功能的影或突变对一个基因的功能的影响可忽略，称为沉默突变。响可忽略，称为沉默突变。 回复突变：回复突变：一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变一些突变可以克服第一次突变造成的影响，这类突变称为回复突变。称为回复突变。 缺失、插入和移框突变；5.G C A G U A C A U G U C.3 丙 缬 组 缬