分光光度技术2课件

1、第二章第二章 分光光度技术分光光度技术分光光度技术分光光度技术v分光光度技术分光光度技术(分光光度法分光光度法)主要是指利用物质特有的光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。v 分光光度法是比色法的发展分光光度法是比色法的发展: 比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40120nm，精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过35nm，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。分光光度技术分光光度技术基本原理基本原理 分光光度计分光光度计 基本结构简介基本结构简

2、介 分光光度技术的基本应用分光光度技术的基本应用 分光光度法的误差分光光度法的误差 分光光度技术分光光度技术基本原理基本原理v一、光的基本知识一、光的基本知识v光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示： 式中为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。为频率，即每秒钟振动次数。为光速等于299770千米秒。v光属于电磁波。v自然界中存在各种不同波长的电磁波，分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10（1= 1, 000nm ）之间。其中200nm400nm为紫外光区，400nm760nm为可见光区，760nm10,00

3、0nm为红外光区。自然界的电磁波谱自然界的电磁波谱v射线(-ray)它是放射性物质发出的电磁波,波长在210-10m以下。是一种能量很大的光子流。在医疗上用射线作为“手术刀”来切除肿瘤,叫做刀,有很好的治疗效果。vX射线(X-ray)它是由X射线管产生的电磁波，波长在10-1510-7m，X射线对不同密度的物质有不同的穿透力。在医学上常用作医疗检查。在飞机场安全检查中，也常用X射线对行李进行透视查验。自然界的电磁波谱v紫外线(ultravioletray)当光电流通过两电极间的电离气体时，会产生紫外线。其波长在410-8410-7m。太阳光中含有紫外线。v紫外线能激发荧光，日光灯就是管内紫外线

4、激发涂在灯管内壁上的荧光粉而发出的近似日光光谱的照明灯。v紫外线也常用在医学上杀菌和防伪技术上。自然界的电磁波谱v可见光(visiblelight)它是能引起人的视觉感觉的电磁波，其波长范围是0.410-60.810-6m。太阳能发出可见光。可见光是由不同比例的七色光(红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫)所混合组成。v红外线(infraredray)通常情况下由灼热物体发出的电磁波，其波长范围是0.810-6110-3m。它们会导致物体温度的升高。红外电磁波在特定的红外敏感胶片上能形成热成像。自然界的电磁波谱v微波(microwave)常用于雷达设备上的波长很短的无线电波，其波长范围在110-31m。

5、由于微波的定向性好，常用发射、反射波的时间来测算目标的位置。微波炉是一种用微波的热效应来烹调食品的装置。v无线电波(radiowave)它是在电磁场的作用下无线电天线中自由电子发生振荡而产生的电磁波。波长范围在0.7510-31104m。分光光度技术分光光度技术基本原理基本原理v朗伯比尔（朗伯比尔（Lambert-Beer）定律）定律v吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比.vAlgTKLCvA吸光度，又称光密度“O.D”。vT透光度， TI / I。， I。-为照射到吸收池上的光强，I-为透过吸收池的光强。vk摩尔吸光系数（Lmol1cm1）。vL样品光程（cm），通常使用1.0cm 的

6、吸收池，L=1cm。vC-样品浓度（mol/L）。v由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“k”和物质的浓度“C”成正比。分光光度技术分光光度技术基本原理基本原理v吸光系数K取决于入射光的波长，溶液的性质和温度等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。在一定波长下，它是物质的特性常数。v不同物质可能有相同的最大吸收波长，但其吸光系数不一定相同。K值愈大，说明该物质溶液对光吸收愈强烈，则比色测定的灵敏度愈高。分光光度技术分光光度技术基本原理基本原理v吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：vAk1L1C1k2L2C2k3L3C3v即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的

7、算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。分光光度计分光光度计基本结构简介基本结构简介 vv分光光度计基本结构简介分光光度计基本结构简介v能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。测量其强度的仪器称为分光光度计。v分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源

8、、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。狭缝、样品池，检测器系统。 基本结构简介基本结构简介-光源光源 v光源光源v要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），的有白炽灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。金属弧灯（各种汞灯）等多种。v钨灯和卤钨灯钨灯和卤钨灯发射发射3203202000nm2000nm连续光谱，最适宜工作范围为连续光谱，最适宜工作范围为3603601000nm1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度

9、计的光源。，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。v氢灯和氘灯氢灯和氘灯能发射能发射150150400nm400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。光源。v汞灯汞灯发射的不是连续光谱，发射的不是连续光谱， 能量绝大部分集中在能量绝大部分集中在253.6nm253.6nm波长外，一般波长外，一般作作波长校正波长校正用。用。v钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英

10、的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。基本结构简介基本结构简介 -单色器v分光系统（单色器）分光系统（单色器）v单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。v用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石英棱镜工作波用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石英棱镜工作波长范围为长范围为185-4000nm185-4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。区和近红外区。v 棱镜的特点是波长越短，色散

11、程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到0.2nm0.2nm，而在长波段只，而在长波段只能达到能达到5nm5nm。v有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。基本结构简

12、介基本结构简介-狭缝、样品池狭缝、样品池v狭缝狭缝v狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。的纯度和强度，也直接影响分辩力。狭缝可在狭缝可在02mm宽度内调节，由宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。波长一起调节。v比色杯比色杯v比争杯也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚比争杯也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将

13、产生测定误差。玻璃比色杯只适用度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。 基本结构简介基本结构简介-检测系统检测系统v有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电

14、流愈大，此即此即光电效应。光电效应。v因光照射而产生的电流叫做光电流。因光照射而产生的电流叫做光电流。v受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的组成种受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的组成种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时能恢复。因此使用时不宜长期照射不宜长期照射，随用随关，以防止光

15、电，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。池因疲劳而产生误差。v基本结构简介基本结构简介-检测系统检测系统v光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物）做成，当光射到阴极且达到一定（多为碱土金属的氧化物）做成，当光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。生电流。光电管产生电流很小，需要放大

16、。v分光光度计中常用分光光度计中常用电子倍增光电管电子倍增光电管，在光照射下所产生的电，在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。基本结构简介基本结构简介-检测系统检测系统v检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟数字转换装置如数字式电压表等。模拟数字转换装置如数字式电压表等。721型可见分光光度

17、计v工作波长：340-1000nm721系列可见分光光度计v工作波长：340-1000nm721系列可见分光光度计（扫描型）v配置：简，操作软件、定量分析、时间扫描，可选配打印机、计算机 751型紫外可见分光光度计v工作波长：200-1000nm755PC型紫外可见分光光度计v标配：操作软件、定量分析、时间扫描、光谱扫描，可选配打印机、计算机 UNICO-2102紫外可见分光光度计v工作波长：200-1000nm分光光度技术的基本应用分光光度技术的基本应用v测定溶液中物质的含量测定溶液中物质的含量v单一物质的定量分析单一物质的定量分析v先测出其吸收光谱曲线，找出最大吸收波长。先测出其吸收光谱曲

18、线，找出最大吸收波长。v含量测定时所用波长通常要选择被测物质的含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，最大吸收波长，这样做有两个好处：这样做有两个好处：灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；v可以避免其它物质的干扰。可以避免其它物质的干扰。v可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池

19、的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。v分光光度计的应用-定量分析v混合样品的定量分析v吸收光谱不重叠的混合物定量方法 -互不干扰 分别测定v吸收光谱重叠的混合物定量方法v采用化学计量学方法可以克服光谱定量分析中出现的多重共线性、光谱重叠和组分的相互干扰等问题, 并且不需分离可直接

20、同时测定混合体系的各组分。因此发展了如主成分回归( PCR) 、小波包变换、人工神经网络( ANN) 以及遗传算法等多种线性或非线性的多元校准方法, 波长选择是光谱分析中各种多元校准方法的关键步骤。分光光度技术的基本应用分光光度技术的基本应用v定性鉴定v用紫外光谱鉴定化合物用紫外光谱鉴定化合物v使用分光光度计可以绘制使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。吸收光谱曲线。方法是用各种方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为

21、纵座标绘制吸光度纵座标绘制吸光度波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。v各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。分光光度技术的基本应用分光光度技术的基本应用v一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。v当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线一样时，则很可能它们是同一物质。v紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。v除了特殊情况外

22、，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。分光光度技术的基本应用分光光度技术的基本应用v结构分析v作为结构分析，紫外吸收光谱远不及红外吸收光谱重要可靠，因为紫外吸收光谱曲线的特征性不及红外光谱曲线，红外光谱曲线属指纹型，而大多数有机化合物在紫外光区无吸收。v利用紫外吸收光谱可鉴定化合物中具有共轭系统和芳环结构。分光光度技术的基本应用分光光度技术的基本应用v在生化分析领域主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。分光光度计的误差v浓度过高或过低的样品，易引起检测器标尺上的读数误差。从理论上推算，相对误差最小

23、的部分在透光度为36.8%处（或吸光度为0.4343处），故通常认为测定值在吸光度0.20-0.80范围内（透光度为20%65%）误差最小，超出此范围，相对误差均会增大。分光光度计的误差v影响分光光度计精确度的主要原因还有光谱纯度。一般应保持光谱带宽度在10nm以下，如果测定样品中有很狭窄的吸收峰，就必须有更小的光谱宽度，所以分光光度计均有可调的狭缝。在实际应用中，用较大的狭缝虽然可提高重现性，但加大光谱宽度反而减低了准确度。v原则为：在保证测定的情况下，应用较低的狭缝分光光度计的误差v散射光也是引起误差的重要因素。散射光指一切未经过测定溶液吸收，而又落到检测器上引起干扰的光，如室内自然光，也

24、包括能透过比色皿的非测定需要的其它波长的光。v v散射光干扰对高浓度测定特别有害，能使吸光度降低，标准曲线的高浓部分向下弯曲。v 使用原则：分光光度计宜安装在光线较暗的室内。荧光分析法v光致发光光致发光：物质受到光照射时，除：物质受到光照射时，除吸收吸收某种波长的光之外还会某种波长的光之外还会发射发射出比原来所吸收的波长更长的光，这种现象称为光致发光。出比原来所吸收的波长更长的光，这种现象称为光致发光。v荧光荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动激发态的最低振动能级返回基态能级返回基态时发射出的光。时发射出的光。v我们通常所说的荧光，是指物质在

25、吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧我们通常所说的荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等射线荧光等 v荧光分析法荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定鉴定和和含量测定含量测定的方法。的方法。v特点：特点：v1 1）灵敏度高）灵敏度高v2 2）选择性好）选择性好v3 3）方法简单快速，用样量少）方法简单快速，用样量少v

26、4 4）应用受限）应用受限荧光分析法的基本原理一、分子荧光一、分子荧光 （一）分子荧光的产生（一）分子荧光的产生 （二）荧光的激发光谱和发射光谱（二）荧光的激发光谱和发射光谱 二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构 三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素 一、分子荧光一、分子荧光v（一）分子荧光的产生（一）分子荧光的产生v1、分子的电子能级与激发过程、分子的电子能级与激发过程 基态基态+ +hv激发态激发态v光谱中电子能级可分为二组：光谱中电子能级可分为二组：v1 1）电子）电子自旋配对自旋配对的（电子自旋方向的（电子自旋方向相反相反，电子的净，电子的净自旋自旋S=0S=0，谱线多

27、重性，谱线多重性M=2S+1=1M=2S+1=1）称为单重态或单线）称为单重态或单线态，以态，以S S表示。表示。v2 2）电子）电子自旋非配对自旋非配对的（电子自旋方向的（电子自旋方向相同相同，其净自，其净自旋旋S=1S=1，谱线多重性，谱线多重性M=3M=3）称为三重态或三线态，以）称为三重态或三线态，以T T表示。表示。 v激发单重态与相应的三重态的区别在于电子激发单重态与相应的三重态的区别在于电子自旋方向自旋方向不同及三重态的不同及三重态的能级能级稍低一些。稍低一些。v三重态寿命较长。三重态寿命较长。v2、荧光的产生、荧光的产生基态基态光辐射光辐射激发态激发态基态基态释放能量释放能量v

28、振动弛豫振动弛豫（vibrational relexationvibrational relexation） 处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞，处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞，能量传递给溶剂分子，电子返回到同一电子激发态的最低振能量传递给溶剂分子，电子返回到同一电子激发态的最低振动能级。动能级。 特点特点：无辐射无辐射跃迁；只能在跃迁；只能在同一电子能级内同一电子能级内进行；时间进行；时间约为约为1010-12-12s s；使大多数电子激发态处于其最低振动能级上。；使大多数电子激发态处于其最低振动能级上。v内部能量转换内部能量转换（internal convers

29、ioninternal conversion）：内转换）：内转换 两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。子能级的过程。 特点特点：无辐射无辐射跃迁；两个电子激发态具有跃迁；两个电子激发态具有相同的多重性相同的多重性（都是单重态或都是三重态，如（都是单重态或都是三重态，如S S2 2* *SS1 1* *，T T2 2* *TT1 1* *）。）。处于激发单重态的分子通过振动弛豫和内转换，均可返回到处于激发单重态的分子通过

30、振动弛豫和内转换，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级。 v荧光发射荧光发射 处于第一激发单重态最低振动能级的电子以辐射形式发处于第一激发单重态最低振动能级的电子以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，发射的光量子射光量子而返回至基态的任一振动能级上，发射的光量子称为荧光。称为荧光。 特点特点： 1 1）发射光量子发射光量子，且荧光波长总是长于激发光波长；，且荧光波长总是长于激发光波长； 2 2）时间约为）时间约为1010-9-9-10-10-7-7s s； 3 3）荧光谱线有时呈现几个非常）荧光谱线有时呈现几个非常接近的峰接近的峰（电子返回到（电子返回

31、到基态不能振动能级，能级差不同，吸收波长不同）；基态不能振动能级，能级差不同，吸收波长不同）； 4 4）处于基态不同能级的电子会通过振动弛豫返回到基）处于基态不同能级的电子会通过振动弛豫返回到基态最低振动能级。态最低振动能级。v（二）荧光的激发光谱和发射光谱（二）荧光的激发光谱和发射光谱v激发光谱激发光谱（excitation spectrumexcitation spectrum）：）：不同激发波长不同激发波长的辐射引起物质发射的辐射引起物质发射某一波长荧光某一波长荧光的相对效率。的相对效率。 绘制：固定发射波长，荧光强度（绘制：固定发射波长，荧光强度（F F）对激发波）对激发波长（长（ex

32、ex）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。v荧光光谱荧光光谱（fluorescence spectrumfluorescence spectrum）：在所发射的）：在所发射的荧光中各种波长荧光中各种波长组分的相对强度。组分的相对强度。 绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（F F）对发射波长（对发射波长（emem）的关系曲线。）的关系曲线。荧光分析法通常采用荧光分析法通常采用exexmaxmax与与ememmaxmax。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱

33、磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱v（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系v能够发射荧光的物质同时具备两个条件：能够发射荧光的物质同时具备两个条件： 1 1）有强的）有强的紫外紫外- -可见吸收可见吸收 2 2）有一定的）有一定的荧光效率荧光效率 长共轭长共轭分子分子较强紫外吸收较强紫外吸收 刚性平面刚性平面结构分子结构分子较高荧光效率较高荧光效率v1 1、长共轭结构长共轭结构 具有具有* *跃迁跃迁 大多数产生荧光的物质都含有大多数产生荧光的物质都含有芳香环或杂环芳香环或杂环，电子共轭电子共轭程度越大，荧光强度越大，荧光

34、波长也长移。程度越大，荧光强度越大，荧光波长也长移。v2 2、分子的刚性分子的刚性- -共平面性共平面性 分子刚性分子刚性- -共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。v3 3、取代基取代基 1 1）给电子取代基给电子取代基，如，如-NH-NH2 2、-OH-OH、-OCH-OCH3 3、-NHR-NHR、-NR-NR2 2、-CN-CN等，能增加分子的等，能增加分子的电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光波长长移。波长长移。 2 2）吸电子取代基吸电子取代基，如，如-COOH-COOH、-NO-NO2 2、-C=O

35、-C=O、-NO-NO、-SH-SH、- -NHCOCHNHCOCH3 3、-F-F、-Cl-Cl、-Br-Br、-I-I等，减弱分子的等，减弱分子的电子共轭程度，电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。使荧光减弱甚至熄灭。 3 3）取代基对）取代基对电子共轭体系电子共轭体系作用较小作用较小，如，如-R-R、-SO-SO3 3H H、 -NH-NH3 3+ +等，对荧光影响也不明显。等，对荧光影响也不明显。荧光探针分子的几个基本要求荧光探针分子的几个基本要求 v（1）能产生稳定的，较强的荧光。v（2）探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的 结合，而且结合得比较牢固。v（3）探针的荧光必须对环境条件

36、较敏感。v（4）结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。v（三）荧光试剂（三）荧光试剂 弱弱/ /无荧光物质无荧光物质+ +荧光试剂荧光试剂强荧光产物强荧光产物v1 1、荧光胺（、荧光胺（fluorescaminefluorescamine）：）：v特点特点：与脂肪族和芳香族：与脂肪族和芳香族伯胺伯胺形成高度荧光衍生物。形成高度荧光衍生物。 荧光胺及其水解产物均不显荧光。荧光胺及其水解产物均不显荧光。v荧光条件荧光条件：exex=275/390nm=275/390nm，emem=480nm=480nm。 v2 2、邻苯二甲醛（、邻苯二甲醛（OPAOPA）：）：v特点特点：在：在2-2-巯

37、基乙醇存在下，巯基乙醇存在下，pH9-10pH9-10的缓冲溶液中的缓冲溶液中能与能与伯胺伯胺类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的外的-氨基酸氨基酸生成灵敏的荧光产物。生成灵敏的荧光产物。v荧光条件荧光条件：ex=340nmex=340nm，em=455nmem=455nm。v例：测定磺胺类药物例：测定磺胺类药物v3 3、1-1-二甲氨基二甲氨基-5-5-氯化磺酰萘（氯化磺酰萘（Dansyl-ClDansyl-Cl，DANS-ClDANS-Cl，丹酰氯）：，丹酰氯）： 与与伯、仲胺伯、仲胺及及酚基酚基的生物碱反应生成荧光物质。的生物碱反应生成荧光物质。v

38、丹酰肼（丹酰肼（Dansyl-NHNH2Dansyl-NHNH2）：）： 与可的松等的与可的松等的羰基羰基缩合，产生强烈荧光。缩合，产生强烈荧光。v荧光条件荧光条件：exex=365nm=365nm，emem=500nm=500nm。含胺基药物的测定含胺基药物的测定雌激素的测定雌激素的测定v4 4、测定无机离子的荧光试剂、测定无机离子的荧光试剂v无机离子无机离子+ +有机化合物有机化合物配合物配合物直接测定荧光强度直接测定荧光强度三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素v1 1、温度温度：温度：温度荧光效率荧光效率，荧光强度，荧光强度 原因：温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几

39、率原因：温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。v2 2、溶剂溶剂： 1 1）溶剂）溶剂极性极性：极性：极性荧光波长荧光波长，荧光强度，荧光强度 原因：极性溶剂中，原因：极性溶剂中，* *跃迁能量差跃迁能量差EE小，使紫外小，使紫外吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增强。强。 2 2）溶剂）溶剂粘度粘度：粘度：粘度荧光强度荧光强度 原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃迁增加，使荧

40、光减弱。迁增加，使荧光减弱。 温度温度溶剂粘度溶剂粘度荧光强度荧光强度 v3 3、酸度酸度： 荧光物质荧光物质本身是弱酸或弱碱本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强时，溶液的酸度对其荧光强度有较大影响，因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，度有较大影响，因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度也有差异。因此荧光强度也有差异。v如苯胺：在如苯胺：在pH7-12pH7-12溶液中主要以分子形式存在，发生蓝色荧溶液中主要以分子形式存在，发生蓝色荧光；光；pH2pH13pH13的溶液中均以离子形式存在，不发射荧光。的溶液中均以离子形式存在，不发射荧光。 v4 4、荧光熄灭剂荧光熄灭剂：

41、荧光熄灭荧光熄灭：荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引：荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。起荧光强度降低的现象。荧光熄灭剂荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝：引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。v作用机制作用机制： 1 1）荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；）荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量； 2 2）荧光物质分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；）荧光物质分子与熄灭剂分

42、子作用生成了本身不发光的配位化合物； 3 3）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进体系）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进体系间跨越，激发单重态的荧光分子转变至三重态；间跨越，激发单重态的荧光分子转变至三重态； 4 4）浓度较大（超过）浓度较大（超过1g/L1g/L）时，发生自熄灭现象。）时，发生自熄灭现象。荧光熄灭法荧光熄灭法（fluorescence quenching methodfluorescence quenching method）：荧光物质在加入某种熄灭）：荧光物质在加入某种熄灭剂后，剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系

43、荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，利用这一性质测，利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量的方法。定荧光熄灭剂的含量的方法。荧光定量分析方法 一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系v溶液的荧光强度溶液的荧光强度v在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。在较浓的溶液中，荧光强度并不随度以后，就不再存在这种正比关系。在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长。因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范围。溶液浓度呈正比增长。因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范

44、围。v v荧光物质浓度过大时，常常发生猝灭现象。这样就使荧光强度反而大大荧光物质浓度过大时，常常发生猝灭现象。这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。对浓度猝灭产生的原因，最简单的解释是：低于接近饱和时的荧光强度。对浓度猝灭产生的原因，最简单的解释是：激发态分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自猝灭。激发态分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自猝灭。 v浓度过高，还可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降低荧光强度。浓度过高，还可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降低荧光强度。 条件：极稀溶液条件：极稀溶液 二、定量分析方法二、定量分析方法v1 1、校正曲线

45、法：、校正曲线法： 以荧光强度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标。以荧光强度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标。v2 2、比例法：、比例法： 在线性范围内，测定标样和试样荧光强度，对比。在线性范围内，测定标样和试样荧光强度，对比。v3 3、联立方程式法：、联立方程式法： 用于多组分混合物的荧光分析。用于多组分混合物的荧光分析。 荧光分光光度计和荧光分析新技术 一、荧光分光光度计一、荧光分光光度计v滤光片荧光计滤光片荧光计：激发滤光片激发滤光片让激发光通过；让激发光通过；发射发射滤光片滤光片常用截止滤光片，截去所有的激发光和散常用截止滤光片，截去所有的激发光和散射光，只允许试样的荧光通过，不能测定光

46、谱，射光，只允许试样的荧光通过，不能测定光谱，只用于定量分析只用于定量分析。v滤光片滤光片- -单色器荧光计单色器荧光计：将发射滤光片用光栅代替，：将发射滤光片用光栅代替，不能测定激发光谱，可不能测定激发光谱，可测定荧光光谱测定荧光光谱。v荧光分光光度计荧光分光光度计：两个滤光片都用：两个滤光片都用光栅光栅取代，可取代，可绘制绘制激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱。v1 1、荧光分光光度计的主要部件：、荧光分光光度计的主要部件： 激发光源：氙灯、高压汞灯、激光激发光源：氙灯、高压汞灯、激光 激发单色器（样品池前）：光栅或滤光片激发单色器（样品池前）：光栅或滤光片 发射单色器（样品池后）：光栅

47、或滤光片发射单色器（样品池后）：光栅或滤光片 样品池：石英样品池：石英 检测系统：光电倍增管检测系统：光电倍增管v2 2、仪器的校正、仪器的校正v（1 1）灵敏度校正：）灵敏度校正： 用被检测出的最低信号来表示，或用某一对照用被检测出的最低信号来表示，或用某一对照品的稀溶液在一定激发波长光的照射下，能发射出品的稀溶液在一定激发波长光的照射下，能发射出最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。v（2 2）波长校正：）波长校正： 用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。v（3 3）激发光谱和荧光光谱的校正）激发光谱和荧光光谱的校

48、正 二、荧光分析新技术简介二、荧光分析新技术简介v1 1、激光荧光分析、激光荧光分析 光源：光源：激光激光，单色性极好，强度更大。，单色性极好，强度更大。 优点：提高了荧光分析法的灵敏度和选择性。优点：提高了荧光分析法的灵敏度和选择性。v2 2、时间分辨荧光分析：、时间分辨荧光分析： 利用不同物质的利用不同物质的荧光寿命荧光寿命不同，在激发和检测不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，以实现分别检测的目的。之间延缓的时间不同，以实现分别检测的目的。 光源：脉冲激光。光源：脉冲激光。 应用：多用于临床检验，如乙肝病毒的检测，应用：多用于临床检验，如乙肝病毒的检测，甲状腺功能检测等。甲状腺功能检测等

49、。测定水中痕量钍的荧光时间分辨图测定水中痕量钍的荧光时间分辨图利用时间分辨荧光法消除铝、锆等的干扰利用时间分辨荧光法消除铝、锆等的干扰从图中可见，在从图中可见，在12s12s内测定荧光信号，可基本消除铝、锆的影响。内测定荧光信号，可基本消除铝、锆的影响。 v3 3、同步荧光分析、同步荧光分析（synchronous fluorometrysynchronous fluorometry） 原理原理：在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择：在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值一适宜的波长差值（通常选用（通常选用exexmaxmax与与ememmaxmax之之差），同时扫描发射波长和激发波长，得到同步荧光差），同时扫描发射波长和激发波长，得到同步荧光光谱。若光谱。若值相当于或大于斯托克斯位移，就能获值相当于或大于斯托克斯位移，就能获得尖而窄的同步荧光峰。得尖而窄的同步荧光峰。荧光物质浓度与同步荧光峰荧光物质浓度与同步荧光峰峰高呈线性关系峰高呈线性关系，可用于定量分析。可用于定量分析。 优点优点：谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。：谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。 同步光谱同步光谱v4 4、胶束增敏荧光分析、胶束增敏荧光分析 胶束溶液胶束溶液即浓度在临界浓度以上的表面活性即浓度在临界浓度以上